通过多菌株细菌接种提高桉树幼苗的质量

《World Journal of Microbiology and Biotechnology》：Enhancing Eucalyptus seedling quality through multi-strain bacterial inoculation

　　摘要
在林业中使用细菌接种剂是一种有前景的策略，可以提升幼苗质量、降低成本并促进可持续栽培。本研究评估了一种多菌株细菌联合体对桉树幼苗的影响，考虑了植物生长、微生物群落组成和幼苗质量。该联合体由五个细菌属各选取一个代表菌株组成——枯草芽孢杆菌（Bacillus）、Paenibacillus、Paraburkholderia、甲基杆菌（Methylobacterium）和中间根瘤菌（Mesorhizobium），并将其应用于三种桉树克隆株。在一家苗木苗圃进行了大规模的田间实验。为了评估根内生微生物群落的组成，对样本进行了处理，并使用16S rRNA宏条形码测序技术来分析存在的细菌群落。13周后，我们评估了微生物多样性、幼苗的形态特征和存活率。虽然接种并未显著影响细菌的丰富度和多样性，但它改变了根部的微生物群落结构。有两个基因型的幼苗质量有所提高，其中较高比例的幼苗被归类为优质等级，其中一个基因型的死亡率显著降低（从21.8%降至6.7%）。此外，接种后的幼苗中Ralstonia属细菌的相对丰度也有所减少，而Ralstonia属包含一些导致桉树萎蔫病的维管植物病原体。生物量分配模式也有所不同，表明不同基因型对接种的反应存在差异。这些发现强调了细菌联合体提升桉树幼苗抗逆性和生产力的潜力，为传统林业实践提供了一种可持续的替代方案。

引言
桉树是巴西林业中主要的树种，2023年其种植面积占全国栽培总面积（1050万公顷）的74%（780万公顷）（IBá 2024）。桉树种植园遍布巴西全国，尤其是在东南部和中西部地区。选择桉树作为原材料来源的原因在于其多种优点，如营养需求低、生长速度快、种植密度高、木材质量好、能够再生以及易于生产幼苗（Embrapa 2019；Surbhi et al. 2023），同时它还能很好地适应该国的土壤和气候条件。尽管巴西的森林种植面积仅占总面积的不到1%，但桉树占据了大部分栽培土地。然而，这些人工林提供了91%用于生产目的的木材，尤其是纤维素生产（Embrapa 2019）。这一显著的生产潜力体现在巴西成为2021年世界最大纸浆出口国的业绩指标上（IBá 2023）。尽管种植面积达到了创纪录的生产水平，但原材料生产成本却大幅上升。从2020年12月到2021年12月，木材生产成本增加了94%，这对林业行业的盈利能力构成了重大障碍（IBá 2022）。害虫和疾病侵扰、恶劣的天气条件以及缺乏适当的管理也会对森林生产产生负面影响（Booth 2013；Guo et al. 2023）。
鉴于桉树的经济重要性以及对纤维素衍生产品的持续需求，人们正在寻求新技术来维持和/或提高生产力，同时减少化学投入的使用。这有助于实现更可持续的栽培和更高的利润（Eggers et al. 2020）。多项研究表明，使用促进植物生长的细菌对植物生长和发育有积极影响，并能增强其对潜在环境压力的耐受性（Backer et al. 2018；Nwigwe et al. 2023）。这些微生物有助于植物激素的产生、养分溶解和矿化、通过铁载体进行铁螯合，以及合成抑制植物病原体生长和植物防御反应的代谢物（Bashan and De-Bashan 2005；Cardoso and Andreote 2016；Olanrewaju et al. 2017；Gouda et al. 2018；Chaín et al. 2020）。定植在植物内部组织中的微生物（称为内生菌）与宿主建立了更为紧密和稳定的系统相互作用。这种密切关联有助于调节生理和代谢过程，通常会对植物营养、根系结构以及对生物和非生物胁迫的耐受性产生显著影响（Abbamondi et al. 2016；Afzal et al. 2019）。认识到微生物在植物应用中的有益潜力，人们提出将这些微生物以接种剂的形式用于更可持续的种植园（Gouda et al. 2018）。
在多种作物中，如大豆、玉米和甘蔗中，应用微生物接种剂已成为一种成熟的实践。例如，用日本根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）接种大豆可以持续增强根瘤形成和生产力（Henrique et al. 2019）。在甘蔗中，用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）接种可以提高磷的吸收，从而将推荐的P?O?施肥量减少多达75%（Rosa et al. 2022）。在林业种植区，也进行了多项相关研究。例如，从桉树属中分离出的根瘤菌菌株已被证明可以通过增加根系生物量和桉树插条的生长来促进生根（Mafia et al. 2007a, b），并减少由Puccinia psidii引起的锈病（Mafia et al. 2009）和由Ralstonia solanacearum引起的细菌性萎蔫（Santiago et al. 2015）。有证据表明，用促进生长的细菌（如枯草芽孢杆菌）接种Pinus taeda幼苗可以显著增加根部和茎部的生物量，从而增强其对田间条件的适应能力（Santos et al. 2018）。此外，细菌接种还显示出能够促进难以生根的桉树插条生根，其效果可与吲哚-3-丁酸（IBá）处理相当（Nwigwe et al. 2023）。同样，接种固氮菌株也能增加植物的高度和直径（Souza et al. 2022）。综合这些发现表明，在林业中使用接种剂可以带来环境、社会和经济上的优势，包括提高生产力、降低成本、减少对进口投入的依赖以及改善土壤健康和质量（Sammauria et al. 2020；Gomes et al. 2025）。
为了补充这些研究，有必要评估幼苗中的细菌群落，以了解接种剂如何随时间重塑与根部相关的微生物群落。这一知识空白在林业领域尤为重要，因为在大规模田间实验中，需要综合方法将植物表现与细菌群落动态结合起来。解决这些限制对于评估接种剂的直接生长促进效果及其长期的生态兼容性和增强桉树栽培抗逆性的潜力至关重要。

