早晨注射胰高血糖素会干扰犬体内由胰岛素诱导的肝脏代谢记忆效应，进而影响下午的葡萄糖代谢过程

《Frontiers in Endocrinology》：Morning glucagon disrupts insulin induced hepatic metabolic memory and subsequent afternoon glucose metabolism in canines

　　摘要
引言：Staub-Traugott效应，或称为第二餐现象，描述了在摄入第二顿相同餐食后葡萄糖代谢的改善。我们之前的研究表明，早晨的高胰岛素血症会促使肝脏增强下午的净肝葡萄糖摄取和糖原储存。然而，混合餐食会触发胰岛素和胰高血糖素的共同分泌，而胰高血糖素传统上被认为与胰岛素在肝脏中的作用相反。目前尚不清楚胰高血糖素是否会改变胰岛素在连续代谢挑战中的预处理效应的持久性。因此，我们研究了早晨的高胰高血糖素血症是否会影响早晨高胰岛素血症对随后肝脏葡萄糖代谢的预处理能力。

方法：清醒的狗经历了两个胰腺钳夹期，中间间隔1.5小时的休息时间。内源性胰岛素和胰高血糖素通过生长抑素被抑制，并以特定速率通过门静脉补充。在4小时的早晨高胰岛素血症-正常血糖钳夹期间，狗接受了匹配的胰岛素预处理输注，分别加入基础胰高血糖素（AM INS；n=8）或增加的胰高血糖素（AM INS+GCG；n=8）。休息期后，两组狗在相同的激素条件下进行了2.5小时的下午高胰岛素血症-高血糖钳夹。使用动脉-静脉差分方法和[3-3H]-葡萄糖示踪剂动力学技术量化了下午的净肝葡萄糖摄取、糖原生成、糖酵解和糖异生速率。在下午钳夹前后采集了肝脏活检样本，以评估肝脏葡萄糖代谢的基因转录和蛋白质调节因子。

结果：尽管胰岛素、胰高血糖素和葡萄糖水平相匹配，但在AM INS+GCG组中，下午的净肝葡萄糖摄取量比AM INS组低41%（3.6±0.4 mg/kg/min vs 6.1±0.6 mg/kg/min；p<0.003）。这伴随着AM INS+GCG组中肝脏葡萄糖生成不完全抑制的趋势（1.4±0.4 mg/kg/min），而在AM INS组中则完全被抑制（p=0.06）。直接糖原合成也降低了44%（1.8±0.2 mg/kg/min vs 3.2±0.7 mg/kg/min；p<0.015），同时净糖原合成和糖酵解速率也有所下降。早晨的高胰岛素血症伴随基础胰高血糖素增加了下午钳夹前的肝葡萄糖激酶mRNA和蛋白质水平，而同时存在的胰高血糖素则阻止了这种诱导。

讨论：总之，早晨的高胰高血糖素血症减弱了胰岛素介导的肝脏预处理作用，减少了随后高胰岛素血症-高血糖挑战期间的肝脏葡萄糖流量。这些发现表明胰高血糖素与胰岛素一起调节肝脏的代谢记忆，并表明一天中的早期胰岛素-胰高血糖素动态影响了肝脏对后续挑战的反应，为餐后葡萄糖调节提供了机制上的见解，并对代谢健康和糖尿病风险具有意义。

1 引言
身体对一天中第一餐的代谢反应会影响随后餐食的葡萄糖调节，从而改善第二餐的葡萄糖处理（1–4）。我们已经证明，这种反应被称为Staub-Traugott效应或第二餐现象，是由于下午肝脏葡萄糖摄取（HGU）和糖原储存的增加，这些过程受到早晨胰岛素暴露的影响（5）。虽然胰岛素现在被认为是这种反应的主要驱动因素（5, 6），但其他激素和代谢因素的作用仍不清楚。

肝脏葡萄糖代谢在一个更广泛的全身系统中运作，其中通过激素、营养物流动和神经通路介导的信号反馈回路有助于维持全身能量平衡（7–9）。可能影响第二餐效应的一个关键因素是胰高血糖素，它通常被认为通过刺激肝脏葡萄糖生成（HGP）来急性对抗胰岛素的作用，主要通过糖原分解，以及在较小程度上通过糖异生（10, 11）。由于胰岛素和胰高血糖素通常在混合餐食时共同分泌，它们的相互作用对于塑造全天的餐后葡萄糖代谢至关重要（12, 13）。先前的研究表明，即使胰岛素水平较高，升高的胰高血糖素水平也可以急性降低HGU并抑制糖原合成（14, 15）。值得注意的是，在糖尿病前期或2型糖尿病患者中，混合餐或高蛋白餐后的胰高血糖素反应通常比血糖正常的人更为显著，从而导致葡萄糖稳态受损和疾病进展风险增加（13, 16–18）。因此，全身胰岛素或胰高血糖素动态的紊乱可能导致广泛的代谢失调。虽然胰高血糖素的急性效应已经得到了很好的研究，但其对一天中后期葡萄糖处理的早晨效应尚未得到研究。这些复杂的餐间调节网络需要机制研究，以探讨肝脏如何整合连续餐食中的激素和代谢信号（19, 20）。

代谢记忆是指组织保留先前代谢或营养暴露的持久效应的能力，这是一个与葡萄糖调节相关的新兴概念。细胞不会在每次餐食或生理状态后完全重置，而是可以携带过去的刺激产生的分子和功能印记，从而影响后续反应。迄今为止的大多数研究集中在脂肪组织和骨骼肌等组织中的长期适应上，其中慢性肥胖、运动或代谢压力会导致持久的分子或功能变化（21, 22）。例如，即使在减肥后，脂肪组织仍保留着由肥胖引起的表观遗传标记，反映了之前的压力记忆（23, 24）。同样，骨骼肌在运动或代谢挑战后也显示出持续的适应，表明功能记忆超出了最初的暴露（25, 26）。这些发现表明，代谢反应不仅仅是急性的，而是受到先前暴露的影响，这些影响会随时间改变组织的敏感性和全身营养处理。然而，肝脏在急性和慢性条件下的代谢记忆仍然知之甚少。众所周知，许多肝脏过程，包括那些调节糖原储存和转录变化的过程，都是短暂且可逆的，这引发了关于肝脏如何以及能保留多久先前激素或营养信号的影响的问题（27）。

