不同蚕品种茧壳中水溶性蛋白质的活性鉴定与蛋白质组学分析

《Insect Biochemistry and Molecular Biology》：Activity Identification and Proteomics Analysis of Water-Soluble Proteins in Cocoon Coat from Different Silkworm Varieties

　　

郝天|陈伟|李佳怡|张玉莉|程廷才|张文进|刘春

中国西南大学资源昆虫国家重点实验室，重庆400716

摘要

家蚕（Bombyx mori）的茧壳中含有丰富的生物活性蛋白质，这些蛋白质对其保护功能起着重要作用，然而不同品种之间的蛋白质差异尚未得到充分研究。在本研究中，使用pH 7.0的PBS从N4（黄色）、D9L（绿色）和305（白色）茧壳中提取了水溶性蛋白质，并对其抗氧化能力、抗菌活性和蛋白质组组成进行了分析。所有提取物均表现出较强的抗氧化活性，DPPH清除率介于71-81%之间。抗菌实验显示了不同的抑制模式：305蛋白对大肠杆菌和球孢白僵菌的抑制效果最显著，D9L蛋白对红色毛癣菌的抑制作用较强，而N4蛋白的作用介于两者之间。基于DIA的蛋白质组学分析鉴定出462种蛋白质，其中约60%具有催化或结合功能，主要集中在蛋白酶和蛋白酶抑制剂类别。主要成分包括Ser3和Ser1类似的丝胶蛋白、低丰度的Ser2以及丝胶亚基（Fib-H、Fib-L）。高丰度的蛋白质主要包括丝氨酸和羧肽酶抑制剂以及几种含有TIL结构域的zonadhesin类似蛋白。差异蛋白质分析表明，品种间的抗菌差异与这些生物活性成分有关。使用AlphaFold 3对zonadhesin类似蛋白进行结构预测后发现，其独特的凸环构象是由串联的TIL结构域相互作用形成的，这可能与其在病原体识别或防御中的作用有关。本研究建立了多种家蚕品种茧壳的全面蛋白质组图谱，确定了BmSPI39和seroin作为品种特异性防御的关键因子，并阐明了由可溶性丝蛋白介导的适应性防御机制，从而为抗病家蚕育种提供了具体的分子靶点。

引言

家蚕（Bombyx mori）是一种经典的模式昆虫，其茧壳具有多种生物学功能，包括作为抵御细菌感染的物理屏障（Nirmala等人，2001年）、防止机械损伤（Chen等人，2013年）以及缓冲环境变化（Danks，2004年）。此外，在蛹的静止阶段，茧壳实际上起到了外部免疫器官的作用，保护蛹免受微生物的威胁。由于丝蛋白具有优异的生物相容性，它在生物医学（Song等人，2016年）和功能性材料（Lee等人，2018年）应用中也具有巨大潜力。

丝蛋白由丝胶蛋白（SS）和丝素（SF）组成，两者共同构成核心结构。丝胶蛋白约占干丝重量的20%-30%，主要覆盖在丝素纤维上（Nguyen等人，2019年）。早期研究确定丝胶蛋白是一个由三个丝胶基因编码的多功能蛋白家族，形成复杂的蛋白质复合体。它包括三种主要的丝胶蛋白：Sericin1（69/76/119/283/330 kDa），在中间后部丝腺中合成（Garel等人，1997年；Yukuhiro等人，2016年）；Sericin2（120/230 kDa）和Sericin3（123 kDa），在前中部丝腺中表达（Kludkiewicz等人，2009年；Takasu等人，2007年）。它们的表达受到发育阶段的调控：Ser2在第五龄初期参与网状结构的构建，而Ser1和Ser3在第五龄中期至后期起主导作用，共同构成了成熟茧壳中超过90%的丝胶蛋白，其中Ser2几乎不存在（Takasu等人，2010年）。除了将丝素纤维粘合成茧层外，丝胶蛋白还能抑制再生丝素（RSF）中的β-折叠形成并延缓凝胶化过程（Kwak等人，2017年）。丝素占干丝的约70%，构成了丝的机械核心（Wang等人，2021年）。它由一个重链（Fib-H，>390 kDa）、一个轻链（Fib-L，约26 kDa）和一个P25糖蛋白（约25或27 kDa）组成，三者以6:6:1的摩尔比组装（Inoue等人，2000年）。这三个组分都在后部丝腺中表达，并通过共价二硫键和非共价疏水相互作用形成异质复合物。这种层次化的分子组装赋予了丝独特的机械性能，并为仿生材料设计提供了结构蓝图。

蛋白质组学的进步表明，丝蛋白组不仅包含丝胶蛋白和丝素，还包含多种微量功能性蛋白质（Zhaorigetu等人，2001年）。2013年，Dong等人利用LC-MS/MS技术系统地注释了上百种功能性蛋白质，包括蛋白酶抑制剂和酶（Dong等人，2013年）。2015年Dong等人的进一步研究表明，茧壳的多层结构导致蛋白质组成的空间异质性（Li等人，2015a）。重要的是，蛋白质提取策略对生物活性的保持具有关键影响：强酸或强碱溶剂常会导致蛋白质变性（Kim等人，2016年），而Guo等人使用pH 7.5的Tris-HCl缓冲液成功从不同茧层中获得了高活性的蛋白酶抑制剂。这不仅突显了温和提取技术的优势，还证实了茧壳中的蛋白质具有最强的蛋白酶抑制活性，能有效抑制球孢白僵菌的生长（Guo等人，2016年）。