在先前的研究（Fonseca 2014, 2020）中，开发了一种由五个菌株组成的细菌联合体，这些菌株来自枯草芽孢杆菌、Paenibacillus、Paraburkholderia、甲基杆菌和中间根瘤菌属。这些细菌因其在磷酸盐溶解测试中的优异表现而被选中，其中一些菌株含有nifH基因（表明具有潜在的固氮能力）并能够产生吲哚化合物。在温室条件下，它们表现出良好的效果，提高了植物的存活率、生物量和生长。
在这项研究中，我们旨在了解将这种细菌联合体应用于苗木对不同桉树基因型的影响，实验在一家苗木苗圃进行。此外，我们假设该联合体的应用：（i）会改变接种幼苗与未接种幼苗根部的微生物模式；（ii）会改变根部分布的细菌属组成；（iii）会促进幼苗的发育。这些假设基于这样一个前提：引入有益的微生物联合体可以调节宿主的根际微生物组，影响接种菌株的建立和相对丰度，从而通过多种促进植物生长的机制来改善植物的生长和发育。

方法论
实验设计
选择了三种桉树克隆基因型（分别称为X、Y和Z），在一家苗木苗圃进行大规模田间实验，以评估细菌接种对幼苗表现的影响。这些基因型的选择基于合作公司提供的特征：基因型X（E. urophylla × E. grandis杂交种）的生根能力较差；基因型Y（E. urophylla）表现出快速的种植后生长；基因型Z（E. urophylla）的顶端枝条脱落率较高。这些对比鲜明的表型特性为评估植物-微生物相互作用提供了合适的基础。
实验采用了因子设计，有两个因素：基因型（X、Y和Z）和接种情况（是否使用细菌接种剂），共计六种处理方式。这六种处理方式被分配到六个随机区块中；每个区块包含176株幼苗（每种处理方式1,056株）。每种基因型评估了2,112株幼苗，其中1,056株接种了细菌接种剂，1,056株未接种，实验中共有6,336株幼苗。
对照幼苗接受了与接种幼苗相同的管理条件，只是灌溉使用不含细菌接种剂的水。

接种剂制备
为了制备接种剂，分别将属于枯草芽孢杆菌、Paenibacillus、Paraburkholderia、甲基杆菌和中间根瘤菌属的五个菌株在液体培养基（Phytate Low）中培养，遵循Fonseca（2018, 2020）和Salles（2021）描述的协议。培养物在30°C下培养48小时，并以150 rpm的速度持续搅拌。这些菌株最初是从桉树属的根际和根部分离出来的，并在先前的研究中确定了其分类和特征（Fonseca 2014, 2020；Fonseca et al. 2018）。
该联合体包含五个菌株，包括枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、Paraburkholderia caribensis和Methylobacterium tardum，以及两个基于宏基因组组装基因组（MAG）分析被认为是新物种的Paenibacillus和Mesorhizobium属菌株。选择这些菌株是为了形成一个综合菌群，因为它们在氮循环和根际定植方面具有互补的功能特性。在先前的研究中，这些菌株主要是作为联合体进行评估的，而不是单独作为接种剂（Fonseca 2014, 2020；Fonseca et al. 2018）。
培养结束后，通过分光光度计在600 nm处测量光密度（OD）来量化细菌生长。根据OD值，收集所需的每种培养物体积，并以10,000 × g的离心速度离心5分钟以浓缩细胞，然后分别转移到实验地点。根据OD测量结果，收集所需的每种培养物体积，并以10,000 × g的离心速度离心5分钟以浓缩细胞。得到的沉淀物重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水（PBS 1×）中，所有菌株的OD值调整至相同。然后将等体积的标准化悬浮液混合，最终制备出十升PBS（137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na?HPO?, 1.8 mM KH?PO?；pH 7.4）中的联合体。混合和稀释后，最终溶液的OD值为0.1（大约每株10? CFU mL?1），具体方法如Fonseca（2020）所述。