因此，我们旨在确定早晨胰高血糖素的升高是否改变了胰岛素驱动的下午净肝葡萄糖摄取和糖原储存的预处理作用。我们假设早晨的高胰高血糖素血症会减弱胰岛素对下午肝脏葡萄糖代谢的影响，可能降低早餐时胰岛素预处理的好处。通过直接评估这些效应，我们试图阐明餐食间胰岛素和胰高血糖素的相互作用，并确定激素波动如何随时间影响肝脏葡萄糖处理。这一知识不仅对于理解第二餐效应的机制很重要，而且对于制定糖尿病管理的治疗策略也很重要，包括使用双激素胰岛素和胰高血糖素泵系统或旨在通过利用胰岛素和胰高血糖素的互补作用来优化血糖控制的共激动剂（28）。

2 研究设计和方法
2.1 动物护理和手术程序
共纳入29只成年杂种狗（16只雄性，13只雌性）。狗被分配到实验组中，以接近1:1的雄雌比例。样本大小基于初步和历史数据。使用G*Power进行功效分析，表明每组8只动物可以提供大约≥95%的功效来检测主要结果——下午净肝葡萄糖摄取的差异，以及分子终点。使用0.05的α水平，效应大小和方差估计来自之前的犬类钳夹研究。检测潜在性别差异的功效约为≥80%；然而，性别比较不是设计的主要结果，因此被认为是探索性的。与此一致，探索性分析未发现性别对肝脏葡萄糖代谢的显著影响。选择狗模型是因为它适合反复插管门静脉和肝静脉，从而在受控条件下进行详细的体内肝脏流量分析。此外，犬类的新陈代谢与人类非常相似，它们的基因组具有高度相似性和保守的功能，进一步支持了转化相关性（29, 30）。

16只狗（每组8只；AM INS和AM INS+GCG）接受了完整的实验方案，包括4小时的高胰岛素血症-正常血糖钳夹、1.5小时的休息和2.5小时的下午高胰岛素血症-高血糖钳夹（平均体重25.2 ± 0.8 kg）。另外13只狗的样本仅用于肝脏分子分析。5只狗作为基础肝组织对照，每组4只狗仅接受AM钳夹和休息期，以评估下午钳夹前的分子读数。所有程序均获得了范德比尔特大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）和动物护理部门（DAC）的批准。狗来自USDA许可的供应商，并饲养在AAALAC认证的设施中。在每次实验前两周，通过全身麻醉进行剖腹手术放置肝动脉和门静脉流量探头；导管插入肝静脉、门静脉、股动脉、脾静脉和空肠静脉（用于门静脉输注），以及下腔静脉，末端固定在皮下直到研究日。狗每天接受一次控制饮食（46%碳水化合物，34%蛋白质，14.5%脂肪，5.5%纤维），并在实验前禁食18小时。只包括健康动物，定义为摄入≥75%的先前餐食，白细胞计数<18,000/mm3和血细胞比容>34%。血液采样不超过总体积的20%。

2.2 实验设计
8小时的实验方案包括两个钳夹期，旨在复制早餐（AM钳夹，0–240分钟）和午餐（PM钳夹，330–480分钟）时的胰腺激素谱（图1）。每15–30分钟从股动脉、门静脉和肝静脉采集血液，同时每5分钟监测动脉葡萄糖，并调整外周葡萄糖输注以维持目标葡萄糖水平。

图1 实验方案。狗在早晨（AM；0–240分钟）接受了4小时的正常血糖钳夹。注入生长抑素以抑制内源性胰高血糖素（GCG）和胰岛素（INS）的分泌。胰岛素的补充方式模仿了早晨十二指肠葡萄糖输注期间观察到的水平。一组接受基础胰高血糖素（AM INS），而另一组接受高胰高血糖素血症（AM INS+GCG），在整个AM钳夹期间保持胰岛素和胰高血糖素之间的摩尔比相等。在AM钳夹接近结束时（180分钟）开始示踪剂输注，以便在PM钳夹开始前达到平衡。AM钳夹后有一个1.5小时的休息期（240–330分钟），在此期间所有输注都停止。在此期间结束后，一部分狗（每组n = 4）被安乐死以收集肝组织进行分子分析。剩余的狗（每组n = 8）接受了2.5小时的PM HIHG钳夹，期间门静脉给予葡萄糖（330–480分钟），之后收集肝组织。更多细节见方法部分。AM INS，蓝色；AM INS+GCG，绿色。

2.2.1 早晨钳夹期（0–240分钟）
我们之前的研究表明，生理性的早晨胰岛素升高而不是高血糖症驱动了肝脏代谢记忆，从而增强了下午的HGU（5）。因此，在早晨进行了高胰岛素血症-正常血糖钳夹。在钳夹开始时，将生长抑素（Bachem）注入下腔静脉（0.8 μg/kg/min）以抑制内源性胰岛素和胰高血糖素的分泌。通过门静脉注入胰岛素（Novolin R；Novo Nordisk），剂量分别为2.1 mU/kg/min（0–30分钟），2.4 mU/kg/min（30–60分钟）和1.5 mU/kg/min（60–240分钟），以复制早晨十二指肠葡萄糖输注期间观察到的生理胰岛素分泌模式（5）。

研究了两个实验组。一组（AM INS）在0–240分钟接受基础胰高血糖素输注（GlucaGen；Novo Nordisk），而另一组（AM INS+GCG）接受升高的生理胰高血糖素输注，以在整个AM钳夹期间保持恒定的胰岛素与胰高血糖素摩尔比（2.28 ng/kg/min，0–30分钟；2.60 ng/kg/min，30–60分钟；1.63 ng/kg/min，60–240分钟）。这些条件分别模拟了碳水化合物餐或混合餐后的早晨激素谱。葡萄糖在正常血糖水平（约100 mg/dL血浆葡萄糖）下被钳夹。为了评估下午的HGU和直接糖原合成，在180分钟开始外周[3-3H]-葡萄糖输注（Revvitty）（38 μCi初始剂量，连续0.38 μCi/min输注）。在AM钳夹结束时（240分钟），除了示踪剂外，所有输注都停止。

2.2.2 非钳夹期（240–330分钟）
为了评估PM钳夹前的葡萄糖动力学，在300、315和330分钟从股动脉、门静脉和肝静脉采集血液样本。在330分钟时对一部分狗（每组n = 4）进行麻醉，以检查PM期开始时的肝脏分子谱。迅速采集肝组织，快速冷冻在液氮中以保持细胞状态，并储存在-80°C，然后用戊巴比妥安乐死。

