细胞毒性在致癌过程中的作用

《Archives of Toxicology》：The role of cytotoxicity in the process of carcinogenesis

　　摘要：在长期动物癌症研究中，仅在高细胞毒性剂量水平下观察到的癌症发病率增加现象通常被认为是由间接或次级突变效应引起的，例如由活性氧（ROS）生成或再生细胞增殖过程中发生的复制错误所导致的DNA损伤。最近的研究提供了另一种解释，即非遗传毒性剂量的细胞毒性可能导致已存在的（已经突变的）休眠肿瘤前体细胞的选择性生长刺激，从而促进肿瘤形成。这种生长刺激被认为是通过损伤相关分子模式（DAMP）信号传导（“无菌炎症”）介导的。本文讨论了仅在高细胞毒性剂量下观察到的癌症发现的不同观点，特别是这些发现对评估这些物质的风险的影响。

引言：德国MAK委员会（负责研究工作场所化学物质健康危害的德国参议院委员会）经常面临这样的问题：实验动物在暴露于极高剂量的研究化学物质后出现了癌症现象，而这些化学物质也表现出细胞毒性。在许多情况下，没有证据表明该化合物具有诱变性（直接遗传毒性）。在这种情况下，人们通常认为细胞毒性影响了致癌过程，从而影响了癌症的结果。原则上，两种不同的机制可能在这个过程中起主要作用：（1）诱导间接或次级诱变效应（下文详述）；（2）对已经存在的自发突变肿瘤前体细胞的促进（非遗传毒性）效应。为了进行风险评估，了解这两种机制中哪一种在人类暴露情况下更为重要是非常重要的。在本文中，我们将基于一些看似不相关的最新研究结果来讨论这些方面，这些结果在当前问题的背景下变得非常相关，即（a）细胞毒性是否可以通过产生诱变效应来启动癌症过程；或者（b）细胞毒性是否可以加速（促进）已经进行的致癌过程，甚至作用于肿瘤进展的后期阶段。

细胞毒性是否通过炎症和氧化应激间接诱导突变？癌症的发展涉及目标细胞中的一个或多个基因改变（突变），这些突变会传递给所有子细胞，并且可能由化学活性剂引起的DNA损伤等因素导致（肿瘤起始）。原则上，细胞毒性可以通过两种机制引起突变：（1）特别是在细胞毒性剂量水平下，对DNA以外的细胞靶标的损伤，例如线粒体的呼吸链，可以生成活性细胞代谢物——如活性氧（ROS）和氮物种（NOS），从而导致突变，尤其是在NADPH、ATP和GSH水平耗尽的情况下，细胞防御机制（抗氧化反应、DNA修复）可能功能失调（“间接遗传毒性”）；（2）或者，组织损伤和细胞死亡在体内可能导致再生性生长（与自发突变相关）或触发炎症反应，其中浸润的中性粒细胞和活化的巨噬细胞释放ROS，可能诱导邻近细胞的突变（“次级遗传毒性”）。

通过分析DNA损伤谱型和DNA中的突变特征，可以获得间接和次级遗传毒性作为肿瘤发生潜在原因的证据，因为ROS会生成特征性的突变模式。ROS引起的最典型的DNA碱基修饰是8-氧代-2'-脱氧鸟苷（8-oxoG）。如果8-oxoG不被8-氧代鸟苷DNA糖苷酶（OGG1）启动的特异性碱基切除修复所修复，就会导致8-oxoG与A的不匹配。这些不适当的配对腺嘌呤可以被另一种特异性DNA糖苷酶（MUTYH）切除。如果这两种修复途径都失败，则会导致一种特定类型的碱基替换，即G → T/C → A的转换（Suzuki和Kamiya 2017及其中的参考文献）。

