综述：[FeFe]氢化酶的机械基础与多尺度工程研究在好氧生物催化中的应用

《Green Carbon》：Mechanistic Basis and Multiscale Engineering of [FeFe]-Hydrogenases for Aerobic Biocatalysis

　　**Hang Luo|Qi Xiao|Mingqian Li|Ruochen Dai|Naiyue Gao|Tin Pou Lai|Liyun Zhang**
天津南开大学生命科学学院药物化学生物学国家重点实验室，中国天津300350

**摘要**
[FeFe]氢化酶是自然界中效率最高的氢生产催化剂之一，能够在温和条件下以高转化频率运行。然而，它们对氧气的极端敏感性限制了其实际应用。在这篇综述中，我们全面探讨了[FeFe]氢化酶对氧气敏感性的分子基础，重点介绍了在稀有同源物（如Clostridium beijerinckii（CbA5H）和Thermosediminibacter oceani（ToHydA）中发现的天然耐受机制的最新进展。这些酶通过动态结构适应（如柔性肽环TSC-loop）、疏水屏障和牺牲残基）可逆地转变为氧保护状态（Hinact）。我们还评估了旨在提高氧气稳定性的创新工程策略，例如合理设计气体扩散通道、域重排以及在保护性基质中封装。最后，我们讨论了新兴的计算设计、从头设计和祖先序列重建技术在构建耐氧[FeFe]氢化酶方面的潜力，以及这些技术在生物催化和生物能源中的应用。通过将机制洞察与蛋白质工程和材料科学相结合，这篇综述为开发适用于实际应用的稳健[FeFe]氢化酶提供了路线图。

**1. 引言**
氢化酶是自然界中最高效的氢转化催化剂，在常温条件下其转化频率可与铂相媲美[1]、[2]。根据活性位点的金属组成，氢化酶被分为三大类：[FeFe]氢化酶[3]、[NiFe]氢化酶[4]和仅含[Fe]的氢化酶[6]、[7]、[8]。其中，[FeFe]氢化酶表现出最高的催化速率，在最小的过电位下接近热力学平衡[9]、[10]。它们的卓越效率源于H簇的独特结构——一个双金属[2Fe]亚基与[4Fe-4S]单元共价连接（图1a）。然而，这种复杂性也带来了代价：[FeFe]氢化酶对氧气极其敏感。即使是微量的O?也会通过氧化降解迅速且不可逆地使催化中心失活[11]。这种高度脆弱性限制了它们在半人工光合装置、生物燃料电池或基于氢的治疗系统中的集成应用。

**2. [FeFe]氢化酶的结构和催化特性**
2.1. H簇的模块化结构
[FeFe]氢化酶最关键的结构特征是其活性位点——H簇。如图1a所示，H簇由一个典型的[4Fe-4S]H亚簇通过半胱氨酸硫醇桥与一个独特的双铁中心[2Fe]H共价连接[8]、[26]。[2Fe]H亚单元中的两个铁原子分别称为Fed（远端铁）和Fep（近端铁），根据它们相对于[4Fe-4S]H簇的空间位置进行命名（图1a）。它们由2-azapropane-1,3-dithiolate（ADT）配体桥接，该配体的桥头氮原子可以发生质子化。[2Fe]H中心还与三个CO分子和两个CN?离子配位。每个Fe原子（Fed和Fep）各带一个末端CO和一个末端CN?，第三个CO则作为它们之间的桥接配体。这种排列在Fed上形成了一个空闲的配位位点，对底物（H?）的结合或抑制剂的作用至关重要[16]、[27]。这个复杂的[2Fe]H亚簇的生物合成和插入由三种特定的成熟酶HydE、HydF和HydG介导[28]。电子通过FeS域（F域）传递给H簇，这些FeS域将催化核心与氧化还原伙伴（如铁氧还蛋白）连接起来。整个结构形成了一条从蛋白质表面延伸到埋藏催化中心的氧化还原灵活的通道。这种整合确保了电子的快速流动，但如果电子传递与质子转移脱钩，也会使簇容易受到氧化应激[8]、[29]。

2.2. [FeFe]氢化酶的分类**
[FeFe]氢化酶的分类主要基于综合的进化和生化分析，其保守域的结构特征和辅因子排列是关键区分特征（图1）[28]、[30]、[31]、[32]。根据当前的结构和功能认识，已明确分类的类型包括A组、B组（祖先型）和C组（感应型），每组都具有与其生理功能相关的独特域结构和催化特性。
A组代表了研究最深入的[FeFe]氢化酶类别，包括原型酶和功能特化的酶。该组进一步根据域组成和辅因子含量分为M1-M5型（图1b）。这些酶共享一个包含催化[2Fe]H簇的保守核心H域，以及含有额外铁硫簇的可变辅助F域，这些辅助F域参与电子转移。M1型酶（如Chlamydomonas reinhardtii的CrHydA1）是紧凑的单体氢化酶，仅由H域组成（图1b）[11]。它们使用铁氧还蛋白作为主要氧化还原伙伴来催化H?的产生，代表了[FeFe]氢化酶的最小功能单元。M2型酶（如Desulfovibrio desulfuricans的DdHydAB）通过包含两个[4Fe-4S]簇的F域扩展了核心结构（图1b）[33]。F域类似于细菌的M2型[4Fe-4S]铁氧还蛋白，通过将H域与远端氧化还原伙伴桥接来提高电子转移效率。M3型酶（如Clostridium pasteurianum的CpHydA1）的F域包含一个额外的His连接的[4Fe-4S]簇和一个暴露在表面的[2Fe-2S]簇（图1b）[8]。这些额外的簇可能扩展了它们的氧化还原连通性，使其能够在代谢网络中与多个电子载体相互作用。M4型[FeFe]氢化酶含有五个FeS簇，这些FeS簇与硫氧还蛋白（TRX）域的C末端簇结合，而M5型[FeFe]氢化酶则具有额外的NADH:泛醌氧化还原酶链F（NuoF）域[30]、[32]。除了这些原型亚类，A组还包括专门的酶：三聚体的A3型氢化酶，它们催化可逆的电子分叉（将H?氧化与NAD+和铁氧还蛋白还原耦合）[34]；以及与甲酸脱氢酶相连的丝状A4型复合体，介导H?依赖的CO?到甲酸的转化[35]。总体而言，A组酶由一个保守的活性位点基序（TSCCP）和多样化的域扩展定义，这些扩展使其功能适应特定的代谢环境。
B组被称为“祖先型”氢化酶，其结构和序列特征表明它们较早从A组分化出来。例如Clostridium pasteurianum的CpIII[28]、[36]和Thermosediminibacter oceani的ToHydA（M2a型）[21]保留了核心H域，但在活性位点结构上有所不同（图1b）。B组的一个特点是保守的A组TSCCP基序被一个独特的TSCCCP基序取代，这是由于在质子转移半胱氨酸附近多了一个半胱氨酸残基。这种质子转移（PT）途径的变化可能会影响催化效率或底物特异性，反映了它们对祖先环境或极端环境的适应。
C组氢化酶的特点是一个独特的C末端[4Fe-4S]簇，通过Cx2Cx4Cx16C基序进行协调，这与A组和B组的典型半胱氨酸连接模式不同[37]、[38]。例如Thermotoga maritima的HydS（M2f型），其结构（AlphaFold模型，图1b）显示了一个C末端PAS（Per-Arnt-Sim）感应域，这是其他组所没有的特征[37]、[38]。这个域可能具有潜在的调节作用，例如感知环境信号（如O?、氧化还原状态）以调节氢化酶活性，将催化作用与适应性生理反应联系起来。