实验设置
实验在巴西巴伊亚州Entre Rios的一家林业公司设施进行。用于繁殖的苗木材料来自半水培系统中的迷你树桩衍生的迷你插条。收集后立即将迷你插条储存在保温箱中以保持活力，直到种植。
繁殖是在装有Carolina Soil?商业基质的55 cm3聚丙烯管中进行的，然后进行灌溉。细菌接种剂预先在PBS中稀释后，使用浇水壶均匀地施加到每个试管中的培养基上。随后，这些试管被放置在托盘中，并在苗圃条件下进行培养以促进幼苗的生长。幼苗在标准的苗圃条件下生长，经历不同的发育阶段。在克隆迷你花园阶段，植物处于环境条件下，相对湿度通常超过80%，平均温度约为23°C。种植后，幼苗被转移到温室环境中，相对湿度接近饱和（约100%），温度通过自动通风系统控制在25至32°C之间；这一阶段持续20天。之后，幼苗被移至遮荫室（30%的遮荫度）进行适应，继续在环境温度和湿度下生长20天。最后，幼苗在环境条件下经历一个硬化阶段，共计91天的苗圃期。

实验持续了13周，在此期间定期对幼苗进行评估和分类。实验结束时，根据形态发育情况将幼苗分为三类：A类——生长旺盛且结构特征最佳的幼苗；B类——生长适中，符合田间种植标准的幼苗；C类——发育不足，不符合田间种植最低要求的幼苗。被分类为A类和B类的幼苗被认为适合进行田间移植。相比之下，C类幼苗则留在苗圃中进一步培养，以促进生长并有可能重新分类。在评估期间，那些茎部弯曲严重（定义为与垂直轴的偏差大于45°）或死亡的幼苗被计为死亡。在13周结束时，从每个处理组中随机选取一部分幼苗进行详细的形态分析。具体来说，每个处理组随机选取了180株A类幼苗和120株B类幼苗。对于基因型X，由于B类幼苗数量较少，因此只选取了20株幼苗进行进一步分析。

为了评估植物生物量，将选定的幼苗的地上部分与根部分离并放入纸袋中，然后在60°C的强制通风烤箱中干燥72小时。根部系统用清水仔细清洗以去除残留的培养基，避免损伤细根结构，随后也放入纸袋中在相同条件下干燥。干燥后，使用分析天平测定茎和根部分的干重。

### 幼苗根内生细菌群落的分析

为了评估接种剂对桉树根内生细菌群落的影响，选取了一部分幼苗进行16S rRNA基因的测序宏条形码分析。每组随机选取30株幼苗，包括A类的3株和B类的2株。这些样本在实验结束时被收集并送往实验室进行分子分析。

在实验室中，使用无菌剪刀从每株幼苗上切下根部片段，并仔细清洗以去除表面的残留培养基和肥料。然后按照Araújo等人（2001年）的方法进行消毒处理，该方法旨在消除附生微生物的同时保留内生细菌群落。首先用流水冲洗根部以去除颗粒物，然后在70%乙醇（30毫升）中浸泡一分钟，接着在2%次氯酸钠溶液（30毫升）中浸泡两分钟。随后，在层流罩中暴露于紫外线（UV）下五分钟。再进行一次70%乙醇（30毫升）的冲洗一分钟，接着连续用无菌蒸馏水（每次30毫升）冲洗五次以去除任何残留的消毒剂。表面消毒后，将根部组织冷冻在液氮中，并使用无菌研钵和杵进行捣碎。捣碎后的材料储存在-20°C下，准备后续的DNA提取和分子分析。

### DNA的提取和纯化

从根部捣碎的材料中提取DNA，使用MoBio Laboratories（美国加利福尼亚州）的PowerSoil? DNA分离试剂盒按照制造商的协议进行。每次提取使用200毫克捣碎的根部材料。包括一个不含植物组织的阴性对照，以监测潜在的污染。

使用通用细菌引物27F（5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′）和1492R（5′-GTT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′）来扩增16S rRNA基因（Lane, 1991）。进行质量控制步骤以验证DNA提取的效率。PCR产物随后进行琼脂糖凝胶电泳（1.6%），以确认扩增片段的存在和预期大小。验证后，根据制造商的说明，使用Wizard? SV Gel和PCR Clean-Up系统（Promega Corporation，美国）对PCR产物进行纯化。简而言之，将PCR产物与膜结合溶液混合后转移到硅胶膜旋转柱中，DNA会结合到膜上。旋转柱离心以使DNA结合，然后丢弃流出的液体。接着加入膜洗涤液洗涤结合的DNA，再离心以去除引物、核苷酸、酶和盐等污染物。此洗涤步骤重复两次以确保有效去除残留杂质。最后，通过向柱中加入超纯水进行离心，收集含有高纯度DNA的洗脱液。使用Qubit? 4荧光计（Thermo Fisher Scientific?）测定纯化DNA的浓度和质量，并将DNA储存在-20°C直到测序。