2.2.3 下午钳夹期（330–480分钟）
AM INS和AM INS+GCG两组（每组n = 8）在下午接受了相同的2.5小时高胰岛素血症-高血糖（HIHG）钳夹（图1）。通过外周注射生长抑素（0.8 μg/kg/min），同时通过门静脉给予基础胰高血糖素（0.57 ng/kg/min）和四倍基础胰岛素（1.2 mU/kg/min）。门静脉葡萄糖以4 mg/kg/min的速率输注，以激活门静脉葡萄糖信号（31），并通过预先进行的外周输注将血浆动脉葡萄糖升高至高血糖水平（约200 mg/dL），并在整个下午的钳夹实验期间保持这一水平。这些条件旨在模拟摄入富含碳水化合物的“餐后”状态下的稳态代谢环境（32）。在最后一次采样后（480分钟），对狗进行麻醉，收集肝脏组织并保存，然后按照上述方法对狗实施安乐死。

2.3 分析
2.3.1 生化和分子方法
使用动脉-静脉平衡技术（33）分析全血样本，以评估肝脏中的激素和底物流动情况。血浆葡萄糖水平通过Analox GM9仪器进行四次重复测量。胰岛素（#PI-12K，MilliporeSigma）、胰高血糖素（#GL-32K，MilliporeSigma）和皮质醇（VUMC Analytical Services提供的内部抗体，结合MP Biomedicals的I125标记皮质醇）通过放射免疫测定法（33）进行定量。胰高血糖素值按照其他方法（34）进行背景校正，以消除非特异性结合，确保报告的胰高血糖素水平准确反映真实的循环浓度，并提高激素流动分析的可靠性。关键中间产物，包括乳酸、甘油、丙氨酸和非酯化脂肪酸，通过酶促分光光度法（33）进行测量。血浆样本使用Somogyi方法脱蛋白，并通过液体闪烁计数法（35）测定每个样本中[3-3H]-葡萄糖的特异性活性。

在下午的钳夹实验开始和结束时收集的肝脏组织，使用经过验证的犬类特异性方法（33, 36）分析其糖原含量、基因表达、蛋白质丰度和酶活性。试剂、引物、抗体和计算的详细方案见补充材料。

2.3.1.1 RNA提取和定量PCR
使用Tri-reagent（Sigma-Aldrich）从约50毫克的冷冻肝脏中提取总RNA，并使用Direct-zol RNA Miniprep Kit（Zymo Research）进行纯化。通过分光光度法（A260/A280>1.8）评估RNA的产量和纯度。从1微克RNA合成第一链cDNA（High-Capacity cDNA逆转录试剂盒，Applied Biosystems）。使用CFX96实时PCR系统（Bio-Rad）和SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix进行qPCR。反应体系包含100纳克cDNA和0.4微摩尔引物，总体积为25微升。循环条件为：95°C预热3分钟，然后是39个循环，每个循环包括95°C 10秒和55°C 30秒。熔解曲线用于确认特异性，相对表达量通过2^–ΔΔCt方法计算，以GAPDH为参照基因。引物详细信息见补充表1。

2.3.1.2 西部印迹
将约100毫克的冷冻肝脏在1毫升冰冻缓冲液（20 mM Tris、200 mM NaCl、50 mM NaF、1 mM EDTA、1 mM EGTA、10%甘油、1% SDS，pH 7.2）中匀浆，并加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Sigma-Aldrich）。匀浆液在4°C下以3,000 × g离心10分钟。使用BCA试剂（Bio-Rad）测定蛋白质浓度，并调整至4微克/微升的浓度，然后转移到Laemmli缓冲液中。样品（每条泳道40微克）在4-12% Criterion TGX凝胶（Bio-Rad）上分离，转移到硝酸纤维素膜上，并用Ponceau S染色以进行总蛋白标准化。膜用5% BSA在TBST中封闭，然后在4°C下过夜孵育与一级抗体：pAkt（#9271，Cell Signaling）、tAkt（#9272，Cell Signaling）、pGS（#98348，Cell Signaling）、tGS（#3893，Cell Signaling）、pGP（#ab227043，Abcam）、tGP（#ab198268，Abcam）、pFOXO1（#9461，Cell Signaling）、tFOXO1（#2880，Cell Signaling）和GK（#sc-17819，Santa Cruz）。一级抗体稀释比例为1:5,000（GK为1:10,000；p/tFOXO1为1:1,000）。洗涤后，膜与1:5,000的HRP结合二级抗体孵育1小时，然后用ECL试剂（GE Healthcare）显色。使用ImageJ软件对条带进行定量，并与基础对照组进行归一化。

2.3.1.3 肝脏糖原含量
使用Keppler和Decker的方法（37）测定肝脏末期糖原含量。简要来说，将约180毫克的冷冻肝脏在0.6 N高氯酸中匀浆，用碳酸氢钾中和，然后与淀粉葡萄糖苷酶（2 mg/mL）在40°C下孵育2小时，将糖原水解为葡萄糖。同时处理无酶的对照组样本。糖原含量计算为酶处理样本中的葡萄糖减去对照组中的葡萄糖（牡蛎糖原）。标准品与样本一起处理，上清液使用葡萄糖分析仪（Analox GM9）测定葡萄糖浓度。

2.3.1.4 葡萄糖-6-磷酸酶活性测定
从约1克的冷冻肝脏中分离微粒体膜（38）。组织在50 mM HEPES、25 mM KCl、5 mM MgCl2、0.25 M蔗糖（pH 7.4）中匀浆，以7,800 × g离心6分钟，然后上清液以214,000 × g超速离心30分钟。微粒体沉淀物重新悬浮在29 mM MES、21 mM Tris、50 mM NaCl（pH 6.5）中。微粒体蛋白（40微克）与10 mM G6P或M6P在30°C下孵育15分钟，反应后用12% SDS终止，然后用Pi螯合和显色溶液处理，最后在850 nm处测量吸光度。减去背景Pi值，活性表示为每毫克微粒体蛋白每分钟的活性。