在A-C组中，H域仍然是结构和功能的核心，包含[2Fe]H簇和保守的质子转移途径（图1a）。F域（A组）、活性位点基序（B组）和调节域（C组）的变化反映了它们对不同代谢和环境需求的进化适应。这些结构差异直接影响催化特性，包括电子转移速率、底物特异性和调节敏感性。不同类型[FeFe]氢化酶的催化活性在表1中进行了比较和总结。

**表1. 氢化酶催化的H?生产和吸收的酶学测定**
| 酶 | 来源 | 依赖MV的H?产生速率（/s?1） | 依赖MV的H?吸收速率（/s?1） | 参考文献 |
|---------------|------------|------------------|------------------|----------------|
| DdHydAB | 来自Desulfovibrio desulfuricans, A组（M2型） | 7500 | 63,000 | [33] |
| CrHydA1 | 来自Chlamydomonas reinhardtii, A组（M1型） | 582 | 500 | [26]、[39] |
| CpHydA1 | 来自Clostridium pasteurianum, A组（M3型） | 2200– | [26] | |
| CaHydA1 | 来自Clostridium acetobutylicum, A组（M3型） | 164 | 127 | [40] |
| CbA5H | 来自Clostridium beijerinckii, A组（M2型） | 437 | 520 | [20]、[41] |
| ToHydA | 来自Thermosediminibacter oceani, B组（M2a型） | 77.9– | [21] | |
| TmHydS | 来自Thermotoga maritima, C组 | 158 | [38] | |
| CpII | 来自Clostridium pasteurianum, B组 | 58.3– | [28] | |终端氢化物状态Hhyd是通过分子内的质子转移形成的，质子从质子化的氮杂二硫醇盐（ADT，NH2+）桥转移到Fed原子上。这一步产生了一个同价的Fep(II)Fed(II)双核中心，同时产生一个还原的[4Fe-4S]H簇（1+），HsredH+和Hhyd都是顺磁性的并且具有电子顺磁共振（EPR）活性[13]，[51]，[52]。催化循环的完成是通过Hox的再生来实现的，这通过最后的PCET步骤促进从桥接胺中生成H2。除了这个核心循环之外，还发现了其他途径和调节机制。值得注意的是，蓝光照射可以诱导CrHydA1中的HredH+和HsredH+发生可逆的异构化，形成含有氢化物的状态Hhyd:ox和Hhyd:red[47]。催化循环及其相关状态的全面总结见图2。这些中间体共同定义了一个机制路径，在这个路径中，电子转移、质子传递、配体重排和金属-氢化物化学反应共同作用，以实现高效率的H2转化。[FeFe]-氢化酶的催化效率不仅取决于这些中间体的电子动力学，还取决于H簇处气体底物的精确摄取和释放。因此，全面理解气体扩散途径的架构、动态和选择性对于建立完整的机制图谱至关重要。

2.4. 气体扩散通道的分析
尽管H簇深埋在蛋白质表面之下（约10埃），[FeFe]-氢化酶仍然通过一个复杂的内部疏水通道网络保持小气体配体的快速交换。晶体学、氙气加压实验和广泛的分子动力学（MD）模拟得出了一个模型，该模型包含多个部分重叠的通道，通常被称为通道A、B和W。这些通道共同定义了酶的气体传输景观（图3）[11]，[19]，[53]，[54]，[55]，[56]，[57]。