### 16S rRNA基因V5–V7高变区的测序

纯化的DNA样本被提交进行测序，该区域常用于分析细菌内生菌。扩增使用引物对799F（5’-AACMGGATTAGATACCCKG-3’）和1193R（5’-ACGTCATCCCCACCTTCC-3’），方法参考Redford等人（2010年）的描述。PCR条件如下：98°C预热一分钟；98°C循环30次，每次30秒；50°C循环30秒；72°C循环30秒；最后72°C循环五分钟。每个反应体系中含有15微升Phusion High-Fidelity PCR Master Mix和GC缓冲液（New England Biolabs，美国），每种引物3微升（6微摩尔），10微克gDNA（5~10纳克）和2微升超纯H2O。测序由Novogene Corporation（美国萨克拉门托）在Illumina NovaSeq 6000平台上进行（100 K对末端250 bp读取，Illumina，美国），遵循制造商的文库制备和测序协议。

### 生物信息学分析

宏条形码DNA测序分析使用Mothur v.1.46.1（Schloss等人，2009年）进行处理。修剪引物和条形码序列，并组装配对末端读取。低质量序列（包含模糊碱基、超过八个同聚物或长度超出预期范围（最小长度=372，最大长度=385）的序列被丢弃。高质量读取与SILVA SSU参考数据库v.138（Quast等人，2013年）对齐，仅保留对齐一致的序列。所有序列都被修剪到相同的起始和结束位置以确保可比性。应用预聚类方法合并相差最多三个碱基对的读取，然后使用chimera.vsearch（Rognes等人，2016年）检测并移除嵌合体。使用Ribosomal Database Project v.18（Cole等人，2009年）进行分类学分类，采用80%的自举置信阈值。排除被分配到线粒体、叶绿体、真核生物、古菌或未分类域的序列。剩余的读取在97%的相似性截止值下聚类为OTU，并移除单倍体。随后使用decontam R包（Davis等人，2018年）通过结合流行度和频率的方法对OTU分布矩阵进行清理，以消除潜在的污染物。最后，通过稀释到最小样本量（每个样本3,249个读取）来标准化数据集，以减少由于测序深度不均造成的偏差。

### 统计分析

α多样性指数（OTU）和多样性（Shannon指数）使用Past 5软件（Hammer等人，2001年）进行双向方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验。此外，还进行了Levene检验以验证所有数据的同方差性。处理组之间的平均值比较考虑了0.05的概率水平。

为了检测门和属水平的分类群丰度差异，使用ACOM-BC-2（带有偏差校正的微生物组组成分析）（Lin和Peddada，2024年）进行差异丰度分析，该方法明确考虑了扩增子测序数据的组成特性并校正了采样比例偏差。所有分析都是在未稀释的原始计数表上进行的，遵循当前关于微生物组差异丰度分析的建议。分析在门和属两个水平上进行。在属水平上，只保留了在所有样本中累积丰度≥100读取的属。此外，排除了在任何实验组内显示零变异的分类群（由接种×基因型组合定义），以便正确拟合模型。差异丰度使用双向固定效应模型进行评估，公式为：丰度～接种×基因型，其中接种（接种组 vs. 对照组）和基因型（X, Y, Z）作为分类预测因子。P值使用Benjamini–Hochberg假发现率（FDR）程序进行调整，所有统计推断基于调整后的p值（q值），显著性阈值设为q<0.05。

差异丰度分析使用了标准的ACOM-BC-2测试（diff）和敏感性分析（diff_robust=TRUE），后者评估结果对零处理的稳健性。只有在敏感性分析中通过的检查的分类群被视为显著差异丰富的。在敏感性分析之前被识别为显著但在稳健性标准中未通过的分类群被归类为非稳健差异。为了进一步检验基因型效应，使用了来自全局模型的额外成对基因型对比（Y vs. X, Z vs. X）以及针对接种调整的独立两组ACOM-BC-2模型。

为了展示群落成分的平均相对丰度，使用Past 5软件创建了热图。在地图中，较暖的颜色（红色）表示特定分类群的增加，而较冷的颜色（蓝色）表示该分类群在处理中的减少。同样的数据也使用Z-Score表示，指示特定数量相对于数据平均值的变化情况。这种变化可以是低于平均值（负Z分数）或高于平均值（正Z分数），在热图的右侧以灰色球体显示。

还进行了二维的非度量多维缩放（nMDS）分析，考虑了所有处理和基因型。使用Past 4.03软件进行统计分析和排序，使用了Bray-Curtis差异指数进行排列多变量分析（PERMANOVA），以测试样本之间的差异。

使用卡方独立性检验评估了接种处理和非接种处理之间幼苗形态类别（A、B、C和死亡）的分布差异。由于响应变量是分类频率数据，因此分别对每个基因型进行了分析。当检测到显著差异时，检查标准化残差以确定哪些形态类别对观察到的卡方统计量贡献最大，从而详细解释每个基因型内的处理效应。统计显著性在p<0.05的水平上进行评估。