在培养细胞中，已经研究了暴露于各种类型氧化剂后8-oxoG的生成及其后果。例如，溴酸钾会选择性地产生8-oxoG，导致以G → T/C → A转换为主的突变谱型（Kucab等人2019）。其他例子包括有毒/致癌的金属化合物，它们可能通过至少三种不同的机制促进ROS诱导的DNA损伤和突变：（1）像铁、铜或镍这样的氧化还原活性金属离子催化芬顿型反应；（2）一些金属化合物通过与特定的DNA修复酶相互作用来抑制DNA修复系统；（3）它们在高浓度下可能导致GSH耗尽。特别是第二种机制可能显著增加内源性和致癌物诱导的DNA损伤；一个有充分记录的例子是亚砷酸盐，它在特别低的浓度下特异性抑制聚（ADP-核糖）聚合酶的活性，从而导致修复缺陷（Walter等人2007）。在动物中，已经证明几种外源性氧化剂可以生成8-oxoG、G → T/C → A突变，并最终导致癌症，例如溴酸钾（Arai等人2002）、亚硝基三乙酸铁（Jiang等人2006）和UVA照射（Ikehata等人2004）。关于ROS引起的内源性（自发生成）DNA损伤的相关性，可以从Ogg1?/?小鼠中获得信息，这些小鼠在肝脏中表现出8-oxoG和自发G → T/C → A突变的背景水平升高，但肿瘤发生率没有显著增加（Epe等人2002）。然而，在用过氧化物增殖剂Wy-14,643处理后，Ogg1?/?小鼠肝脏中的癌前病变数量和体积显著增加，这与ROS水平升高或额外的ROS诱导的DNA损伤或突变无关（Trapp等人2007）。相反，这种在转基因动物中增强致癌作用的效应可能是由于Wy-14,643的促肿瘤特性所致。有趣的是，额外敲除Mutyh会导致小鼠肺、卵巢和淋巴细胞中自发肿瘤的显著增加，即使没有使用促进剂处理（Xie等人2004）。

尽管上述发现证实了外源性和内源性ROS生成引发肿瘤的潜力，但一些结果表明ROS在肿瘤形成中的作用主要不是通过遗传毒性介导的。两种化学性质不同的化合物，佛波尔酯TPA和过氧化氢（H?O?），会在小鼠皮肤中引发强烈的炎症反应，伴随角质形成细胞增殖、表皮增厚，并最终增加肿瘤发生率（参见Schwarz等人2013）。这种反应部分是由免疫活性皮肤细胞的激活介导的，这些细胞释放促进增殖的细胞因子和ROS，特别是超氧阴离子。然而，这两种物质单独使用时不会在小鼠皮肤中引发肿瘤，除非事先用肿瘤启动剂处理。这与ROS会在此模型中引发足够DNA损伤以启动肿瘤的观点相矛盾。相反，有强有力的证据表明ROS在小鼠皮肤模型中通过非遗传毒性（即促进性）机制起作用（参见Schwarz等人1984）。一个有力的论据是，合成超氧化物歧化酶模拟物CuDIPS与TPA长期联合使用时可以完全抑制肿瘤形成（Kensler等人1983）。

如果ROS诱导的突变参与了乳头瘤的形成，那么在这些肿瘤中应该能够检测到相应的ROS特征。在两阶段启动促进实验中，使用二甲基苯并[a]蒽（DMBA）作为肿瘤启动剂时，观察到的主要特征是Hras癌基因第61位密码子的A → T/T → A转换，这表明DMBA的活性代谢物是致病因素。在这项研究中还观察到了可能与ROS形成相关的其他突变特征。然而，几乎只有在DMBA在子宫内暴露后延迟进行TPA处理的情况下才会观察到这些特征（Li等人2025）。此外，当TPA每两周给药一次时，它就失去了其促进肿瘤的作用（Boutwell 1964）。这反驳了ROS直接或通过ROS介导的突变机制，因为这些效应应该是不可逆和累积的，与治疗计划无关。

关于氧化生成的DNA损伤（与炎症相关）作为人类癌症起源的诱变条件的相关性，大量分析提供了重要信息，这些分析识别了多种人类癌症类型中的特征性突变特征，并将其部分归因于致病因素或机制（https://cancer.sanger.ac.uk/signatures/）。在这个COSMIC数据库中，单碱基替换（SBS）特征18被认为非常代表ROS相关的突变谱型，其特征是预期的G → T/C → A转换占主导。在分析超过4500个完全测序的人类癌症基因组的突变模式时，发现这种ROS特异性特征在多种肿瘤类型中都有不同程度的存在（Alexandrov等人2020）。此外，MUTYH基因有缺陷的癌症显示出另一种特征（SBS36），它在质量上与SBS18相似，但在数量上有所不同（Pilati等人2017）。使用OGG1和MUTYH敲除细胞阐明了8oxodG导致SBS18和SBS36的具体核苷酸环境（Zou等人2021）。