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图3. (a) 基于CpHydA1 [FeFe]-氢化酶（PDB: 4XDC）结构的气体通道分析。CpHydA1 [FeFe]-氢化酶中的气体通道A和B的概览，以及质子和电子转移途径，(b) 在CpHydA1 [FeFe]-氢化酶中进行的温度控制局部增强采样（TLES）模拟O2扩散，经许可改编自[55]。版权所有 ? 2005 Elsevier Ltd. (c) 使用CAVER计算的CpHydA1 [FeFe]-氢化酶的“静态”疏水和水填充通道，以及由定义其路径的氨基酸（棒状）标示的“动态”通道，经许可改编自[53]，版权所有 ? 2011，Faraday Division，Royal Society of Chemistry. (d) 使用MolAxis分析的CpHydA1 [FeFe]-氢化酶X射线结构，显示通道A（红色）、B（青色）、C（冰蓝色）和W（紫色），经许可改编自[54]，版权所有 ? 2012，American Chemical Society. (e) 将MD模拟的气体分子位置（透明球体）映射到CpHydA1氢化酶结构上（白色），经许可改编自[19]，版权所有 ? 2016，Springer Nature Limited. (f) 疏水气体通道A和B，以及CpHydA1 [FeFe]-氢化酶的亲水通道，经许可改编自[56]。版权所有 ? 2023，John Wiley and Sons。
如图3a所示，这些[FeFe]-氢化酶中的气体通道具有多路径和动态适应的架构。初步的结构分析确定通道A是一个主要由非极性残基（如Val、Leu和Phe）组成的疏水通道。氙气结合实验表明，这个通道是一个连续的、延长的腔体，与其作为H2、CO和O2等非极性分子的低阻力通道的功能一致。然而，随后的MD模拟表明，单一的静态通道不足以解释实验测量的配体扩散速率。相反，[FeFe]-氢化酶似乎通过多通道系统运作：通道A（“静态”）作为持续的扩散主干，而通道B（“动态”）通过侧链重排暂时出现，形成短暂存在的腔体，在模拟研究中这些腔体被O2显著占据[11]，[19]，[53]，[54]，[55]，[56]，[57]。通道W是一个保守的、部分水化的通道，尽管具有亲水性，但仍能稳定并促进小疏水气体的传输，这一特性在氮化酶和过氧化氢酶中也观察到[56]。这种冗余和灵活的通道网络解释了为什么试图阻断单一通道很少能完全消除气体传输。实际上，针对通道A中关键残基的突变（例如A426L、F492A）只对O2的结合/解离动力学或H2的氧化速率有轻微影响[53]。当一个通道受到干扰时，其他动态途径会进行补偿，突显了系统的韧性。通过综合计算研究进一步阐明了O2传输的机制（图3b）。长时间尺度的MD模拟结合马尔可夫状态模型，绘制了Clostridium pasteurianum氢化酶（CpHydA1）中的O2迁移路径，揭示了通道A仍然是主要的扩散途径，尽管其可访问性受到动态瓶颈的调节[19]。这些瓶颈由Cys299、Pro324和Phe417等残基形成，表现出物种依赖的灵活性，这与O2的敏感性差异相关，例如在CpHydA1中观察到的动态瓶颈半径比在D. desulfuricans中小[19]。
密度泛函理论分析得出了一个一致的机制图谱（图3d）：O2优先结合到H??状态下[2Fe]H亚簇的远端Fe上，随后发生可逆的四电子/四质子还原为水。不可逆的失活发生在部分还原的O2中间体生成活性氧物种（例如OH•）或导致Cys299（一个关键的质子转移残基）羟基化时[54]。因此，抑制过程包括三个连续的步骤：(1) 通过动态控制的通道扩散；(2) 在Fed处的可逆结合和氧化还原化学反应；(3) 由活性中间体引起的不可逆化学损伤。这一综合观点解决了关于静态与动态途径相对贡献的长期不确定性，并为设计耐O2的变体提供了预测框架。

3. O2失活机制
许多需氧气体处理金属酶，包括氢化酶，已经进化为在古代大气条件下进行能量代谢[58]。其中，[FeFe]-氢化酶对O2非常敏感[59]，[60]，[61]，[62]。与其他小分子抑制剂不同，O2介导的失活是复杂的并且只是部分可逆的[59]。蛋白质膜电化学（PFE）对于量化O2失活动力学至关重要，因为可以在酶直接与电极交换电子的同时监测催化电流[63]，[64]，[65]，[66]，[67]。[FeFe]-氢化酶在热解石墨电极上的吸附实现了直接电子转移，并揭示了在短暂或持续O2暴露下电流的快速、浓度依赖性的损失（表2）[19]，[59]，[62]，[68]，[69]。随着H2浓度的增加，失活速率降低，表明H2和O2在同一开放配位位点上具有竞争性结合[62]。不同[FeFe]-氢化酶对O2的敏感性因结构差异而异[19]，[61]，[62]，O2抑制速率的顺序为DdHydAB > CrHydA1 > CaHydA1[59]，[62]。Caserta等人报告说，缺乏辅助[4Fe-4S]簇的截短变体MeH-HydA保持了类似的O2抗性，但活性降低且催化偏向改变，表明H簇控制O2抗性，而F域影响催化方向[69]，[70]。系统性地截短CaHydA1 [FeFe]-氢化酶支持这一发现，表明F簇不直接参与初始的O2防御机制，但确实有助于O2抑制的可逆性[40]。
表2. [FeFe]-氢化酶与O2反应的动力学参数。
酶 ki (s^-1) ka (s^-1) kd (s^-1) kikd/(ki + kd) (s^-1 mM^-1)
CaHydA1 1.1 ± 0.2 0.04 ± 0.02 0.003 ± 0.00 0.077 [59]
CrHydA1 2.5 ± 0.5 0.04 ± 0.01 0.024 ± 0.00 1.020 [59]
CrHydA1T2 2.8 ± 0.2 0.03 ± 0.01 0.015 ± 0.00 1.050 [59]
DdHydAB 40.0 ± 8.0 0.15 ± 0.05 n/d n/d [72]
A. woodii HydA 6.5 0.01 0.00 2.5 0.00 [73]
MeHydA 0.3 ± 0.1 0.05 ± 0.02 0.015 ± 0.00 0.075 [59]
MeH-HydA 0.1 n/an/a 0.08 0 [69]
n/a: 不适用；n/d: 未确定。
部分可逆的抑制遵循两步反应（方程式1）[19]，[59]，[69]。活性的[FeFe]-氢化酶（A）通过厌氧氧化（速率常数ki和ka）可逆地形成无活性的O2加合物（I），但O2加合物也可以转化为死路物种（D）（速率常数kd）[19]，[59]。这一过程可能涉及O2的还原。重新激活对应于O2完全还原为H2O作为解毒过程，而降解则始于由部分还原的O2生成的活性氧物种（ROS）的攻击[19]，[71]。详细机制将在后面讨论。

