体外胎盘灌注模型与体外BeWo b30细胞模型在评估发育和生殖毒性化合物转移方面的比较

《Archives of Toxicology》：Comparison of ex vivo placenta perfusion and in vitro BeWo b30 cell models for assessing transfer of developmental and reproductive toxic compounds

　　摘要
随着下一代风险评估（NGRA）采用以暴露为导向的方法，人们对暴露预测的兴趣日益增加。在发育与生殖毒理学（DART）领域，胎盘转移数据对于估算胎儿暴露量至关重要。然而，与人类相关的数据往往有限或无法获得。离体人胎盘灌注被认为是胎盘转移研究的金标准，但其成功率低、组织供应有限且无法实现高通量数据收集。BeWo b30细胞可以提供一种高通量、较低成本的替代方法来收集与人类相关的胎盘转移数据。本研究在两种模型系统中测试了沙利度胺、丙戊酸、阿莫西林和安替比林，并建立了一个比较矩阵，以评估每种化合物在两种系统中获得的共同胎盘转移参数值。计算了转移指数（TI）、相对转移率、初始转移率和表观渗透性（Papp）。BeWo b30细胞中的相对转移率与胎盘灌注实验的结果高度相似，平均差异仅为1.1倍。此外，在初始转移率和Papp值方面，两者之间的平均差异分别为4.5倍和2.4倍。从实验数据中计算和提取哪些参数取决于具体的科学问题，例如是需要定性/相对评估还是定量/绝对评估胎盘转移。尽管如此，从两种系统中获得的Papp值对于参数化基于生理学的动力学（PBK）模型以及估算母体外部暴露后的胎儿暴露量特别有用。

引言
胎盘屏障是母体和胎儿血液循环之间的关键接口，在营养物质、气体和废物的交换中起着重要作用（Burton & Fowden 2015）。除了调节内源性物质的转移外，外源性物质也能不同程度地穿过胎盘屏障（Prouillac & Lecoeur 2010）。胎儿会接触到许多不同的化合物，这些化合物可能来自自然环境，也可能是现代人类环境中存在的化学物质，因此需要测试这些化学物质对发育中胎儿的潜在不良影响。迄今为止，体内动物数据仍是法规毒理学安全性评估的基石，尽管其生物学相关性越来越受到质疑（van der Zalm et al. 2022）。然而，在下一代风险评估（NGRA）等框架下，出现了越来越多的替代方法，旨在建立无需使用动物研究即可进行稳健风险评估的工作流程（Cote et al. 2016; Rajagopal et al. 2022; van der Zalm et al. 2022; Wood et al. 2024）。

在NGRA框架中，对体外和离体人类相关新方法（NAMs）的需求不断增加，这体现在NGRA采用以暴露为导向的风险评估方法上（Wood et al. 2024）。这种范式的转变，从主要通过传统的高剂量体内动物研究来评估危害的方法，转向更加注重保护的、以暴露为驱动的方法，考虑了相关的暴露情景，有望改进基于情境的安全性评估（Rajagopal et al. 2022）。然而，仅用一种NAM来预测完整人体内的毒理学终点仍然具有挑战性，甚至是不可能的。特别是在发育与生殖毒理学（DART）研究中，由于生殖周期的复杂性以及不同时间点的敏感性差异（Piersma et al. 2013），这一点尤为明显。因此，开发了所谓的NAMs组合，旨在捕捉DART过程（Schenk et al. 2010）。这些体外和计算机模拟测试组合通常包括多种毒理学终点，并依赖于体外-体内外推（IVIVE）方法，将化合物的体外毒理学效力与相关的体内暴露量联系起来。IVIVE可以通过使用基于生理学的动力学（PBK）建模方法来估算外部暴露后的体内血浆或组织浓度（Piersma et al. 2013; van der Burg et al. 2015）。将体内暴露量的估算纳入风险评估可以为反向剂量学提供依据，从而将体外毒理学效力（PoD）转化为计算达到这些体内浓度所需的外部暴露量（Louisse et al. 2010）。此外，IVIVE也可以通过正向剂量学进行，即计算给定剂量下的峰值血浆浓度（Cmax），并将其与体外效应浓度进行比较。随后可以利用体内和体外暴露量来计算生物活性：暴露比（BER），从而为风险评估提供信息（Kreutz et al. 2026; Mueller et al. 2025）。