为了分析植物的形态特征（高度、直径、叶片数量、生物量重量），使用Shapiro-Wilk检验评估数据的正态性。对于符合正态分布的数据（Shapiro-Wilk检验中p>0.05），应用Student’s t检验。这种参数检验用于比较两组之间的均值。这些数据用星号（‘*’标记。对于不符合正态分布的数据（Shapiro-Wilk检验中p<0.05），使用Mann-Whitney检验。这种非参数检验适用于当不满足正态性假设时比较两个独立样本。这些数据用加号（‘+’）表示。此外，图表中还展示了代表平均值±标准差的误差条，以指示每种评估条件下的数据变异性。箱线图是使用PAST软件生成的，用于可视化数据分布和潜在的异常值。

**幼苗质量等级的变化**

通过将个体分为“A”（生长旺盛且结构最佳）、“B”（适合田间种植的合理生长）、“C”（低于最低质量阈值）和“死亡”（不可存活）三类，对不同处理下的幼苗进行了形态分类（图1）。接种显著改变了形态类别的分布，且不同基因型的响应程度和性质各不相同。

**图1**
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。
**全尺寸图像**
每个条形代表每个形态类别中幼苗的平均比例，附带标准误差，基于每组176株幼苗的六个处理。处理对应三种桉树基因型（X、Y和Z），分别为接种组（i）或未接种对照组（c）。
- **类别A**：生长旺盛且结构最佳的幼苗；
- **类别B**：生长适中，符合田间种植标准的幼苗；
- **类别C**：发育不足，不符合田间种植最低标准的幼苗；
- **死亡**：不可存活的幼苗。
对每个处理内各组观察到的计数进行了卡方检验（n=1,056株幼苗/处理）。星号（*）表示处理之间的显著差异（p<0.05）。

对于基因型Z，接种导致类别分布发生了显著变化（卡方检验，p<0.001）。接种组的幼苗中有更高比例被归类为类别A（69.9%），而对照组为53.9%；同时类别B的比例显著减少（21.8%对比39.5%）。死亡率保持较低，处理间无显著差异（接种组7.2%对比对照组6.2%）。标准化残差分析表明，类别A和B是总体卡方信号的主要贡献者。

基因型Y也表现出类似的强烈响应（卡方检验，p<0.001），接种与幼苗生长活力的提升和死亡率的降低有关。在该基因型中，死亡幼苗的比例从对照组的21.8%显著下降到接种后的6.7%，而类别A和B的幼苗比例相应增加。标准化残差分析确认了这些差异的主要驱动因素。

相比之下，基因型X对接种的反应较为温和但仍然显著（卡方检验，p=0.001）。接种组的幼苗中类别A的比例略有增加（85.6%对比对照组的82.0%），而类别B的比例减少（5.2%对比8.4%），但死亡率在处理间无显著差异（接种组8.6%对比对照组9.3%）。标准化残差分析表明，基因型X的显著效应主要由类别B的变化引起。

**根内细菌组成的模式**

基于Bray–Curtis差异的非度量多维缩放（nMDS）显示，接种后细菌群落结构发生了显著变化（双因素PERMANOVA，F=2.7509，p=0.0069）（图2）。接种组（Xi、Yi和Zi）形成了独特的群集，与各自的对照组（Xc、Yc和Zc）分离，后者之间的聚集更为紧密。F值表明接种对群落组成有中等但一致的影响。相比之下，植物基因型对细菌组合没有显著影响（F=1.3936，p=0.1126），也未检测到接种与基因型之间的显著交互作用（F=1.4464，p=0.1006）。

**图2**
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。
**全尺寸图像**
使用Bray–Curtis差异指数对所有样本中的OTU分布矩阵进行了非度量多维缩放（nMDS）。处理对应三种桉树基因型（X、Y和Z），分别为接种组（i）或未接种对照组（c）。样本颜色表示如下：Xc（浅绿色）、Xi（深绿色）、Yc（粉色）、Yi（紫色）、Zc（黄色）和Zi（橙色）。对所有样本进行了双因素PERMANOVA分析，考虑了接种和基因型作为因素。

桉树幼苗的根内细菌组成在处理间表现出较低的丰富度和多样性。平均OTU数量在180到200之间，Shannon多样性值在2.41（Xi）到2.67（Yi）之间变化，且与植物基因型无关（补充图1）。

在门水平上，Proteobacteria和Actinobacteria在所有基因型中占主导地位（补充图2和补充表2）。在较低的分类学分辨率下，共鉴定出409个细菌分类单元，主要在属水平。最丰富的分类单元（相对丰度>1%）包括Ralstonia、Chromobacteriaceae_unclassified、Paraburkholderia、Streptomyces、Novosphingobium、Rhodanobacteraceae_unclassified、Actinospica、Enterobacteriaceae_unclassified和Nocardia（图3和补充表1）。