(1) A?kakiI?kdD
在到达埋藏的H簇之前，O2通过类似于[NiFe]-氢化酶中的分子内气体通道[19]，[55]，[74]的通道导航，并通过CAVER分析、MD模拟和晶体结构分析[75]，[76]进行了识别。在CpHydA1 [FeFe]-氢化酶中表征了两个疏水气体通道，分别称为通道A和B（图3b）[55]。通道A包括在CpHydA1（PDB: 1FEH）[8]和DdHydAB（PDB: 1HFE）[7]的静态晶体结构中可见的疏水腔体。MD模拟确认了通道A的功能，并在CpHydA1中发现了另一个动态通道B[19]，[75]。尽管气体通道主要是疏水的，但极性本身并不严格决定气体选择性。例如，CO是一种极性分子且是已知的抑制剂，它使用与O2相同的扩散途径[72]，[77]。最近的研究进一步表明，一些亲水通道也可以促进O2的扩散[56]。
一旦O2到达活性位点，它直接结合到Fed的开放配位位点，该位点在催化过程中通常由氢化物占据[1]，[78]。在[NiFe]-氢化酶中，O2介导的抑制是通过形成桥接氧化物物种Ni-A（“未准备状态”）和Ni-B（“准备状态”）来实现的，这两种状态都可以重新激活为Ni-C[1]。相比之下，[FeFe]-氢化酶经历H簇的不可逆降解[79]。O2与Fed的结合产生Fed-O?加合物[59]，[68]，该加合物迅速从[2Fe]H亚簇接受电子形成超氧物种（Fed-O??）[80]。随后的化学反应分为针对[2Fe]H单元或[4Fe-4S]H簇的ROS介导的降解途径[62]，[79]，[81]。Esselborn等人提供了一个基于O2处理后的holo-CpHydA1（23小时暴露，图4）[78]中的电子密度变化的统一机制方案[78]。在形成Fed-O??后，质子化产生一个过氧化氢中间体（Fed-OOH?），由此路径分叉[78]，[82]。在路径1中，Fed-OOH?分解为H?O?，然后扩散并氧化降解[4Fe-4S]H簇为[3Fe-4S]或[2Fe-2S]片段[78]。[2Fe]H单元保持完整，这与它相对于[4Fe-4S]H的更高稳定性一致[62]。在路径2中，Fed-OOH? disproportionate为水和铁氧物种（Fed(IV)=O2?）[78]。这种高氧化性的中间体攻击双原子配体（CO、CN?），导致Fed的选择性损失，而[4Fe-4S]H和Fep保持完整[78]。Fed-OOH?和Fed(IV)=O2?都是计算研究支持的理论中间体[82]，[83]。重要的是，apo-CpHydA1在O2暴露后没有降解，证实ROS来源于结合到[2Fe]H亚簇的O2[78]。此外，H簇周围的氨基酸在O2暴露后也会被氧化[74]，[79]。例如，Cys169的侧链是CrHydA1中ADT基团附近质子转移途径的一部分，它被氧化为亚磺酸，从而加速了H簇的降解[19]，[79]。

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图4. [FeFe]-氢化酶CpHydA1（全体和无辅基形式）与氧反应途径的推测[78]。氧与[2Fe]H簇中Fed的结合用红色标记。灰色表示[2Fe]H和/或[4Fe-4S]H簇的降解，说明了全体CpHydA1通过有氧氧化不可逆失活的两条途径。
版权所有 ? 2019，American Chemical Society。

4. [FeFe]-氢化酶中自然进化出的氧耐受机制：来自DdHydAB、CbA5H和ToHydA的教训
尽管[FeFe]-氢化酶通常被认为是被分子氧（O2）不可逆失活的，但自然界中有一小部分酶进化出了复杂的机制来耐受短暂的甚至长期的O2暴露[84]。例如来自Desulfovibrio desulfuricans的DdHydAB、来自Clostridium beijerinckii的CbHydA1和来自Thermosediminibacter oceani的ToHydA代表了三种不同的自然O2耐受范例。这些酶都可以在氧化应激下进入一个受保护的非活性状态，从而防止催化H簇的氧化降解（图5）。然而，这些酶背后的分子机制在O2耐受性方面存在显著差异，反映了针对共同环境威胁的不同进化解决方案。Rodríguez-Maciá等人的研究证实，这种状态的形成并非简单的过度氧化失活，而是依赖于在氧化条件下涉及硫化物配位的过程，随后发生电子重组。在高氧化电位（≥ +55 mV vs SHE）条件下，H?S通过一个疏水气体通道进入活性位点，并与H簇的远端铁原子（Fed）结合。随后，H簇中的ADT桥氮原子作为内源性碱，使配位的H?S脱质子化，形成热力学上有利的Fed-SH?中间体（ΔG ≈ -4.9 kcal mol?1）。这种配体的形成诱导了[2Fe]H亚簇向[4Fe-4S]H簇的单电子转移，生成一个可逆的Htrans中间体，其构型为[4Fe]H+-[Fe(II)Fe(II)]H。之后，[4Fe-4S]H簇被氧化到+2状态，将整个H簇锁定在Fe(II)Fe(II)构型（[4Fe]H2+-[Fe(II)Fe(II)]H），SH?配体稳定地结合在Fed上，形成Hinact或Hox-air状态。在该状态下，晶体结构中硫配体的电子密度明显（分辨率为1.65 ?），硫的存在通过异常散射、X射线吸收光谱、核共振振动光谱（NRVS）和32S/3?S同位素替代实验得到共同确认；Fe–S键长为2.4 ?。在NRVS光谱中，约350 cm?1处的振动峰被归因于Fed-SH伸缩模式，进一步支持了硫配体的结构模型[16]。这种状态具有独特的光谱和电化学特性：Hinact状态对电子顺磁共振（EPR）沉默（S=0），而其前体Htrans状态则表现出特征性的菱形S = 1/2 EPR信号（g = 2.06, 1.96, 1.89），源自[4Fe-4S]H?[50]。在傅里叶变换红外光谱（FTIR）中，Fed-SH?配体的配位减弱了Fe-CO的反键作用，导致μCO吸收带从Hox状态下的1802 cm?1显著移动到Hinact状态下的1847 cm?1；Htrans状态下的μCO带降至1835 cm?1，末端CO表现为1988/1976 cm?1的双峰；νCN带移至2100/2075 cm?1，表明[4Fe-4S]H的还原对[2Fe]H配体场有短暂影响（图6a）[43]，[89]。在Na?S存在下，DdHydAB在-70 mV（pH 7.0）附近发生可逆的氧化还原转变，形成Hox-air状态（图6d）。

**提示：**
- 本文引用了多篇学术论文的内容，因此在翻译时需要保持原文的学术性和专业性。
- 对于复杂的化学术语和公式，采用了标准的化学符号和解释。
- 对于图表和图像，提供了下载链接以便读者直接获取高分辨率或全尺寸版本。
- 文中包含的化学结构和实验数据通过特定的参考文献进行了标注。

**额外说明：**
- 由于技术限制，某些专业的科学术语可能无法在文本中直接呈现，因此采用了简化的描述或注释。
- 对于研究方法的介绍，提供了详细的步骤和背景信息，以便读者理解其科学原理。通过晶体学和计算分析[5]、[7]、[11]、[53]、[54]、[56]，首次识别出两个主要的疏水性气体通道（通道A和通道B）。这些非极性通道促进了H?的快速扩散，同时也允许O?进入，使其能够在远端铁原子（Fed）处发挥作用，触发CO/CN?配体的解离，并最终降解H簇[11]。与此同时，富含极性残基的亲水性通道通过分子动力学模拟被证明可以介导水运输和支持质子转移，但它们也作为替代的O?进入途径，在质子转移网络附近汇聚；这些通道的阻塞不可避免地会干扰质子流动和催化转化率[56]。表3总结了生物工程策略。