在评估子宫内发育毒性的NGRA方法中，需要将外部暴露量不仅与母体血浆浓度估计值联系起来，还要与预期的胎儿血浆和组织浓度联系起来。因此，需要化合物通过胎盘的数据来准确估算发育中胎儿的体内暴露量。化合物的胎盘转移可以通过不同的方法进行估算。计算机模拟模型可以考虑化合物的理化性质，并将其与屏障渗透性的总体估计相关联。或者，在动物实验中，可以将稳态下的血浆浓度与胎儿或脐带血浆浓度进行比较。在人类相关模型方面，离体人胎盘灌注被认为是研究妊娠晚期母体-胎儿转移的金标准，因为胎盘的三维结构在此期间得以保留（De Sousa Mendes et al. 2016）。在这些实验中，从母体和胎儿两侧对胎盘的一个单元（称为胎叶）进行灌注以研究其转移情况。然而，该系统也受到设计劳动密集、成功率低以及依赖新鲜胎盘组织的限制。鉴于这些限制，单独使用胎盘灌注系统在NGRA框架中是不够的，特别是由于需要更高通量的检测来筛选更多化学物质。尽管存在多种体外替代方法来研究胎盘转移（Dusza et al. 2023; Sastry 1999），但在这种情况下，BeWo b30细胞模型被认为是一个合适的模型。

BeWo b30细胞系是原始BeWo细胞系的亚克隆，后者是一种源自人类绒毛膜癌的滋养层细胞系（Liu et al. 1997）。与原始BeWo细胞系不同，该亚克隆在适当的条件下培养时能够形成连续的单层细胞（Liu et al. 1997）。因此，BeWo b30插入系统可以作为一种高通量替代方法，提供比离体人胎盘灌注更准确的化合物胎盘转移数据。

本研究的目的是比较BeWo b30细胞模型作为离体人胎盘灌注替代方法的适用性，选择了四种案例研究化合物：沙利度胺、丙戊酸、阿莫西林和安替比林。选择丙戊酸和沙利度胺是因为这两种化合物都表现出良好的胎盘转移特性，并且是已知的发育毒物。虽然丙戊酸在稳定性和溶解性方面较为简单，但沙利度胺在水性缓冲液中会自发水解，研究起来较为复杂（Eriksson et al. 1992; Lepper et al. 2006）。然而，研究这种化合物有助于更好地了解模型系统中化合物降解的情况。阿莫西林被选为一种在妊娠期间被认为安全的化合物（Bookstaver et al. 2015），因为它比丙戊酸和沙利度胺更具亲水性，且胎盘渗透性较低。安替比林是一种常用的被动扩散参考化合物，已有相关文献数据（Aengenheister et al. 2018; Dimopoulou et al. 2018; Li et al. 2013; Poulsen et al. 2009）。我们提供了一个比较矩阵，以帮助解释这些模型系统中生成的胎盘转移数据在风险评估中的应用。该矩阵包括了几种描述转移的方式：表观渗透性（Papp）是一个广泛用于计算化合物转移的参数；转移指数（TI）和相对转移率用于比较化合物相对于安替比林的转移情况（Li et al. 2013）；胎儿-母体浓度（FM）比率常用于比较不同实验之间的离体胎盘灌注结果（Mose et al. 2008）。最后，计算了初始转移率的比率，作为离体和体外胎盘转移实验初始线性部分的比较参数。在我们的BeWo b30细胞体外研究中，化合物既以混合物形式也单独测试，以研究可能的相互作用。

材料与方法
试剂和化学品
Dulbecco改良Eagle培养基/F-12营养混合物（DMEM/F12）含有L-谷氨酰胺（不含酚红，21,041–025）、0.05%胰蛋白酶-EDTA（25,300–054）以及青霉素（10,000单位/mL）/链霉素（10,000微克/mL）（Pen Strep，15,140–122）由Gibco（Eggenstein，德国）提供。胎牛血清（FBS，S-FBS-SA-015）来自Serana（Pessin，德国）。ZO-1单克隆抗体Alexa Fluor 488（339,188）由Thermo Scientific（Rockford，美国）提供。沙利度胺（T144-1G）来自Scientific Laboratory Supplies（Fairham，英国）。磷酸二氢钾（A387573）由Merck（Darmstadt，德国）提供。牛血清白蛋白 fraction V（10,735,086,001）来自Roche diagnostics GmbH（Mannheim，德国）。乙酸（6052）由Avantor Performance Materials（Deventer，荷兰）提供。蔗糖（27,480.294）来自VWR International（Leuven，比利时）。二甲基亚砜（DMSO，D4540-100ML）、3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物（MTT，M5655-1G）、荧光素钠盐（NaF，1,038,870,050）、人IV型胶原（C5533-5MG）、磷酸盐缓冲液（PBS）、阿莫西林三水合物（31,586-250MG）、安替比林（A5882-25G）、氯化钠（S9625-1KG）、氯化钾（P9333-500G）、硫酸镁七水合物（230,391-500G）、碳酸氢钠（1.06329.1000）、氯化钙二水合物（22,350–6）、葡萄糖（G7021-1KG）、Triton X-100（23,472–9）、甲醛（P6148）和4′,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，32,670-5MG-F）均来自Sigma Aldrich（Missouri，美国）。人血清白蛋白（Albuman）来自Prothya Biosolutions（Amsterdam，荷兰）。肝素由LEO Pharma（Amsterdam，荷兰）提供。