2.3.1.5 糖原合成酶活性测定
在低（活性）和高（总）G6P条件下，通过将UDP-[14C]-葡萄糖掺入糖原来测定糖原合成酶活性（2）。将约100毫克的冷冻肝脏在氟化钾/EDTA/糖原缓冲液（pH 7.0）中匀浆，离心（500 × g，10分钟，4°C），然后上清液稀释到pH 7.0或8.5的缓冲液中。样品点涂在滤纸上，用70%乙醇沉淀，空气干燥后通过闪烁计数法测定。平行空白样本用于校正背景掺入量，活性以总蛋白为基础进行归一化。

2.3.2 计算
使用动脉-静脉差值计算法确定净肝脏葡萄糖平衡（NHGB），表示为NHGB=[HGLout]?[HGLin]，其中HGLout代表从肝脏输出的葡萄糖，计算为[HGLout]=[BFhxGh]，HGLin表示进入肝脏的葡萄糖，计算为[HGLin]=[(BFaxGa)+(BFpxGp]。这里，G代表血糖浓度，BF表示测量的血流量，A、P和H分别代表肝动脉、肝门静脉和肝静脉。负的NHGB表示净肝脏葡萄糖摄取（NHGU），反映了肝脏对全身葡萄糖处理的贡献（HGLin>HGLout）。这种方法被扩展用于评估肝脏中各种底物和激素的净平衡。肝脏葡萄糖提取分数（HFrEx）量化肝脏去除的葡萄糖比例，计算为HFrEx=NHGB/HGLin。通过tracer确定的单向肝脏葡萄糖摄取（HGU）计算为HGU=HGLin?HFrEx[3H]?葡萄糖。肝脏葡萄糖产生（HGP）计算为NHGU和HGU之间的差值。肝脏窦状血管底物浓度（HSSC）计算为动脉和门静脉浓度的流量加权平均值。HSSC=BFA?[S]A+BFP?[S]PBFH，这代表了肝脏窦状血管中的平均底物浓度，考虑了肝动脉和门静脉的相对贡献。非HGU主要归因于骨骼肌的葡萄糖摄取，计算为Non?HGU=GIR?HGU?Δglucosemass，其中Δglucose mass表示时间点之间的葡萄糖池大小变化，考虑了细胞外分布和池比例。分配体积设定为体重的22%，池比例为0.65（39）。

直接糖原合成量估计为肝脏从摄取的葡萄糖中合成的糖原量，计算为GlycogenSynthesis=Totalradiolabeledglycogen(dpm)/Specificactivityofprecursorpool(dpmmg)，其中流入的葡萄糖前体池的特异性活性（SA）计算为SA=([3H]GAGA?BFABFH)+([3H]GPGP?BFPBFH)。所有糖异生和糖酵解通量均以葡萄糖当量单位表示，反映了三碳中间体向六碳葡萄糖的转化。总糖异生通量定义为糖异生前体（丙氨酸和甘油）转化为葡萄糖-6-磷酸（G6P）的量。由于丙氨酸约占该底物池的50%（36, 40），因此将丙氨酸摄取量加倍。丙氨酸和甘油的通量分别量化为净肝脏丙氨酸摄取（NHAU）和净肝脏甘油摄取（NHGlyU）。因此，糖异生通量计算为Gluconeogenicflux=2?NHAU+NHGLYU。糖酵解通量估计为Glycolyticflux=NHLO+(0.1?NHLO)+HGOGlycolyticflux=NHLO+(0.1·NHLO)+HGO，其中NHLO代表净肝脏乳酸输出（NHLO），pyruvate的产生估计为乳酸通量的10%（41），基于先前的示踪研究显示在各种钳夹条件下乳酸-pyruvate关系稳定。假设肝脏葡萄糖氧化速率为0.2 mg/kg/min，这与先前的犬类钳夹研究一致，显示在胰岛素和葡萄糖条件下该速率较低且相对恒定（42, 43）。重要的是，所有组应用相同的假设以确保组间比较的有效性。

净肝脏糖异生/糖酵解通量（NHGNG）计算为NHGNG=Glycolyticflux?Gluconeogenicflux，其中正值表示净糖酵解，负值表示净糖异生。然后计算净糖原通量以反映净糖原合成或分解，表示为NetGlycogenFlux=NHGU?NHGNG，其中正值表示净糖原合成，负值表示糖原分解。这些计算提供了肝脏碳在葡萄糖产生、糖酵解和糖原代谢之间分配的综合估计（30）。所有组分通量均基于上述验证的假设得出，包括对pyruvate贡献、肝脏葡萄糖氧化和丙氨酸对总糖异生氨基酸摄取的相对贡献的估计。

2.3.3 统计
数据以平均值±标准误（SEM）表示。进行双向重复测量ANOVA以评估组间和随时间变化的通量差异，随后使用Tukey的事后检验进行多重比较。对于曲线下的相应区域（AUC），应用非配对双尾t检验进行分析。ΔAUCs计算为相对于基线的AUC。分子分析使用单因素ANOVA和Tukey的事后检验进行评估。使用Shapiro-Wilk检验确认所有数据集的正态性，所有数据均符合正态分布。统计分析使用GraphPad Prism软件进行。当有确切的p值时报告；否则，显著性通过阈值表示（例如，p<0.05、p<0.01、p<0.001、p<0.0001）。应用显著性阈值p<0.05。

2.4 数据可用性
图中显示的所有数据点的值都在支持数据值文件中提供。此外，数据集和补充材料可在doi.org/10.6084/m9.figshare.29988931公开获取。当前研究期间生成和分析的所有其他数据可根据合理要求从相应作者处获取。

3 结果
3.1 上午（AM）钳夹实验中的葡萄糖和激素数据
在上午的钳夹实验期间，两组均成功维持了血糖平衡（图2A）。血浆胰岛素在动脉、门静脉和计算的肝脏窦状血管部位以相似的模式增加（图2B、D；表1）。动脉血浆胰高血糖素在AM INS组保持基础水平（AM平均值为23 ± 1 pg/mL），但在AM INS+GCG组翻倍（AM平均值为49 ± 2 pg/mL；图2E；表1）。门静脉和肝脏窦状血管的胰高血糖素水平也呈现相似的模式（图2F、G；表1）。在AM INS+GCG组，胰高血糖素在60分钟时达到峰值（动脉71 ± 3 pg/mL；肝脏窦状血管116 ± 6 pg/mL），随后逐渐下降，但在整个钳夹实验期间仍高于基础水平。尽管AM INS+GCG组的胰高血糖素水平较高，但维持血糖平衡所需的葡萄糖输注速率在两组之间相当（AM INS组平均为9.5 ± 0.5 mg/kg/min，AM INS + GCG组为9.3 ± 1.3 mg/kg/min，图2H）。两组的净肝脏葡萄糖平衡从输出转为摄取，两组之间没有显著差异（图2I）。