**图3**
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。
**全尺寸图像**
热图显示了不同处理下桉树幼苗根内细菌群落中优势细菌属的相对差异，使用Z分数计算（n=5/处理）。黑色圆圈表示每个属的平均相对丰度（n=15），圆圈大小与丰度成正比。处理对应三种桉树基因型（X、Y和Z），分别为接种组（i）或未接种对照组（c）。使用ACOM-BC-2方法评估了处理间的差异，考虑了接种的主要效应、基因型对比以及接种×基因型的交互作用项。P值使用Benjamini–Hochberg假发现率（FDR）进行了调整，所有推断均基于调整后的p值（q值）。星号（*）表示在敏感性分析前显示探索性差异丰度信号的分类单元，双星号（**）表示探索性与基因型相关的趋势。经过ACOM-BC-2敏感性分析后，没有分类单元被确定为显著差异丰富的。

使用ACOM-BC-2对未稀疏化的计数数据进行了差异丰度分析，应用了包含接种、基因型及其交互作用的双因素模型。在假发现率（FDR）校正和ACOM-BC-2敏感性分析后，没有分类单元在接种、基因型或其交互作用的主要效应下被确定为显著差异丰富的（diff_robust=FALSE），表明在考虑组成性的框架下，门水平的群落组成变化并不稳健。

同样，经过敏感性分析后，没有分类单元被确定为接种、基因型或接种×基因型交互作用的显著差异丰富。然而，由于ACOM-BC-2的稳健性评估故意较为保守，特别是对于包含许多零值的稀疏计数数据，我们还额外检查了在敏感性过滤前显示探索性非稳健趋势的分类单元。表S3中提供了在接种主要效应下显示非稳健差异丰度信号的详细结果。在属水平上，有11个分类单元（包括未分类的谱系）与接种组和对照组幼苗之间的非稳健差异丰度模式相关。在I vs. C对比中，Neisseriales_unclassified、Mesorhizobium、Bosea、Rhodopseudomonas、Reyranella和Bacteroidota_unclassified显示出正的对数2FC值，表明接种组幼苗的丰度较高。相反，Enterobacteriaceae_unclassified、Pseudomonadaceae_unclassified、Gryllotalpicola、Undibacter和Thermoactinomyces显示出负的对数2FC值，表明对照组幼苗的丰度较高。

关于基因型效应，在全局模型中，Y vs. X对比检测到非稳健趋势（13个属），而Z vs. X对比未观察到趋势。从全局模型中得出的另一个对比进一步确定了四个属（Agrobacterium、Actinomadura、Actinoplanes和Humibacter），显示出Z和Y之间的基因型相关趋势，其中Agrobacterium在Z中的丰度较高，而其余属在Z中的丰度低于Y。此外，三个属（Rhodopseudomonas、Reyranella和Actinomadura）在接种×基因型交互作用中显示出非稳健趋势，表明接种的响应依赖于基因型。所有非稳健信号均作为探索性结果提供在补充表3中。在基因型Y和Z中，接种组幼苗的Ralstonia属相对丰度倾向于低于对照组幼苗，其中基因型Y的差异最为显著，平均相对丰度大约低34%（补充图3）。然而，在考虑组成性的ACOM-BC-2分析中，这种模式并未被统计上确定为显著，因此应解释为描述性的、非稳健的趋势。

我们特别评估了组成接种菌群的细菌属的相对丰度。总体而言，除了Mesorhizobium属在接种组中的平均相对丰度有所增加外，接种组中没有这些属的相对丰度出现一致性的增加（图3）。

**幼苗的形态响应**

我们通过形态指标评估了幼苗的发育情况，包括植株高度、茎直径、叶片数量以及生物量分配（茎、叶和根的干重）。为了捕捉接种与内在幼苗质量之间的潜在相互作用，根据“A”（优秀）和“B”（良好）两类分别分析了植株。接种对三种基因型的高度和茎直径均产生了显著影响，尽管效应的方向取决于基因型和幼苗质量等级。在基因型X中，类别“A”的幼苗在对照组中更高，而接种组的幼苗显示更大的茎直径。对于基因型Y，接种组的类别“A”幼苗倾向于更高，而类别“B”的幼苗在对照组中更高（图4）。尽管高度存在这种变化，但该基因型的对照组幼苗的茎直径始终较大。

**图4**
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。
**全尺寸图像**
对不同处理下的桉树幼苗进行了形态分析。图“A”代表高度（cm），“B”代表茎直径（mm），“C”代表叶片数量，“D”代表茎干重，“E”代表叶干重，“F”代表根干重。奇数编号的处理代表接种组幼苗，偶数编号的处理代表对照组。每个处理代码中的最后一个字母（A或B）代表公司确定的幼苗质量，其中“A”表示优秀质量，“B”表示良好质量。使用Shapiro-Wilk检验评估了数据的正态性。对于正态分布的数据（标有‘*’），应用了学生t检验；对于非正态分布的数据（标有‘+’），使用了Mann-Whitney检验。条形代表平均值±标准差。