**策略类别** | **突变位点/设计** | **氢化酶** | **折中百分比（%）** | **参考文献**
|------------|------------------|-----------------|------------------|-----------|
| 气体通道工程 | N196D/I197V/N160D/A280V | CpHydA162[96] | F290Y | CrHydA180[19] | C169D | CrHydA156[19] | A426L | CaHydA142[53] |
| 亲水性/水通道工程 | G302S | CpHydA184[56] | S357T | CpHydA190[56] |
| 质子转移途径突变 | I208F | ToHydA35[21] | C298D | CaHydA153[98] |
| 表面残基工程 | M387L | CpHydA120[100] | M382E |CbA5H50-60[92] |
| 基因嵌合/结构域重组 | Fd-HydA融合 | CrHydA1100[101] | CaHydA/CbA5H-ΔSLBB | CaHydA1/CbA5H25[102] |

**注：**活性以野生型H?产生活性的百分比表示（设为100%）。

在[FeFe]-氢化酶中发现了两个气体扩散通道（气体通道A和气体通道B）[54]、[55]，如图3a所示。然而，通过向这些通道引入具有较大侧链的氨基酸进行的几项理性设计并未成功提高酶的耐氧性[53]、[75]、[95]。Bingham等人的研究表明，通过随机突变和饱和突变技术，N196D/I197V/N160D/A280V组合突变体表现出显著提高的耐氧性[96]。具体来说，在1% O?环境中暴露5分钟后，突变体保留了62%的活性，而野生型酶仅保留了23%。A280氨基酸位于预测的气体通道中，而I197和N160氨基酸都位于第一个辅助[4Fe-4S]簇的6.5 ?范围内。Kubas等人报告称，CrHydA1中的V296F和F290Y突变体会显著影响[FeFe]-氢化酶与CO和O2的反应速率，通过减缓氧气向活性位点的扩散速度[19]。2017年，Vashisth的研究进一步表明，CpHydA1中的A321和V423位点位于氧气扩散网络的关键节点，这些位点的单点突变可以影响多条氧气途径[57]。

亲水性通道工程也取得了显著的改进。Brock等人揭示了CpHydA1中围绕H簇的水通道，并表明G302S和S357T突变建立了紧密的氢键网络，部分阻断了氧气从[4Fe-4S]H到[2Fe]H亚簇的迁移，从而提高了好氧稳定性[56]。Ghosh等人基于分子动力学的额外研究强调了围绕质子转移半胱氨酸的疏水簇的重要性。将I208突变为苯丙氨酸破坏了这个簇，并显著降低了耐氧性，表明维持质子转移环周围的刚柔平衡对耐氧性至关重要[21]。最近的研究还表明，修改质子转移残基（例如，沿PT途径的半胱氨酸/丝氨酸替换）可以改变保护性Hinact状态形成的动力学[97]、[98]。

暴露在表面的残基构成了另一个调节耐氧性的层次[92]、[99]、[100]。Koo等人通过用亮氨酸替换CpHydA1表面的甲硫氨酸残基，显著提高了其耐氧性[100]。Rutz等人报告称，尽管M382E突变距离H簇有18 ?，但它增加了A环（靠近TSC环）的灵活性，促进了快速进入保护性Hinact状态（图7a）[92]。这些发现表明，远端氨基酸可以对活性位点的保护和构象门控施加远程控制。

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**图7.** 提高[FeFe]-氢化酶耐氧性的工程策略。(a) 通过突变CpHydA1的气体通道和亲水区域来提高耐氧性的策略（PDB: 4XDC）。(b) 通过突变CbA5H的表面氨基酸来提高耐氧性的策略（PDB: 9F47）。(c) 通过构建嵌合体来提高耐氧性的策略。(d) 具有耐氧保护特性的氧化还原聚合物材料。(e) 经Viologen改性的水凝胶材料。(f) 用于提高[FeFe]-氢化酶耐氧性的Peptide hydrogel FomcFF材料。

嵌合体工程代表了一种新兴且非常有前景的策略。将铁氧还蛋白与CrHydA1融合（Fd-HydA嵌合体）提高了电子转移效率，并在氧化条件下实现了比WT HydA高约4.5倍的体内H?产量[101]。最近，Valetti等人成功构建了几个嵌合体，包括CaHydA1/CbA5H-ΔSLBB，通过将CbA5H的H结构域（缺少SLBB结构域）与CaHydA1的辅助结构域结合。尽管这些嵌合体没有完全达到CbA5H的稳定性，但在空气暴露后仍保留了显著的活性，证明了结构域重组在工程耐氧性方面的实用性[102]。总体而言，这些研究表明，调节耐氧性需要跨三个结构层次的干预——气体扩散通道、质子/水网络以及表面/环动态，新兴的嵌合体设计为模块化设计耐氧性生物催化剂提供了第四个维度。

**5.2. 使用具有耐氧保护特性的水凝胶材料**
与内在工程化氢化酶支架相比，外在保护策略通过构建物理或氧化还原化学上保护酶免受氧化损伤的保护性微环境来提高O?耐受性[103]、[104]、[105]。水凝胶因其易于合成[106]、优异的生物相容性[107]以及适合设备集成的可扩展性[108]而特别吸引人。Plumere等人开发了基于低电位的viologen的PV2水凝胶（图7d），其中嵌入了[FeFe]-氢化酶DdHydAB并实现了电子耦合；通过调节pH值和聚合物电位，即使在氧气存在下，水凝胶也能维持酶的催化转化率[109]。基于这一概念，Oughli等人证明，在同一水凝胶架构中可以重新激活硫化物保护的DdHydAB，实现好氧催化操作[86]。Szczesny等人开发了一种基于氧化还原聚合物的高电流密度气体扩散电极，用于DdHydAB [FeFe]-氢化酶的H?氧化反应。这种电极设计将[FeFe]-氢化酶封装在定制的氧化还原水凝胶中，特别是viologen功能化的共聚物（poly(3-azidopropyl methacrylate-co-butyl acrylate-co-glycidyl methacrylate)-viologen）(P(N3MA-BA-GMA)-vio）（图7e）。这种保护性基质在好氧条件下维持了酶的催化功能，从而实现了提供大量电流和功率密度的生物燃料电池[25]。