蛋白酶抑制剂在微生物、植物和动物组织中普遍存在，其主要功能是防止异常的蛋白质水解。值得注意的是，家蚕丝中含有丰富的丝氨酸蛋白酶抑制剂（SPIs）。Zhao等人通过对家蚕基因组进行全基因组生物信息学分析，鉴定出了80个SPI基因。根据不同的结构域，这些SPI被分为十个家族：Serpin、TIL、Kunitz-BPTI、Kazal、WAP、α-巨球蛋白、Pacifastin、amfpi、Antistasin和Bowman-Birk（Zhao等人，2012年）。其中，类胰蛋白酶抑制剂（TIL）家族的特点是一个富含半胱氨酸的结构域，包含61-62个氨基酸残基。该结构域通常包含十个半胱氨酸残基，形成五个特定的二硫键（1-7、2-6、3-5、4-10和8-9）（Cierpicki等人，2000年；Grasberger等人，1994年）。关于家蚕中TIL型蛋白酶抑制剂的研究仍然有限；然而，研究表明，含有单个TIL结构域的BmSPI38和BmSPI39具有优异的热稳定性、广泛的pH耐受性和强抗真菌活性。

除了蛋白酶抑制剂外，茧壳中的丝蛋白还具有显著的抗氧化特性，能够清除DPPH和ABTS等自由基，从而减轻氧化应激（Fan等人，2010年；Takechi等人，2014年）。Manjubala等人报告称，从丝中提取的丝胶蛋白具有强大的DPPH清除能力，这与其提取条件密切相关（Manjubala等人，2020年）。此外，Sangwong等人证明，通过化学或酶处理制备的丝胶蛋白水解物在ABTS实验和金属离子螯合方面表现出增强的抗氧化潜力（Fan等人，2010年；Wubulikasimu等人，2021年）。

由于白色茧更适合后续的丝绸染色工艺，因此在丝绸产业中占主导地位。经过长期的人工选择，商业化的白色茧通常具有较高的机械强度和产量。除了这些广泛使用的白色品种外，家蚕还包含大量的遗传多样性，其中包括许多产生天然色素茧的本地品系。根据色素成分，这些多样化的品系可以分为两大类：含有类胡萝卜素的黄色/红色品系和含有黄酮类的绿色品系。与标准白色茧相比，这些天然色素品系具有更强的紫外线抵抗力（Daimon等人，2010年）、更强的抗菌效果和更强的抗氧化能力（Wang等人，2020年）。

尽管当前的研究逐渐揭示了不同层中蛋白质的分布模式，并建立了提取和鉴定微量生物活性蛋白质的方法，但不同家蚕品种之间茧壳蛋白质的活性和组成差异仍不明确。为了解决这一问题，本研究选择了三种具有不同茧壳表型的代表性家蚕品系，并使用pH 7.0的PBS缓冲液温和提取了它们的水溶性蛋白质。评估了这些蛋白质的抗氧化和抗菌活性（针对大肠杆菌、球孢白僵菌和红色毛癣菌进行测试），并使用基于DIA的蛋白质组学方法分析了品种间的蛋白质组成差异。

节选

实验材料

家蚕品系N4、D9L和305由资源昆虫高效育种与利用国家重点实验室提供。幼虫在25°C的恒温条件下饲养在桑叶上。在第五龄幼虫阶段结束时收集茧壳，并仔细切下最外层的茧壳（也称为L1层）以供后续分析。茧壳（在文献中也称为L1层）是指最薄的外层丝层

可溶性蛋白质的制备

为了确定茧壳蛋白（以下简称CCP）的最佳提取温度和时间，使用N4茧壳蛋白作为实验材料进行了条件优化。结果表明，在60°C以下的温度下可以观察到清晰的蛋白质条带，而在较高温度下则发生部分降解。因此，提取温度确定为60°C。对不同提取时间的进一步研究揭示了

讨论

本研究建立了一种基于PBS的有效方法，用于从三种不同家蚕品种（305（白色）、D9L（绿色）和N4（黄色）的茧壳中分离生物活性水溶性蛋白质。基于DIA的蛋白质组学分析鉴定出462种蛋白质，其中约60%具有催化或结合功能。研究结果突出了两个主要发现：不同品种的茧壳蛋白具有不同的抗菌活性谱，以及

结论

总之，本研究建立了一种基于PBS的有效提取方法，用于从不同家蚕品种的茧壳中分离水溶性活性蛋白质，显著提高了生物活性成分的回收率。首次生成了这些不同茧壳表型的品种特异性活性蛋白质图谱，揭示了不同品系间抗菌活性功能差异的分子基础。值得注意的是，这一发现和初步

CRediT作者贡献声明

李佳怡：数据可视化、软件处理。张玉莉：资源获取、资金申请。陈伟：初稿撰写、方法学设计、实验研究、数据分析。郝天：初稿撰写、验证、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构建。刘春：方法学设计、实验研究、资金申请、数据分析、数据管理、概念构建。程廷才：撰写审查与编辑、监督、方法学设计、数据管理、概念构建。张文进：

数据可用性

作者确认所有支持研究结果的数据均可无限制地获取。质谱蛋白质组数据已存储在iProx数据库中（Integrated Proteome Resources，https://www.iprox.cn），数据集标识符为IPX0013361000。

致谢

本研究的资金由重庆市商务委员会（资助编号：2025031016332071）、国家自然科学基金（32573298）和广西重点研发计划（Gui Nong Ke AB241484024）提供。