图2 上午（AM）钳夹实验中的葡萄糖和激素通量数据。(A) 动脉血浆葡萄糖，(B) 动脉血浆胰岛素，(C) 门静脉血浆胰岛素，(D) 肝脏窦状血管血浆胰岛素，(E) 动脉血浆胰高血糖素，(F) 门静脉血浆胰高血糖素，(G) 肝脏窦状血管血浆胰高血糖素，(H) 葡萄糖输注速率，(I) 净肝脏葡萄糖平衡（负值表示摄取，正值表示输出）分别显示了AM INS组和AM INS+GCG组（n = 8/组，除了F和G在AM INS组为n = 4，I在AM INS组为n = 6）在整个AM钳夹实验期间的数据。数据以平均值±标准误表示。***P< 0.001，****P< 0.0001表示组间差异；ns表示无显著差异。AM INS组为蓝色；AM INS+GCG组为绿色。

表1 AM钳夹实验参数
组别 AM INS (n=8) AM INS+GCG (n=8)
动脉血浆胰岛素 (μU/mL) 50 ± 45 1 ± 4
肝脏窦状血管血浆胰岛素 (μU/mL) 151 ± 6 170 ± 15
动脉血浆胰高血糖素 (pg/mL) 23 ± 1 49 ± 2
****肝脏窦状血管血浆胰高血糖素 (pg/mL) 34 ± 3 81 ± 3
****AM钳夹实验期间测量的血浆激素浓度。
数据以平均值±标准误表示。胰岛素样本每30分钟分析一次，胰高血糖素样本在实验协议期间每小时分析一次。每个值代表每个钳夹期间收集的所有样本的平均值（n = 8/组）。****P< 0.0001。

在1.5小时的休息期后，激素和底物水平恢复到基线水平，所有狗都处于产生葡萄糖的状态（图3–5）。这反映了AM干预后葡萄糖稳态的恢复正常，在PM钳夹实验开始前的300–330分钟期间尤为明显。

图3 下午（PM）钳夹实验中的葡萄糖和激素通量数据。在330分钟时的一条垂直线表示休息期的结束和下午高胰岛素-高血糖钳夹（PM clamp）的开始。(A) 动脉血浆葡萄糖，(B) 门静脉血浆葡萄糖，(C) 动脉-门静脉葡萄糖差值，(D) 肝脏葡萄糖负荷，(E) 动脉血浆胰岛素，(F) 肝脏窦状血浆胰岛素，(G) 动脉血浆胰高血糖素，以及(H) 肝脏窦状血浆胰高血糖素在2.5小时的高胰岛素-高血糖PM钳夹期间在AM INS和AM INS+GCG组中都有显示（每组n = 8）。在任何测量参数上，两组之间没有观察到显著差异。数据以平均值±标准误（SEM）表示；ns表示无显著性差异。AM INS组用蓝色表示；AM INS+GCG组用绿色表示。

图4显示了在PM高胰岛素-高血糖钳夹期间的葡萄糖摄取和储存情况。在330分钟时的一条垂直线表示休息期的结束和下午高胰岛素-高血糖钳夹的开始。(A) 葡萄糖输注率（GIR），(B) GIR ΔAUC，(C) 非肝脏葡萄糖摄取，(D) 非肝脏葡萄糖摄取 ΔAUC，(E) 净肝脏葡萄糖摄取（NHGU；值>0表示摄取，<0表示输出），(F) NHGU ΔAUC，(G) 使用氚标记的葡萄糖测定的单向肝脏葡萄糖摄取，(H) HGU AUC，(I) 肝脏葡萄糖生成（HGP；通过NHGU和HGU之间的差异确定），(J) HGP AUC，(K) 净糖异生/糖酵解通量（值>0表示净糖酵解，<0表示净糖异生），以及(L) 净糖原生成通量（值>0表示净糖原生成，<0表示净糖原分解）在AM INS和AM INS+GCG组中随时间的变化（每组n = 8）。数据以平均值±标准误表示。*P< 0.05，**P< 0.01表示组间差异；ns表示无显著性差异。AM INS组用蓝色表示；AM INS+GCG组用绿色表示。

图5显示了在PM高胰岛素-高血糖钳夹期间的脂肪酸和代谢物通量数据。在330分钟时的一条垂直线将休息期与下午高胰岛素-高血糖钳夹的开始分开。(A) 动脉血浆非酯化脂肪酸（NEFA），(B) 净肝脏NEFA摄取，(C) 动脉血甘油，(D) 净肝脏甘油摄取，(E) 动脉血丙氨酸，(F) 净肝脏丙氨酸摄取，(G) 动脉血乳酸，以及(H) 净肝脏乳酸输出在AM INS和AM INS+GCG组中在整个下午高胰岛素-高血糖钳夹期间都有显示（每组n = 8）。数据以平均值±标准误表示。*P< 0.05，**P< 0.01表示组间差异；ns表示无显著性差异。AM INS组用蓝色表示；AM INS+GCG组用绿色表示。