除了基于氧化还原的保护外，超分子水凝胶还可以通过结构封装实现选择性的氧气限制。Ben-Zvi等人使用了FmocFF肽水凝胶（图7f），其疏水性芳香口袋可以结合O?并减缓其扩散，从而保护CrHydA1。分子动力学模拟显示，在基质内O?与芳香基团有优先的相互作用，实验结果表明，封装后的氢化酶在空气暴露20分钟后仍保留了68.1%的活性，而未受保护的酶几乎完全失活[110]。这些水凝胶系统展示了基于材料的微环境如何减轻氧化失活，同时保持高催化性能，为额外的混合或多功能保护策略奠定了基础。

除了基于材料的封装外，几种其他外部保护策略也显示出在提高[FeFe]-氢化酶耐氧性方面的显著效果。值得注意的是，冻干作为一种意想不到的强大方法已经出现。Noth等人报告称，通过冷冻干燥去除大量水分显著提高了酶对氧气的稳定性[111]。冻干后，[FeFe]-氢化酶保持了完整的H簇结构，并在纯O?中保持了整体结构完整性。值得注意的是，重新水化后，酶完全恢复了其催化活性。这种保护效果可能归因于消除了通常促进O?进入或参与有害反应途径的水分子，从而中断了导致氧化降解的化学事件序列[111]。

结合水凝胶封装、氧化还原聚合物基质、超分子肽水凝胶和其他基于材料的屏蔽策略，冻干强调了更广泛的设计原则：工程化酶的微环境与修改蛋白质本身同样重要。这些外在策略共同为在好氧条件下使用[FeFe]-氢化酶提供了坚实的基础，为将这些高活性但对氧气敏感的催化剂整合到生物技术和能源转换系统中提供了实际指导。

**6. [FeFe]-氢化酶的未来前景和生物技术应用**
**6.1. 计算前沿：计算设计和预测生物学的作用**
尽管在理解和工程化[FeFe]-氢化酶方面取得了显著进展，但在它们广泛应用于生物技术之前仍面临许多挑战。未来的研究将越来越依赖于跨学科的整合，特别是计算科学、进化生物学和材料科学的深度融合。该领域正处于从试错“修补”模型向定量预测“设计”模型的范式转变的边缘。机器学习（ML）在酶工程中的整合代表了从传统理性设计方法的范式转变，使研究人员能够以前所未有的效率探索庞大的序列-功能景观[112]、[113]、[114]、[115]、[116]。通过利用大规模生物数据，ML算法可以解码蛋白质序列、结构和功能之间的复杂关系，这些关系往往超出传统生物物理模型的能力。几种ML方法最近作为强大的工具出现，用于酶工程，展示了在多种蛋白质系统中的强大预测能力。监督学习模型，包括图神经网络（GNNs）[117]、[118]、[119]、[120]和基于Transformer的架构（如UniKP）[122]、[123]，在从大型蛋白质数据集中提取序列-功能关系方面取得了相当大的成功[122]。同时，CataPro混合框架将GNNs与卷积神经网络结合起来，用于编码蛋白质序列特征，实现了对催化参数（如kcat和K?）以及突变对酶活性和底物特异性的定量预测[123]。这些研究确立了ML指导的酶性能预测的可行性，包括稳定性、活性和对非天然环境的耐受性[124]。除了通用酶特性外，最近的研究开始解决金属蛋白特有的挑战。值得注意的是，Song等人开发了Metal-Installer，这是一个ML辅助框架，能够识别和安装不同蛋白质支架上的金属结合位点，突显了数据驱动方法在金属蛋白设计中的潜力[125]。然而，准确预测Fe-S簇的几何结构、氧化还原耦合动态和电子结构——特别是对于复杂的辅因子如H簇——仍然是该领域的主要未解决问题。因此，ML辅助的[FeFe]-氢化酶设计，特别是提高O?耐受性，仍处于起步阶段，目前尚未有经过实验验证的案例研究[126]、[127]、[128]。尽管如此，相关酶类的进展表明了明确的前景。原则上，ML模型可以在基于MD模拟的数据集上进行训练，这些数据集映射了O?通过定义的气体通道（如通道A、B和W；图3b,e）的扩散轨迹，从而预测特定突变如何重塑通道动态并调节O?流量，而不仅仅是静态结构描述符。同时，监督学习方法可以应用于保护性环基序（如CbA5H中的TSC环和ToHydA中的TSCCCP基序）内的序列-稳定性关系，使用实验表征的变体来识别有利于快速、可逆Hinact形成的突变，同时保持催化效率。总的来说，这些考虑将ML定位为一个假设生成和设计指导的框架，当与光谱验证和迭代实验相结合时，最终可能实现耐氧[FeFe]-氢化酶的理性工程。

尽管在计算蛋白质设计方面取得了显著进展，但从头设计酶仍然是一个巨大的挑战。复杂性在于活性位点残基需要精确且动态地定位在键断裂和键形成反应中。Baker研究小组首次展示了通过AI引导的头设计出高功能酶的可能性[129]。RFdiffusion被用来设计包含活性位点几何结构的骨架，随后使用LigandMPNN进行序列优化。从头设计的丝氨酸水解酶显示出高达2.2 × 105 M?1 s?1的催化效率提升，设计模型已通过晶体结构得到验证[130]。同年晚些时候，他们使用RFdiffusion2成功从头设计了高活性的金属水解酶[130]。Zhang等人最近通过整合RFdiffusion、ProteinMPNN和AlphaFold从头设计了一种针对关键气体通道的蛋白质结合剂，以提高[NiFe]-氢化酶的耐氧性[131]。这种蛋白质结合剂与NiFe-hydrogenase紧密结合，使酶的耐氧性提高了三倍以上。从头设计[FeFe]氢化酶的独特挑战在于设计一个不仅能够正确折叠，还能容纳复杂的生物合成和H簇插入的蛋白质支架，该H簇连接到一个带有独特CO/CN?配体的双铁亚位点（图1a）。这可以通过使用RFdiffusion等工具来解决，设计一个具有预定义腔体的稳定蛋白质框架，该腔体与H簇的几何结构相匹配，然后通过计算筛选确保与H簇的兼容性。通过构建新型酶变体或开发阻断其关键气体通道的蛋白质结合剂，从头设计耐氧[FeFe]-氢化酶是一种有前景的策略，可以同时提高催化效率和O?稳定性。