一些人类癌症与慢性炎症密切相关。其中包括一种特定的食管癌，它起源于食管上皮的肠化生（巴雷特食管，BE）。在西方国家，这种癌症类型通常是由于慢性胃食管反流引起的持续刺激而发展起来的。溃疡性结肠炎（UC）是一种常见的慢性炎症性肠病，其特征是结肠的持续炎症、反复发作的溃疡，在某些情况下还会发展成结肠炎相关的结直肠癌。由于ROS形成是炎症的标志，这两种癌症非常适合测试是否存在ROS特异性突变特征。然而，在UC患者的隐窝中，突变谱型主要由T → G和T → C替换在C[T]T/G[A]A环境中构成，这与另一种标记为SBS17(a/b)的突变机制相关（Kakiuchi等人2020）。一项关于癌前BE、原发性和转移性食管肿瘤的大规模研究发现，疾病进展过程中的大多数突变可归因于SBS17a/b。SBS18也对突变负荷有所贡献，尽管程度较低（Abbas等人2023）。这证实了之前对97个测序食管癌症的研究数据（Alexandrov等人2020）。然而，对低至高级别BE样本的单细胞测序分析显示，SBS17相关突变仅发生在染色体不稳定（CIN）的细胞中（Busslinger等人2021）。

在巴雷特食管和UC肿瘤组织中富集的突变特征类似于SBS17a/b，这表明它们与慢性炎症有关，因此可能是这两种疾病的致病因素。然而，特征17的潜在诱变机制尚不清楚。令人惊讶的是，与ROS相关的SBS18在这些组织中的代表性较低，并不是主要的突变特征。这引发了关于炎症是否通过ROS介导的突变作用（即通过激活致癌基因或失活肿瘤抑制基因）来促进肿瘤形成的疑问。

总之，在体外系统中可以清楚地检测到ROS诱导（氧化应激相关）的突变。在动物中，已经证明一些氧化剂具有诱变性并会导致癌症。此外，内源性（自发）生成的8-oxoG在修复缺陷条件下也会促进肿瘤事件。如果与肿瘤促进剂或肿瘤促进条件结合，这会导致致癌性。然而，在这两种典型的、明显与炎症相关的人类癌症中观察到的突变谱型并没有为ROS在癌症发展中的额外肿瘤启动（遗传毒性）作用提供坚实的证据。总之，由于慢性炎症显然会促进肿瘤的发展，无论是在动物还是人类中，因此在长期促炎条件下，肿瘤促进的非遗传毒性效应可能起着更重要的作用（见下文）。细胞毒性是否通过刺激再生生长来诱导突变？细胞毒性治疗后的突变（以及潜在的起始效应）也可能通过诱导再生增殖而产生，因为细胞增殖本身就存在一定的自发突变风险。然而，现有的动物数据并不支持仅增加增殖就会导致肿瘤形成的假设。例如，大鼠单次或多次部分肝切除术本身并不会导致肝脏发生肿瘤变化。但是，在给予致癌物后进行多次肝切除术时，确实会发生肿瘤发展，这表明肝切除术具有促进肿瘤的作用（Pound和McGuire 1978）。同样，小鼠单次暴露于四氯化碳（CCl4）只会诱导肝细胞再生增殖，而不会导致纤维化或随后的肝脏肿瘤。需要长期暴露于致死剂量才能诱导纤维化和肿瘤（Cohen等人2023）。如果以高单剂量每隔四周给予CCl4，则肝脏每次都能完全再生，且不会伴随纤维化（参见Leist等人2017的综述）。这一发现与TPA的效果相似，当TPA以每周两次的频率给予时，其促进肿瘤的活性在间隔更长的时间后完全消失（Boutwell 1964）。综上所述，这些结果表明，ROS介导的间接遗传毒性和单纯的再生增殖诱导对于肿瘤形成的作用并不像人们通常认为的那么重要。然而，任何通过细胞毒性间接或继发引起的突变肯定会增加已存在的突变负担。