3.2 PM钳夹葡萄糖和激素数据
PM钳夹的设计旨在通过外周（腿部静脉）葡萄糖输注来模拟餐后激素和底物环境，同时通过门静脉葡萄糖输注建立约20–25 mg/dL的生理性餐后动脉-门静脉葡萄糖梯度（图3A–D）。胰岛素水平在动脉循环和肝脏窦状隙中显著升高（图3E, F），而胰高血糖素水平在整个PM钳夹期间保持基础水平（图3G, H）。因此，在PM钳夹期间，AM INS和AM INS+GCG组的激素和血糖条件是一致的。
在PM钳夹期间，维持高血糖所需的葡萄糖输注率在两组中是相似的（图4A, B）。AM INS组的平均非肝脏葡萄糖摄取（NHGU）为7.6 ± 0.9 mg/kg/min，AM INS+GCG组为9.4 ± 1.3 mg/kg/min，两组之间没有显著差异（图4C, D）。AM INS+GCG组的NHGU降低了41%（PM平均值为6.1 ± 0.6 mg/kg/min，而AM INS组为3.6 ± 0.4 mg/kg/min，P< 0.0027，图4E, F）。这种减少伴随着PM期间单向肝脏葡萄糖摄取（HGU）的差异不显著（AM INS组平均为5.7 ± 0.5 mg/kg/min，而AM INS+GCG组为5.0 ± 0.3 mg/kg/min，图4G, H）。相比之下，AM INS组的肝脏葡萄糖生成（HGP）被完全抑制，但在PM钳夹期间AM INS+GCG组的平均值为1.4 ± 0.4 mg/kg/min。尽管HGP通量仅显示出显著趋势（P = 0.06，图4I），但△AUC在AM INS+GCG组中显著高于AM INS组（图4J）。与此一致，AM INS+GCG组的净糖酵解通量显著降低（P< 0.024；图4K），净糖异生通量也减少了41%（P< 0.004；图4L）。这些数据共同表明，早晨的胰高血糖素暴露降低了早晨胰岛素在PM期间增强肝脏葡萄糖摄取和储存的能力。
在PM钳夹期间，动脉血浆非酯化脂肪酸（NEFA）和甘油的水平以及这两种底物的净肝脏摄取在AM INS和AM INS+GCG组中均受到相似的抑制，反映了胰岛素在PM高胰岛素-高血糖条件下对肝脏脂肪酸处理的有效抑制（图5A–D）。循环中的丙氨酸水平和肝脏丙氨酸平衡在整个PM钳夹期间保持稳定，两组之间没有差异（图5E, F）。相比之下，AM INS+GCG组的动脉乳酸浓度和净肝脏乳酸输出显著低于AM INS组（图5G, H）。这些结果表明，早晨的胰高血糖素暴露选择性地降低了PM钳夹期间肝脏的净葡萄糖摄取及其在糖原合成和糖酵解途径中的下游利用，而脂质和氨基酸代谢未受影响。

3.3 终末肝脏活检
在完成AM钳夹和休息期后，但在开始PM钳夹之前，首先在330分钟时进行了肝脏活检（图6A）。选择330分钟这个时间点是为了在PM钳夹之前提供肝脏mRNA、蛋白质和代谢物水平的基线评估。在PM钳夹开始时，各组之间的葡萄糖通量测量结果立即出现分歧，表明此时肝脏分子变化已经发生。在330分钟时，各组之间的Akt磷酸化水平没有观察到差异（图6B）。与基线相比，AM INS组的葡萄糖激酶（GCK）mRNA显著增加，而在AM INS+GCG组中没有这种诱导（图6C）。与转录水平一致，GCK蛋白表达仅在AM INS组中升高（图6D）。使用G6P作为底物测量的完整和破裂微粒体中的总葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）活性在AM INS和AM INS+GCG组之间没有差异（图6E）。使用M6P作为底物测量的破裂微粒体中的G6Pase活性也没有差异（数据未显示）。糖原合成酶（GS）的磷酸化在两组之间也没有差异（图6F）。此外，糖原磷酸化酶（GP）的磷酸化和活性在两组之间也没有显著差异（图6G, H）。

图6显示了PM钳夹前的肝脏组织转录和蛋白质分析。(A) 实验时间线，显示了在0分钟（基线）和330分钟（每个实验组PM钳夹开始前）收集的肝脏活检。显示了Akt蛋白（B）、葡萄糖激酶mRNA（C）、葡萄糖激酶蛋白（D）、使用G6P和M6P底物的完整微粒体葡萄糖-6-磷酸酶活性（E）、糖原合成酶蛋白（F）、糖原磷酸化酶蛋白（G）和糖原磷酸化酶活性（H）的水平。数据以平均值±标准误（SEM）表示，分别针对基线组（n = 5）、AM INS组（n = 4）和AM INS+GCG组（n = 4）。*P< 0.05，**P< 0.01表示组间差异；ns表示无显著性差异。蛋白质水平通过Western blot测定，mRNA水平通过实时qPCR测定。蛋白质水平归一化为Ponceau S总蛋白；mRNA水平归一化为GAPDH。AM INS组用蓝色表示；AM INS+GCG组用绿色表示。
在PM钳夹结束时，即480分钟时，又收集了一组活检样本（图7A）。与基线相比，AM INS和AM INS+GCG组的Akt磷酸化显著增加（图7B）。
与基线相比，两组中的GCK mRNA表达都得到了诱导（图7C）。GCK蛋白仅在AM INS组中显著升高，而AM INS+GCG组的水平与基线对照组没有差异（图7D）。完整和破裂微粒体中的总葡萄糖-6-磷酸酶活性在AM INS和AM INS+GCG组之间没有差异（图7E）。这些测量是在每组4只动物中进行的。GS磷酸化在两组中都显著降低（图7F），同时GS活性增加（图7G）。GP磷酸化在两组中都与基线对照组相比降低（图7H），而GP活性在任何组之间没有显著差异（图7I）。此外，PM钳夹期间AM INS+GCG组的平均直接糖原合成显著减少（1.8 ± 0.2 mg/kg/min vs. 3.2 ± 0.7 mg/kg/min，P< 0.015；图7J）。

图7显示了PM钳夹后的肝脏组织转录和蛋白质分析。(A) 实验时间线，显示了在0分钟（基线）和480分钟（每个实验组PM钳夹结束时）收集的肝脏活检。显示了Akt蛋白（B）、葡萄糖激酶mRNA（C）、葡萄糖激酶蛋白（D）、使用G6P和M6P底物的完整微粒体葡萄糖-6-磷酸酶活性（E）、糖原合成酶蛋白（F）、糖原磷酸化酶蛋白（G）和糖原磷酸化酶活性（H）的水平。数据以平均值±标准误（SEM）表示，分别针对基线组（n = 5）、AM INS组（n = 4）和AM INS+GCG组（n = 8）。*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001，****P< 0.0001表示组间差异；ns表示无显著性差异。蛋白质水平通过Western blot测定，mRNA水平通过实时qPCR测定。蛋白质水平归一化为Ponceau S总蛋白；mRNA水平归一化为GAPDH。AM INS组用蓝色表示；AM INS+GCG组用绿色表示。
总之，早晨的胰岛素通过增加GCK mRNA和蛋白来预处理肝脏，而在同时存在的胰高血糖素则阻断了胰岛素对GCK转录和翻译的这种诱导效应。在PM钳夹结束时，糖原合成酶和磷酸化酶的下游调节在实验组之间是相似的。尽管PM钳夹结束时GCK mRNA水平相当，但只有AM INS组保持了升高的GCK蛋白，这可能部分解释了AM INS+GCG组中观察到的NHGU、糖酵解和乳酸释放的减少。支持这些结果的分子数据见补充图1和补充图2。