祖先序列重建（ASR）作为一种变革性策略，用于工程化具有增强稳定性和功能的酶[132]。与修改现有现代支架的传统方法不同，ASR从深层次的进化节点中复活了已灭绝的祖先序列，利用古代环境压力筛选出的功能多样性[133]。这种由进化引导的方法利用现存蛋白质同源物之间的系统发育关系，通过统计推断出具有最大进化可能性的祖先序列[134]。ASR通常需要评估不到十个精心挑选的候选者，而定向进化则需要构建大型文库并筛选超过10^3到10^6个样本[135]。这些选定的酶随后成为进一步理性工程或定向进化项目的理想起始模板[136],[137],[138],[139],[140]。最近关于ASR的研究表明，祖先酶在热稳定性以及其他物理性质（如提高的pH耐受性和表达产量）方面表现出显著的增强[141],[142],[143]。除了提高稳定性外，ASR还被证明可以提高酶活性[144],[145]，扩大底物范围[137],[146]，促进工程化立体选择性催化剂的发展[137]，并阐明催化机制[147],[148],[149]。这些原理的应用在B组祖先[FeFe]-氢化酶的背景下尤其具有吸引力，因为它们代表了[FeFe]-氢化酶最早的进化分支，早于A、C、D和E组[21],[28],[36],[150]。一个代表性的酶是ToHydA，这是一种耐热的B组（M2a）氢化酶，它表现出显著的氧气稳定性[21]。ToHydA中的TSCCCP基序中的额外半胱氨酸残基增强了基序的灵活性，并有助于形成Hinact状态。ASR的关键目标包括改造保守的TSCCCP环及其相关的疏水簇，以提高氧气耐受性并调节氧气扩散路径。曾经认为仅限于细菌和真核生物的祖先[FeFe]-氢化酶，现在通过基因组和生化证据在九个古菌门中被发现[31]。将这些原理应用于新发现的古菌同源物，开辟了一个几乎未被探索的领域。重建这些古老的祖先可能产生具有前所未有的稳定性的生物催化剂，包括热稳定性、酸稳定性和潜在的前所未有的内在O?耐受性，为未来的工程和工业及可再生能源应用提供了理想的模板。重建A组（例如CbA5H）和B组（例如ToHydA）氢化酶分化时的祖先节点，可能会揭示出早于现代酶中高氧气敏感性相关结构特化的最小化、稳定的H结构域支架。我们将上述结论转化为一个具体的路线图，概述了未来十年的关键里程碑（图8），从而为开发耐氧[FeFe]-氢化酶提供了一个具有前瞻性且现实的框架。

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图8. 未来十年耐氧[FeFe]-氢化酶工程的路线图。

在工程化耐氧[FeFe]-氢化酶方面，一个关键挑战不是缺乏单独的保护策略，而是如何以合理和协同的方式结合它们。我们提出了一个分层的、多尺度的工程框架，其中内在的蛋白质级优化先于外在的系统级保护。在分子尺度上，可以使用计算方法——包括机器学习辅助设计、从头蛋白质生成（例如RFdiffusion、ProteinMPNN）和ASR——来构建具有优化的气体通道结构、增强的Hinact可逆性和最小催化惩罚的稳健氢化酶支架。这种内在优化的酶随后成为更高层次保护策略的基础。在中观尺度上，外在方法如氧化还原活性聚合物、肽水凝胶或分隔矩阵提供了二次扩散屏障，可以减少氧气流入并缓冲氧化还原波动。重要的是，当这些外部矩阵应用于已经具有中等内在氧气抵抗力的酶时，它们最为有效，从而实现真正的协同作用，而不仅仅是简单的冗余。这种从内到外的设计逻辑将重点从创造“更好的酶”转变为工程化“更好的催化系统”。

6.2. 在生物能源和生物催化中的应用

随着氧气耐受性障碍的缓解，[FeFe]-氢化酶在多个领域的潜在应用正在浮现。[FeFe]-氢化酶在生物燃料电池应用中显示出显著的潜力，特别是作为高效氢氧化的生物阳极[25],[109],[151],[152]。Schuhmann的团队报告了一个解决氧气敏感性关键挑战的系统：氧化还原聚合物矩阵有效地保护了对O2敏感的DdHydAB [FeFe]-氢化酶，使其能够在5%的O2浓度下工作，并提供基准电流（14 mA cm?2）和功率密度（5.4 mW cm?2，在0.7 V下）[25]。最近的研究还强调了将耐O2的CbA5H [FeFe]-氢化酶转化为高效H?氧化催化剂的可能性，突显了其在生物燃料电池中的潜力[152]。未来的研究可以探索更耐O2的ToHydA [FeFe]-氢化酶作为类似应用的有希望的候选者。将[FeFe]-氢化酶与光敏剂[153],[154],[155],[156]或光系统I（PSI）[157],[158],[159]结合，可以利用光能驱动质子还原，实现清洁的太阳能氢生产。Rumbaugh等人最近将耐O2的CbA5H [FeFe]-氢化酶与PS I的周边（基质）亚基PsaE融合[159]。这种纳米结构在厌氧光照下生成H?的速率为84.9 ± 3.1 μmol H? mg chl?1 h?1。重要的是，在制备和操作过程中暴露于O2只会部分降低其活性，但仍保持2.2 ± 0.5 μmol H? mg chl?1 h?1的H?产生率。这种由工程化的[FeFe]-氢化酶与PsaE支架共同赋予的O2韧性，突显了在需氧环境中创建功能性体内H?生产系统的潜力[159]。