细胞毒性剂量水平如何促进肿瘤发展？有大量证据支持细胞毒性的非遗传毒性、促进肿瘤的作用。这一机制的一个关键前提是再生组织中已经存在肿瘤前体细胞——这些细胞携带致癌基因或其他与癌症相关的基因的自发突变。一种可能性是，细胞毒性的肿瘤促进作用源于其与炎症的频繁关联，从而产生ROS。ROS激活了NF-κB、AP-1等中心转录因子。此外，许多信号转导途径的成分和转录因子都对氧化还原敏感，这意味着它们可以被ROS调节。已知的氧化还原敏感靶点包括MAP激酶、酪氨酸磷酸酶、APE1、TP53等（Lennicke和Cochemé 2021；Averill-Bates 2024；Sies等人2024）。本文重点讨论的另一种细胞毒性促进肿瘤的作用机制最近在从未吸烟者中发生的肺腺癌中被描述，这种癌症可能与吸入纳米级颗粒物（PM2.5）有关（Hill等人2023）。所提出的机制涉及由肺靶组织内的细胞毒性效应引发的一系列事件。为了理解这些效应，有必要简要考虑先天免疫系统，其主要功能是识别体内的病原体。侵袭性病原体表面具有称为病原体相关分子模式（PAMPs）的结构，这些结构被免疫细胞上的特异性受体——即模式识别受体（PRRs）所检测到，其中Toll样受体（TLRs）是最大的亚组。PRRs识别保守的细菌分子结构，并在结合后激活免疫系统。即使在没有病原体的情况下，裂解细胞死亡也会释放出作为损伤相关分子模式（DAMPs）的成分。其中一种DAMP是线粒体DNA（mtDNA），由于其进化上的相似性，某些PRRs会将其识别为“外来”物质。PRRs也可能被通常位于细胞内的蛋白质或细胞外的ATP激活（Gong等人2020）。这些DAMPs（也称为警报素）随后激活组织驻留的免疫细胞，如肺中的肺泡巨噬细胞或肝中的库普弗细胞，释放细胞因子以招募循环中的免疫细胞。这放大了局部免疫反应，导致炎症反应加剧。当没有病原体参与时，这种反应被称为无菌性炎症。例如，在肺部，环境中的碳基纳米材料可能会损伤呼吸道上皮细胞，释放DAMP白细胞介素（IL）-33。此外，细胞裂解（坏死性凋亡）会导致肺泡巨噬细胞减少并释放DAMP IL-1α。这些DAMPs共同将肺泡微环境重新编程为促炎、促纤维化的环境，这一过程得到了激活的间充质的支持。这种环境的特点是CCL2（CC-趋化因子配体2）的表达和释放，它吸引单核细胞到组织中，自我维持持续的单核细胞吸引，从而支持持续的炎症。累积的炎症巨噬细胞无法补充肺泡空间，持续释放炎症细胞因子（Voss等人2025）。触发DAMPs释放的机制中，除了坏死性凋亡外，铁死亡（ferroptosis）也可能起重要作用（综述见Huang等人2024）。然而，凋亡细胞死亡后不太可能产生类似的反应，因为这一过程通常不会释放细胞内成分。相反，凋亡细胞会形成膜结合的凋亡小体，释放特定的磷脂信号来吸引巨噬细胞，指示它们吞噬并清除死亡细胞（Lauber等人2003）。通过这种方式，可以有效地避免由裂解细胞死亡引起的炎症反应。尽管到目前为止描述的过程代表了宿主的保护性反应，但细胞因子和类似细胞因子的信号分子的释放也可能产生不良副作用。特别是，从吸引的炎症巨噬细胞释放的IL-1β已被证明可以刺激携带表皮生长因子受体（Egfr）或Kras休眠驱动突变的肺细胞增殖，从而促进肿瘤形成（Hill等人2023）。巨噬细胞释放的IL-1β还可以直接调节WNT通路，促进癌细胞增殖（Kaler等人2009）。这里的一个关键假设是，目标组织中已经存在足够数量的突变肿瘤前体细胞，这些细胞通过自发突变或致癌物诱导突变产生。这种细胞的存在是非常可能的，因为来自包括肺在内的各种人体器官的正常组织中的细胞已被证明携带数百到数千个突变，且这些突变随年龄增长而增加，同时存在携带癌症驱动基因突变的小克隆细胞（Fowler和Jones 2022；Yoshida等人2020；Lee-Six等人2019；Brunner等人2019；Martincorena等人2015, 2018）。因此，休眠的启动细胞可能会受到促进（Li等人2025），尤其是受到细胞毒性引起的炎症反应的影响。TLRs之前已被认为与肿瘤促进有关。Fukata等人（2007）报告称，Toll样受体-4（TLR4）会促进人类结肠直肠肿瘤的发展。另一方面，TLR7已被证明在小鼠和人类胰腺癌的发生中起决定性作用（Ochi等人2012）。在暴露于二乙基亚硝胺（DEN）的小鼠中，库普弗细胞产生的IL-6已被证明可以刺激肝癌的发生，这种效应依赖于TLR适配蛋白MyD88，敲除MyD88可以保护雄性小鼠免受肝脏癌症的发展（Naugler等人2007）。TLR4缺陷的小鼠肝脏产生的IL-6减少，从而减弱了DEN诱导的肝癌（Weber等人2016）。本节描述的事件链在图1中进行了说明，该图还包含了之前讨论过（但被认为不太相关的）在细胞毒性剂量下启动肿瘤的机制。