3.4 肝脏通量总结
图8总结了一个综合模型，显示了PM钳夹期间的平均肝脏葡萄糖通量。在AM INS组中，NHGU相对较大，反映了早晨胰岛素暴露后持续的肝脏葡萄糖保留。这完全是由于HGU的增加，因为HGP保持完全抑制。进入的葡萄糖被磷酸化为G6P，然后要么作为糖原储存，要么通过糖酵解代谢并释放为乳酸或被氧化。相比之下，当早晨胰岛素伴随胰高血糖素时，PM期间的NHGU较低，这是由于HGU的显著减少和相对于AM INS组的HGP持续增加共同作用的结果。此外，较少的G6P被分配到糖酵解和糖异生途径中。这些综合效应导致肝脏葡萄糖保留显著降低。这些发现表明，先前的胰高血糖素暴露会诱导代谢记忆，减弱胰岛素对NHGU和糖原合成的刺激。

图8总结了PM高胰岛素-高血糖钳夹期间的平均肝脏通量。左侧面板显示了AM INS组（n = 8），右侧面板显示了AM INS+GCG组（n = 8）。数值代表PM钳夹期间360–480分钟的平均通量，通过碳平衡分析确定。所示通量包括葡萄糖到/来自葡萄糖-6-磷酸（G6P）、G6P到/来自糖原，以及通过糖异生和糖酵解的G6P到/来自丙酮酸（使用丙氨酸、甘油和乳酸作为3碳前体估计）。箭头的大小反映了每个途径中的相对流量。这个示意图是综合性的，基于计算的平均通量，并不代表细胞内区室通量的直接测量。NHGU表示净肝脏葡萄糖摄取；HGU表示肝脏葡萄糖摄取；HGP表示肝脏葡萄糖生成。NHGU是HGU和HGP的总和。

4 讨论
有效调节肝脏葡萄糖代谢对于维持全身葡萄糖稳态至关重要。早餐在餐后血糖控制和糖原储存中起着关键作用，影响健康个体和糖尿病患者对后续餐食的代谢反应（1, 2, 44, 45）。不吃早餐与2型糖尿病的风险增加有关，这表明早晨营养和激素信号传导的紊乱可能对葡萄糖代谢和整体代谢健康产生持久影响（46）。尽管胰高血糖素对代谢失调的精确贡献尚未完全了解，但在肥胖和2型糖尿病中始终观察到餐后高胰高血糖症，这可能通过限制胰岛素介导的葡萄糖摄取和维持肝脏葡萄糖生成来损害葡萄糖稳态（13, 47）。由于胰高血糖素通过促进糖原分解和葡萄糖输出来对抗胰岛素在肝脏中的合成作用，因此了解其对餐后代谢的影响尤为重要，因为胰岛素与胰高血糖素的比例决定了肝脏代谢平衡（48）。这些考虑促使我们调查早晨升高的胰高血糖素是否会影响肝脏对胰岛素的响应，从而在下午增强葡萄糖的摄取。我们的发现是首批证明早晨先前的胰高血糖素暴露会重新编程肝脏的葡萄糖代谢，进而影响当天晚些时候的非肝葡萄糖摄取（NHGU）和糖原沉积的研究之一。这突显了肝脏对餐前几小时发生的胰岛素和胰高血糖素变化的敏感性，并强调了它们对随后细胞内底物分配和酶调节的重要性。这些发现表明，与胰岛素类似，之前的胰高血糖素暴露也会在肝脏中建立代谢记忆。在早晨胰高血糖素暴露后，下午的碳流从储存转向重新释放，从而减弱了胰岛素对第二餐效应的贡献。值得注意的是，非肝脏葡萄糖摄取在各个组之间没有变化，这表明这些流动变化是特定于肝脏葡萄糖代谢的，并没有改变外周葡萄糖的处置。尽管不同组之间的葡萄糖输注速率相似，但非肝脏葡萄糖摄取的相应差异并未达到统计学显著性。因此，我们不能排除先前胰高血糖素对外周葡萄糖处置有轻微影响的可能性；然而，由于缺乏显著性，加上在这些条件下全身葡萄糖利用的固有变异性，表明主要效应发生在肝脏。未来的研究将需要专门评估当前研究设计中未能解决的潜在的非肝脏组织中的微妙效应。

为了理解我们发现的分子机制，我们在研究过程中测量了肝脏葡萄糖激酶（GCK）的mRNA和蛋白质水平（基础水平、早晨之前以及下午时段结束时）。正如已知的胰岛素对GCK转录的影响所预期的那样，在胰岛素预处理开始5.5小时后，高胰岛素血症增加了AM INS组的GCK mRNA和蛋白质水平。然而，胰高血糖素在早晨时段阻断了胰岛素的转录和翻译效应。这与之前在培养的大鼠肝细胞中进行的体外研究结果一致，在这些研究中，胰高血糖素在超最大胰岛素条件下通过cAMP依赖途径迅速抑制了胰岛素刺激的GCK转录，在30-45分钟内减少了mRNA的积累。此外，在已经因长时间胰岛素暴露而诱导GCK转录的肝细胞中，胰高血糖素（或cAMP类似物）也加速了现有GCK mRNA的降解，半衰期约为45分钟。在下午的钳夹实验中，AM INS组的高胰岛素血症维持了早晨时段建立的GCK mRNA转录和降解的平衡，因此在330分钟和480分钟时间点GCK mRNA水平保持相似。结果，AM INS组的GCK蛋白质水平也保持升高。这表明两个时段内胰岛素依赖的GCK mRNA和蛋白质水平的稳态设定点相似。相比之下，在下午钳夹实验结束时，AM INS + GCG组的GCK mRNA水平升高，但蛋白质水平没有升高。这是预期之中的，因为我们之前已经表明，胰岛素诱导GCK蛋白质的增加通常需要两到四小时。因此，2.5小时的高胰岛素血症时段足以增加GCK mRNA水平，但不足以增加蛋白质水平。值得注意的是，尽管AM INS组和AM INS+GCG组在下午钳夹实验结束时的总肝脏GCK蛋白质水平相似，但在解释这些发现时考虑细胞内的定位是很重要的。葡萄糖激酶调节蛋白在低葡萄糖条件下通过将其隔离在细胞核中，并在葡萄糖充足时将其释放到细胞质中来动态调节GCK。因此，AM INS+GCG组中可能有更多的GCK存在于细胞质活性区室中，这可以解释为什么尽管总GCK蛋白质水平与基础组织相似，但HGU（肝葡萄糖摄取）仍然升高。这表明仅通过总蛋白质测量可能无法完全反映体内GCK的功能状态。早晨胰高血糖素如何干扰胰岛素驱动的GCK积累和肝脏葡萄糖流动的分子机制尚未完全了解，需要进一步研究。使用允许更详细机制探索的互补模型将有助于澄清这些过程。