细胞培养
BeWo b30细胞系由Dr. Tina Burki（Empa，瑞士）提供，并获得了Dr. Alan Schwartz（华盛顿大学，St. Louis，MO）的许可。细胞在添加了10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基中培养。BeWo b30细胞在含有5%二氧化碳的湿润环境中，于37°C下培养于T175聚苯乙烯细胞培养瓶中（Greiner Bio-One B.V.，荷兰阿尔芬安登莱茵）。当细胞密度超过80%时（大约每3-5天），会进行常规传代培养。细胞先用PBS清洗，然后用0.05%的胰蛋白酶-EDTA溶液处理以分离细胞。

**细胞活力测定**
BeWo b30细胞以每孔1×10^4个细胞的密度接种在96孔聚苯乙烯板上（Cellstar，Greiner Bio-One B.V.，荷兰阿尔芬安登莱茵），并在培养箱中孵育过夜以确保细胞附着。接着，将这些细胞暴露于抗吡林、阿莫西林、丙戊酸和沙利度胺中，使用的浓度为临床相关最大浓度（分别为1、5、50和1 μg/mL），持续24小时（Andrew等人2007年；Jager-Roman等人1986年；Teo等人2004年；Zareba-Szczudlik等人2016年）。已知对BeWo细胞有毒性的克唑替尼（Crizotinib，浓度为100 μM）被用作阳性对照，细胞培养基作为阴性对照，1%的DMSO作为溶剂对照（Eliesen等人2017年）。所有条件下DMSO的最终浓度均不超过1%。24小时后，移除培养液，然后将BeWo b30细胞与溶解在无血清培养基中的0.5 mg/mL MTT一起孵育。在37°C下孵育2小时后，移除MTT，随后加入100 μL DMSO以溶解形成的甲苯胺蓝晶体。使用Biorad Multiwell Plate reader（荷兰维嫩达尔）在570 nm处测量吸光度，并从690 nm处测得的样品背景信号以及570 nm处测得的空白样品吸光度中减去前者。

**Transwell实验**
BeWo b30细胞以每毫升2×10^5个细胞的密度接种在表面积0.59平方厘米、孔径0.4 μm的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜上（BRAND GMBH Wertheim，德国），并将其放置于24孔PET BRAND板中（BRAND GMBH Wertheim，德国）。在接种细胞之前，将膜在37°C下用50 μg/mL的人胎盘IV型胶原蛋白处理1小时，之后用PBS清洗。膜的上侧填充0.4 mL培养基，下侧填充1.5 mL培养基。每72小时更换两侧的培养基。通过跨上皮电阻（TEER）测量和NaF泄漏测定来监测单层的形成和完整性。

**TEER测量**
TEER测量用于评估单层随时间的完整性。所有TEER测量均使用Epithelial Volt-Ohm Meter（Millicell ERS-2）和可调电极探针套装（MERSSTX03，Millicell ERS-2）进行。根据制造商说明，使用测试电极套装（MERSSTX04，Millicell ERS）定期校准Epithelial Volt-Ohm Meter。接种后连续14天每天进行TEER测量，以确定BeWo b30细胞单层的发展情况。这些数据用于确定进行实验的最佳时间点。接下来，对所有实验膜分别测定接种前后的TEER值。在开始TEER测量前，将带有膜的板放入空气流通罩中30分钟，使培养基适应室温。同时，电极在室温下用70%乙醇消毒25分钟。消毒后，将电极风干，并根据制造商说明在每次测量前检查系统。电极垂直插入膜中，当系统显示稳定值时读取电阻。有关TEER值的详细计算方法，请参见补充文件。