Vincent团队开发了一种使用耐氧氢化酶在导电支持上进行氧化还原级联反应的高效H?驱动辅因子回收系统[160],[161],[162],[163]。通过在导电碳支持上共固定氢化酶和还原酶，该系统促进了从H?氧化到辅因子还原的高效电子转移，使得与NAD(P)H依赖性酶的无缝集成成为可能，从而实现不对称合成。然而，提高耐氧氢化酶的表达产量仍然具有挑战性[163]。Cleary等人的最新研究表明，耐氧CbA5H [FeFe]-氢化酶可以在生物反应器中扩大规模（高达10 L），并且纯化酶的产量提高了20倍以上[164]。与之前讨论的氢化酶类似，CbA5H可以使用H?来还原黄素，驱动烯还原酶催化。此外，当与碳支持上的NAD?还原酶模块结合时，CbA5H能够驱动H?驱动的NADH再生。这支持了一种NADH依赖的醇脱氢酶，将近50 mM的底物转化为药物前体quinuclidinol，总转化次数达到135,300次，并在18小时内几乎完全转化[164]。

分子氢已被证明具有选择性的抗氧化和抗炎生物效应[165]。Zhang等人最近开发了一种EcHyd2 [NiFe]氢化酶-FmocKYF水凝胶混合物，其中整合了银纳米簇（AgNCs），用于光催化H?生产。这种基于氢化酶的生物材料已应用于糖尿病小鼠模型，显示出加速伤口闭合、减少氧化应激、促进血管生成以及促进巨噬细胞向修复表型极化的效果。尽管仍处于探索阶段，但开发用于在特定目标（如肿瘤）控制释放或检测氢的基于氢化酶的系统可以为氢疗法提供新的工具[166]。

上述概述了氢化酶的潜在应用；然而，仍有几个关键瓶颈需要解决才能实现实际应用。在生物燃料电池应用中，最重要的瓶颈之一是界面电子转移效率。催化电流密度和功率输出通常不是由内在的酶活性限制的，而是由深埋的H簇和电极表面之间的低效电耦合限制的。即使是对氧气耐受的氢化酶，如果电子转移路径优化不当，也可能遭受显著的过电位，这突显了电极架构、表面功能化和蛋白质定向控制的重要性。第二个主要限制是在非生理条件下的长期操作稳定性。工业和体外应用要求酶在长时间内保持活性，非天然的pH值和离子强度，升高的温度，以及有机溶剂或抑制性底物的存在。例如，在H?驱动的化学合成级联中，氢化酶必须与伴侣酶连续运行数小时；虽然CbA5H驱动的quinuclidinol合成已经证明了数十小时的稳定性，但商业过程所需的数百到数千小时的耐久性仍然很大程度上未经验证。这些考虑表明，仅酶生产的可扩展性并不能保证过程的可行性，除非在操作稳健性方面也有相应的进步。

尽管如此，氢化酶相对于合成催化剂（包括基于铂的系统）的内在优势增强了对其催化潜力的信心。工程化的[FeFe]-氢化酶主要不在绝对的稳健性或部署的简便性上竞争。相反，它们的核心竞争优势在于催化效率和能量经济性。[FeFe]-氢化酶在常温条件下以极高的转化频率催化质子和氢的可逆转化，接近热力学势能，过电位最小。相比之下，许多贵金属和合成催化剂需要额外的能量输入来克服动力学障碍，导致大规模操作成本更高。此外，氢化酶通过蛋白质工程提供了无与伦比的分子可调性，使得能够合理控制气体通道结构、氧化还原性质和催化偏置能力，这些在无机系统中难以实现。最后，氢化酶的内在生物相容性在需要与活体或软物质系统集成的特定应用中提供了独特的优势。总的来说，这些特性使工程化的氢化酶不是作为金属催化剂的通用替代品，而是在能量效率、选择性和生物集成至关重要的应用中成为极具竞争力的解决方案。

7. 结论

[FeFe]-氢化酶从对氧气敏感的生物催化剂转变为可在空气中操作的酶，已经从科学好奇心发展成为一个现实的技术目标。机制研究现在已经以分子精度绘制了O?如何通过气体通道扩散、拦截催化中间体以及降解H簇的过程。对自然进化的耐O2 [FeFe]-氢化酶（如CbA5H和ToHydA）的研究揭示了多种保护机制。这些机制包括动态构象门控，形成灵活的疏水簇，从而促进保护状态的可逆形成。这些发现将我们对O?反应性的理解从静态阻塞模型转变为化学动力学的动态竞争，揭示了控制脆弱性和韧性的结构和电子决定因素。基于这些见解，工程策略已经从简单的点突变发展到结合计算设计、ASR、高通量筛选以及在先进的材料（如氧化还原聚合物或肽-纳米簇矩阵）中的封装的集成方法。挑战本质上是多维的：增强O?耐受性的突变通常会牺牲催化转化率，而基于材料的保护可能会限制质量传输或操作兼容性。克服这些限制需要从孤立干预转向协同设计，其中内在工程创造出适度耐受、高活性的酶，然后通过外在屏蔽来提供长期的操作稳健性。首要原则是使用机器学习辅助的计算设计、从头设计（RFdiffusion/ProteinMPNN）和ASR等计算方法来创建具有高活性和改善的O?耐受性的稳健蛋白质支架，超越天然酶如CbA5H和ToHydA。然后，将这种内在工程化的酶嵌入到如氧化还原聚合物和肽水凝胶等外在保护矩阵中，作为第一道防线，以减少O?向酶的扩散。这一框架从创造更好的生物催化剂转向创造更好的生物催化剂系统。

展望未来，最有前途的道路在于结合机制准确性、数据驱动的预测工程和多尺度保护策略。随着机器学习模型开始捕捉金属酶的序列-结构-功能关系，以及材料科学提供越来越可调的微环境，设计出既保留生物催化的优雅和效率又接近无机系统耐用性的氢化酶变得可行。实现这一目标不仅将释放基于氢的能源转换的全部生物技术潜力，还将体现酶学的一个更广泛的范式：将分子敏感性转化为可控的设计参数。在将进化上的脆弱性转化为工程化的优势的过程中，[FeFe]-氢化酶的研究继续揭示了生物系统如何平衡反应性和生存性，并为构建可持续未来的下一代催化剂提供了蓝图。

CRediT作者贡献声明：
Ruochen Dai：软件、资源、形式分析。
Naiyue Gao：写作——原始草稿、软件、资源。
Tin Pou Lai：写作——原始草稿、软件、数据管理、概念化。
Liyun Zhang：写作——审阅与编辑、写作——原始草稿、监督、资源获取、数据管理、概念化。
Hang Luo：写作——原始草稿、形式分析、数据管理、概念化。
Xiao Qi：写作——原始草稿、软件、形式分析、数据管理。
Mingqian Li：写作——原始草稿、软件、形式分析、数据管理。