几种分子机制可能导致了AM INS+GCG组中观察到的下午NHGU（非肝葡萄糖摄取）减少。其中最重要的是葡萄糖激酶，其活性与肝脏葡萄糖摄取直接相关。如上所述，AM INS+GCG组早晨胰高血糖素的升高减弱了胰岛素对当天晚些时候肝脏GCK mRNA和蛋白质的影响。这可能减少了葡萄糖的磷酸化，进而可能降低了AM INS+GCG组中G6P的可用性，从而限制了糖原合成和糖酵解的底物供应。下游酶（包括GS和GP）在去磷酸化和内在活性方面没有差异；然而，AM INS+GCG组中G6P池的减少预计会限制GS的别构激活并缓解GP活性的抑制，这些效应无法通过蛋白质丰度或活性测定完全捕捉到。此外，在AM INS+GCG组中，下午HIHG钳夹实验期间HGP（葡萄糖-6-磷酸酶）的抑制并不完全，而在AM INS组中则被有效抑制。由于两组之间的G6Pase活性相似，因此将G6P转化为葡萄糖的酶机制显然足以维持AM INS+GCG组的HGP活动，因此在AM INS组中它不是速率控制因素。相反，AM INS组中HGP的抑制可能是由于G6P被拉入糖原生成和糖酵解途径，这可能是由于GCK介导的G6P增加所致。相比之下，AM INS+GCG组中持续的HGP可能是由于糖原分解增加，这可能是由于GCK生成的G6P减少所致。这种流动模型与两组之间G6P和糖原净流动的差异一致，因为糖异生流动很小且相当。重要的是，流动测量比静态分子读数更能准确反映肝脏的葡萄糖处理情况。总的来说，这些结果表明，之前的胰高血糖素重新编程了肝脏的葡萄糖流动，可能是通过影响GCK来实现的，从而限制了糖原合成和糖酵解的底物供应。

在解释这些发现时，有几个点需要考虑。首先，固定时间点的组织分析可能错过了瞬态流动调节因子或动态酶活性，因为稳态蛋白质丰度和体外酶测定无法完全捕捉底物池的别构调节或区室化。虽然我们之前已经在狗身上证明高胰高血糖血症在高血糖条件下能迅速且持续地提高肝脏G6P水平，但在高胰岛素血症-高血糖钳夹实验期间动态的细胞内G6P池难以通过我们的当前测定可靠地捕捉到，因为快速的葡萄糖摄取和磷酸化可以在几分钟内改变G6P含量。尽管如此，GCK表达、NHGU（非肝葡萄糖摄取）和糖原合成的减少强烈表明AM INS+GCG组中G6P的可用性发生了变化，这与机制预测一致。未来研究将有助于了解细胞内区室化、与糖原相关的微域以及糖原酶的别构调节，以便全面理解第二餐现象下的肝脏葡萄糖保留情况。钳夹实验的优势在于能够严格调控激素和底物浓度，从而精确评估它们对肝脏葡萄糖代谢的影响。然而，需要注意的是，我们的实验设计涉及早晨4小时的持续胰高血糖素升高以及同时的高胰岛素血症，这并不能完全复制典型混合餐或高蛋白餐引发的动态激素环境，在这种环境中，胰高血糖素通常在1到2小时内根据餐食组成而上升和下降。因此，虽然我们的发现阐明了持续胰高血糖素暴露在重新编程肝脏葡萄糖流动中的作用，但它们可能无法直接预测生理饮食条件下第二餐效应的幅度或时间。此外，由于经典的Staub-Traugott范式使用相同的餐食，因此当连续餐食不同时（如早餐、午餐和晚餐），这些机制如何运作仍不清楚。犬类模型因其独特的肝脏和肠道血管通路而具有研究钳夹和餐食条件的灵活性。在这项研究中，我们使用钳夹实验来分离早晨胰岛素和胰高血糖素的直接效应，以便在未来的研究中加入混合餐的复杂性之前评估各自的贡献。此外，虽然高胰高血糖血症被建模为维持生理胰岛素与胰高血糖素的摩尔比，但这种方法可能无法完全复制混合餐或高蛋白餐期间胰高血糖素释放的时间、幅度或动态。尽管取得了显著进展，但胰高血糖素的许多生理方面仍然知之甚少，特别是它与其他激素的相互作用及其在肝脏和全身代谢途径中的多种作用。继续研究对于揭示这些复杂性并指导针对胰高血糖素信号传导的有效疗法的开发非常重要。

总之，早晨的胰高血糖素暴露会在肝脏中建立代谢记忆，重新编程葡萄糖代谢并影响当天晚些时候的葡萄糖稳态。具体来说，早晨的胰高血糖素降低了下午的NHGU，限制了糖原合成，并减弱了下午HIHG钳夹实验期间HGP的抑制。这种效应可能反映了胰岛素刺激的GCK诱导的葡萄糖磷酸化的限制，这可能限制了糖原合成和糖酵解的底物供应。重要的是，非肝脏葡萄糖摄取在各个组之间没有变化，表明这些效应主要局限于肝脏，没有影响外周组织的葡萄糖处置。这些发现将胰高血糖素确定为肝脏葡萄糖分配的关键调节因子，并强调了早期餐食相关的胰岛素-胰高血糖素相互作用在塑造肝脏对后续餐食反应中的关键作用。