叶片数量仅在基因型X和Y中受到接种的显著影响，但方向相反：基因型X的对照组幼苗具有更多的叶片，而基因型Y的接种组幼苗表现出更好的叶片发育（图4C）。关于生物量，接种效应具有特征和基因型特异性。茎干重仅在基因型Z的类别“A”幼苗中显著增加，接种组的表现优于对照组。叶干重仅在基因型Y的类别“A”和“B”中通过接种得到增强（图4D）。最后，根干重在基因型Y和Z的类别“A”幼苗中受到显著影响，接种组表现出更好的生物量积累（图4F）。

总体而言，这些结果表明接种根据基因型和幼苗质量等级差异调节了形态特征，表明基因型×接种×质量之间的复杂交互作用影响了生长分配模式（图4）。

**讨论**

使用细菌接种剂是一种可持续的替代传统施肥、害虫控制和疾病控制的方法，有助于减少化学投入，降低环境影响，并提高农业系统的长期可持续性（Santos和Olivares 2021）。在这项研究中，我们评估了多菌株细菌联合接种对桉树幼苗发育及其根内细菌群落组成的影响。总体而言，我们证明接种效应依赖于基因型，能够改变某些微生物特征并提高幼苗质量。尽管接种并未显著改变细菌的丰富度或α多样性，但它重构了与根相关的细菌群落组成，如nMDS排序和PERMANOVA分析所示。这种群落层面的重组模式没有伴随多样性指数的变化，这与微生物生态学中的先前发现一致，即功能重组而非分类学扩展驱动了植物-微生物相互作用（Cardoso和Andreote 2016；Compant等人2019）。