图1
该图像的替代文本可能是使用AI生成的。

全尺寸图像
示意图展示了外源性物质在靶组织中引起的细胞毒性如何启动或促进肿瘤发展的机制。DAMPs（损伤相关分子模式）；mtDNA（线粒体DNA）；ROS（活性氧）；EMT（上皮-间充质转化）。

其他类似细胞因子的信号分子也可能刺激肿瘤细胞增殖。其中一种分子是Wnt，它可以由DAMP激活的免疫细胞分泌（Bi等人2021）。Wnt蛋白是所谓的Frizzled受体的配体，虽然它们严格来说不被归类为细胞因子，但在组织内具有类似的信号功能。Wnt信号分子已被证明可以在体外和体内刺激肿瘤细胞增殖并抑制其凋亡（Xue等人2025）。总体而言，有充分证据表明，携带潜在驱动突变的细胞在很长一段时间内保持休眠状态，但在某些刺激下，特别是与细胞裂解相关的炎症反应的刺激下，会开始增殖。这种机制似乎与几种经典肿瘤促进因子有关，在许多情况下可以解释只有在高（细胞毒性）剂量下某些物质观察到的肿瘤发生率。

细胞毒性是否也会影响肿瘤发展的最终阶段，包括转移？图1还展示了细胞毒性可能间接影响肿瘤发展的另一途径，这次影响的是癌症发生的最后阶段，即肿瘤进展和转移。同样，DAMP激活的免疫细胞通过释放细胞因子或类似细胞因子的信号分子起核心作用。这些介质可以促进两个关键过程：首先是上皮-间充质转化（EMT），这对转移至关重要；其次是转移肿瘤细胞向远端部位的归巢，有助于它们在异质微环境中的存活和增殖（Chaffer和Weinberg 2011）。文献描述了这些效应是通过Wnt分子介导的机制。在Bi等人（2021）的研究中，暴露于石墨烯的小鼠表现出强烈的肿瘤细胞转移，这归因于石墨烯在靶组织中引起的细胞毒性，随后是包括Wnt分子释放的DAMP驱动的免疫反应。在这项研究中，石墨烯暴露的小鼠的肺泡巨噬细胞中ROS的产生仅略有增加，因此排除了它是观察到的效应的来源。其他假设的例子可能包括长期高剂量酒精暴露下肝内转移的形成，或器官特异性毒素促进远处转移，例如在骨骼或肺组织中。然而，这些机制在很大程度上仍然是推测性的。

乍一看，为什么单次、短暂或间歇性的DAMP诱导剂给药似乎无法产生可检测的肿瘤促进效应可能令人困惑。理论上，即使是这样的短暂刺激也应该会诱导自发突变的肿瘤前体细胞暂时增殖，从而增加它们的数量。如果这种效应是不可逆的，那么预计在重复给药时应该会观察到累积效应，无论给药间隔时间有多长。然而，现有的动物数据与这一假设相矛盾。从机制上讲，原因在于肿瘤发展的克隆性质。克隆中的每个细胞都有两种可能的命运：增殖或经历凋亡性细胞死亡。有趣的是，肿瘤细胞的死亡概率非常高，这一现象最早由Kerr和Searle（1972）描述。这也适用于肿瘤前体细胞，尤其是在克隆还较小时（参见Schulte-Hermann等人1993；Grasl-Graupp等人2000）。因此，大多数克隆要么消亡，要么无法显著扩增。这正是肿瘤促进因子发挥作用的地方。研究最充分的例子是啮齿动物的肝癌发生。例如，在大鼠中，2,3,7,8-TCDD在肝脏中作为受体介导的肿瘤促进因子起作用。它的主要作用不是通过刺激细胞分裂，而是通过抑制癌前肝细胞的凋亡（Stinchcombe等人1995）。许多其他肿瘤促进因子也表现出类似的抗凋亡效应。一个关键点是，抗凋亡活性依赖于肿瘤促进因子的持续存在。一旦促进因子被移除，新形成的癌前肝细胞大多会经历凋亡性细胞死亡（Schulte-Hermann等人1993）。因此，需要长期暴露才能产生持久的效果。

对于非遗传毒性物质的细胞毒性剂量的风险评估，上述讨论得出的关键结论是，细胞毒性通常不会通过间接的遗传毒性机制导致肿瘤形成，而是通过非遗传性的肿瘤促进活性，这似乎是癌症发生中的限速步骤。这有两个重要含义：
1. 在单次或非常短期的暴露情况下，这些暴露可能是细胞毒性的，通常不会预期会有肿瘤促进效应。诱导慢性炎症反应是这些效应发生的先决条件。这也适用于间隔时间较长的间歇性暴露。尽管目前缺乏确凿的证据，但这可能也适用于肿瘤进展效应。
2. 由于潜在的生物学机制，剂量-反应（和时间-反应）关系是非线性的。关于第二点，必须分别考虑三个相互关联的子过程（参见图1）：
1. **目标组织中的DAMP释放**：这是初始事件，仅发生在细胞裂解死亡时，即浓度相对较高时。在非常低的剂量下，细胞的解毒系统可能足以缓冲潜在的损伤，从而完全防止细胞死亡。长期暴露可能导致损伤累积；然而，适应性保护机制也会随着时间的推移而上调。无论如何，最终导致细胞死亡的过程是非线性的，并且假定在低剂量下存在阈值。
2. **DAMPs激活模式识别受体（PRRs）**：一旦DAMPs被释放，局部免疫细胞上的模式识别受体（PRRs）就会被激活，进而刺激免疫反应。这是一种经典的受体介导的反应，预计会遵循具有阈值的非线性剂量-反应关系。
3. **肿瘤前体细胞中的细胞因子信号传导**：响应PRRs激活而释放的细胞因子（或类似细胞因子的信号分子）可以与“已启动”的肿瘤前体细胞表面的受体结合。这些受体将促进细胞增殖和抗凋亡的信号传递到细胞内部。这同样是一个受体介导的过程，因此也遵循与PRRs激活相同的非线性原理。原则上，这一系列事件中的第三步类似于由“经典”的非遗传毒性肿瘤促进剂（如苯巴比妥、TCDD或TPA）所介导的效果，这些物质也通过作为受体配体激活重要的细胞调控信号级联来促进肿瘤发生。

总之，这一机制背后有三个连续的非线性过程。在高剂量下，这些过程可能会相互增强；而在低剂量下，它们可能会减弱系统的反应——这意味着少数细胞裂解死亡事件不太可能引发严重的炎症反应或肿瘤促进。

在风险评估方面，重要的是要认识到慢性炎症必须被诱导才能发挥肿瘤促进作用，并且这些作用遵循具有阈值的非线性剂量-反应关系。