尽管发生了这些组成变化，但处理间的整体细菌谱型保持相似，且基因型间未检测到显著差异。这种一致性可以通过桉树克隆之间的遗传接近性来解释，同时也由于所有幼苗都在相同的环境和管理条件下培养。已知诸如基质组成、灌溉制度和苗圃微气候等共享因素会强烈限制细菌组成的分化（Zhang等人，2022年）。在与接种相关的分类单元中，只有中型根瘤菌（Mesorhizobium）在所有接种处理中都表现出一致的增加，这表明它们成功地在幼苗的内生环境中定植并建立了种群。考虑到中型根瘤菌在生物固氮、植物激素生产（例如IAA、细胞分裂素、赤霉素）和磷酸盐溶解方面的已知作用，它们在内生区内的持续存在可能提供长期的生理效益（Gopalakrishnan等人，2015年；García-Pérez等人，2024年；Camacho等人，2025年）。尽管中型根瘤菌在所有接种处理中都有所增加，但实验后并未进行全基因组测序以追踪这些菌株，这限制了确认整个实验期间合成微生物群落（SynCom）成员的持久性。未来包含这种分析的实验对于确认接种成员在实验后的存在非常重要。即使没有确认接种成员的存在，它们在内生区内的持续存在也可能提供长期的生理益处。其他接种菌株没有表现出类似的模式，这与Fazolato等人（2025年）的研究结果一致，他们观察到用细菌联合体接种的Atriplex nummularia也有类似的结果。在这两种情况下，接种菌株似乎主要是通过暂时性的植物代谢调节来发挥其作用，而不是通过稳定的定植或对原生微生物群落的永久性重构。这一现象说明了植物-微生物系统的一个反复出现的特征，即功能效益先于分类学上的持久性，表明生长促进可能是由于短期信号传导或启动效应，而不是长期的微生物建立（Albright等人，2022年；Chen等人，2022年）。微生物持久性与植物反应之间的分离表明，接种剂的效果更多地取决于触发系统性植物反应的能力，包括激素调节、抗氧化激活和养分再利用（Chakraborti等人，2022年；Kang等人，2019年）。本研究中使用的细菌菌株最初是从桉树根部分离出来的内生菌，这支持了我们将根内生层作为目标微生境的重点。通过研究这些菌株获得的相同微生境，我们旨在最大化生态兼容性和成功定植的可能性。然而，未来探索其他与根相关的微生境（如根际）的研究可能会提供关于植物-微生物相互作用的互补视角。此外，未来的研究应该结合宏转录组学和代谢组学分析，以阐明这些短暂但生理上有效的微生物对宿主植物的影响机制。还需要注意的是，细菌组成仅在实验结束时进行了分析，这意味着接种剂的影响可能在不同植物发育阶段有所不同。细菌丰富度和多样性的时间波动通常反映了对外部管理实践变化、养分可用性和植物生理状态的动态响应（Li等人，2021年）。因此，在91天后没有检测到联合体属的平均相对丰度增加，并不一定表明接种菌株没有早期定植，也不排除它们对群落结构和植物生理的短暂影响（Moore等人，2022年）。未来的研究应该调查微生物定植的早期阶段，因为初始的群落组装可能在决定接种的长期持久性和功能结果方面起着关键作用。本研究中观察到的形态结果强调了在使用微生物联合体时需要针对基因型进行特定方法的重要性。对于基因型Y，死亡率显著降低（从21.8%降至6.7%），导致被分类为“A”和“B”的幼苗比例增加，直接有利于生产，减少了损失并增加了适合种植的幼苗数量。对于基因型Z，接种改变了幼苗的质量分布，减少了“B”幼苗的数量（从39%降至21%），增加了“A”幼苗的比例（从54%升至68%），表明该基因型的最终质量显著改善。相比之下，基因型X对接种的反应最小。值得注意的是，在分析中，“A”和“B”类别被合并在一起，因为两者都代表适合田间种植的幼苗。这一决定反映了林业中的实际应用，在正常条件下，这两个类别的植物都会被用于种植。鉴于此，为了更全面地了解细菌群落的动态，我们选择将这些类别合并进行扩增子测序，以便专注于预计在田间条件下表现相似的幼苗。然而，其在对照条件下的基线表现已经很高，几乎没有进一步改进的生理空间。这种模式强调了微生物效益的大小取决于宿主的初始生理状态，基线表现更好的基因型可能对接种的反应不那么明显。这些发现强调了在设计用于林业应用的微生物联合体时选择响应性宿主基因型的重要性，确保接种效益在大型田间试验中既可测量又在农艺上具有相关性。除了分类和存活的变化外，接种对不同基因型的生长影响也有所不同。关于高度和直径，接种与分类之间的相互作用表明了不同的反应：在基因型X中，对照组的幼苗高度更高，而接种组的幼苗直径更大。在基因型Y中，接种有利于“A”幼苗的高度，而在对照组中，“B”幼苗更高，对照组幼苗的直径也始终较大。这些差异表明，接种可能会根据基因型和实验条件影响资源在高度生长和茎干增厚之间的分配。尽管观察到的差异很小，但大样本量的统计分析证实了其显著性，表明这些效应具有潜在的生物学意义。只有接种基因型Z的“A”幼苗的茎干干重显著增加，而在基因型Y中，“A”和“B”幼苗的叶干重都有所增加。此外，基因型Y和Z的“A”幼苗的根生物量显著增加，表明接种可能在某些条件下促进根系发育。研究表明，接种可以一致地重新编程根和茎的架构以及生理和微生物组（Khoso等人，2024年；Cunha等人，2024年）。这些结果表明，接种的效果远不止于简单地促进生长，而是以更复杂的方式影响植物发育，影响幼苗的架构及其适应田间条件的能力（Raimam等人，2024年）。接种后根细菌组成的适度但一致的重构，而没有失去原有的多样性，表明引入的菌株与内源性微生物群落之间存在生态兼容性。这对于生物接种剂在林业中的长期应用至关重要，因为它确保了微生物组的稳定性和功能冗余（Sessitsch等人，2019年）。然而，与内源性微生物组的竞争可能阻碍了接种剂的完全建立，这一方面可以在未来的研究中进一步探讨。与非接种处理相比，Ralstonia的平均相对丰度减少支持了微生物联合体可以通过生态位抢占、抗菌作用或诱导系统抗性来作为生物控制剂的假设。这些相互作用可以减少对化学投入的依赖，并提高土壤健康和植物检疫的韧性，符合可持续林业的原则（Eggers等人，2020年）。中型根瘤菌的平均相对丰度始终较高，该属包括固氮谱系，并且之前已有报道其与桉树根系相关且nifH阳性，这支持了接种可能有利于与生物固氮相关的微生物途径的假设（Da Silva等人，2014年；Fonseca等人，2018年）。虽然本研究没有测量直接的固氮作用，但这种群体水平的信号与潜在的氮循环贡献一致，如果通过功能测定得到证实，可以补充养分管理策略，并减少对合成氮肥的依赖。总体而言，这些发现表明细菌接种的效果在多个层面上发挥作用，从群落结构的变化到植物表现的变化，其结果强烈依赖于宿主基因型。虽然部分支持了接种改变微生物群落组成的假设，因为尽管没有明显的分类单元级别的变化，但仍检测到了结构变化，但接种联合体会增加其组成属的相对丰度的假设仅得到弱支持，仅观察到中型根瘤菌的一致富集。相比之下，接种改善幼苗发育的假设得到了支持，尽管这取决于宿主基因型。结论本研究的发现突显了细菌联合体在林业生物技术中促进植物生长的潜力。通过同时影响细菌群落组成和改善幼苗质量，微生物接种剂代表了一条实现低投入、高抗性种植系统的可行途径。然而，基因型之间的变异性强调了接种剂开发必须考虑宿主特异性兼容性、微生物持久性和功能表达。未来的研究应该整合宏基因组学和转录组学方法，以阐明植物-微生物相互作用期间激活的功能途径，并识别与生长促进和压力缓解相关的关键微生物基因。还需要进行长期的田间试验，以评估接种菌株的持久性、生态安全性及其在多变气候和土壤条件下的影响。总之，多菌株细菌接种提供了一种有前景的生态和生物技术工具，可以增强桉树幼苗的表现，减少死亡率，并促进可持续的林业实践。这里观察到的不同反应强调了需要定制接种剂配方，以考虑宿主遗传学、环境背景和微生物兼容性。