**NaF泄漏测定**
为了评估单层的通透性，加入NaF作为标记物来研究细胞间的物质转移。在接种后第3、6、9和12天分别测定NaF的转移情况。具体来说，将5 mM的NaF储备液稀释到不含酚红的DMEM/F12培养基中，最终浓度为5 μM，然后加入膜的上侧。接着向膜的下方加入1000 μL培养基。培养3小时后，从下方取100 μL样品。样品被加入到黑色聚苯乙烯96孔板（VWR International B.V.，荷兰阿姆斯特丹）中，使用Victor X3多孔板读数器（Perkin Elmer，激发波长485 nm，发射波长535 nm）测定浓度。根据加入上侧的NaF起始浓度计算下方 compartment中的化合物百分比。

**跨BeWo b30细胞层的化合物转移研究**
在接种后第9天进行化合物转移实验。将化合物以其在活力测定中使用的最终浓度加入上侧 compartment。测量从上侧到下侧的转移情况。本研究中的化合物既以混合物形式也单独以相同浓度加入，以确定混合物可能产生的影响。在实验开始和结束时（24小时后），从最终化合物溶液和上侧 compartment分别取50 μL样品。从下方 compartment取样时，在多个时间点进行取样。所有混合物样品和沙利度胺转移测定的样品均使用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 3.0）以10:1的比例进行缓冲，以降低样品的pH值至6.0以下，从而减少沙利度胺的自发水解（Eriksson等人1992年）。从下方 compartment取样后，用等体积的新鲜培养基补充缺失的体积。有关Papp计算的详细说明，请参见补充文件。

**离体胎盘灌注研究**
采用封闭-封闭配置进行离体双侧胎盘灌注实验，以更全面地研究化合物在胎盘中的转移情况。实验所用胎盘来自同意接受剖宫产或阴道分娩的女性。实验获得了我们机构医学伦理委员会的批准（CMO Arnhem/Nijmegen 文件2014–1397），并确认该研究不涉及人类受试者的医学研究，符合《医疗治疗合同法》的规定。胎盘灌注按照Schakenraad等人的方法进行，并稍作修改（Schakenraad等人2021年）。有关所用方法的详细概述，请参见补充文件。

**胎盘灌注中的表观通透性**
胎盘灌注实验中Papp值的计算方法与BeWo b30细胞的计算方法类似（见补充文件），由于本实验设置中没有人工屏障，因此无需进行校正。每个时间点的总质量是通过计算回路中的总体积来得出的。对于每个时间点，从体积中减去3 mL（每个时间点取两次1.5 mL的样品）。公式如下：
$$\Delta Q_{n} = C_{n} * (V_{wn } - \sum_{j = 1}^{n - 1} V_{s} ) + \sum_{j = 1}^{n - 1} V_{s} * C_{j}$$
其中ΔQn表示每个时间点转移的质量，已校正由于早期取样而去除的质量。Cn表示tn时间点样品的浓度。(V_{wn }-∑_{j=1}^{n-1}V_{s})表示取样所在的 compartment的体积，Vwn表示取样 compartment的体积，Vs表示取样体积（3 mL）。∑_{j=1}^{n-1}V_{s}*C_{j}用于校正由于tn之前的取样（从t=t1到t=tn-1）而累积去除的质量。Vs表示取样体积（3 mL），Cj表示tn之前取样的浓度。

**化合物的通透性（P）**
每种化合物的通透性（P）使用与BeWo b30细胞相同的公式计算：
$$P = \frac{\Delta Q_{n} / \Delta t}{A* C_{0}}$$
其中ΔQn/Δt表示化合物在胎盘屏障中的转移速率（ΔQn）随时间（Δt）的变化，A表示灌注 cotyledon的表面积（A假设为3371 dm2，基于妊娠40周胎盘的总表面积，假设每个胎盘平均有35个cotyledon（Dallmann等人2017年））。最后，C0表示实验中母体（供体）侧的初始浓度。

**沙利度胺的稳定性与水解**
由于沙利度胺在水溶液中会发生自发水解，我们在转移实验中捕捉并校正了这一现象，同时测试了其他化合物的稳定性。因此，将3份化合物混合物通过不含cotyledon的胎盘灌注系统进行处理。此外，还将空的胶原涂层Transwell膜与含有化合物混合物的DMEM/F12培养基一起在37°C下孵育。最后，使用玻璃烧瓶在37°C下进行稳定性测试，以排除化合物与实验系统塑料的非特异性结合。样品在与实验设置相同的时间点进行取样。这些数据用于校正随时间变化的沙利度胺浓度。有关计算的详细说明，请参见补充文件。

**转移指数值和相对转移率**
TI表示测试化合物在离体人类胎盘灌注实验中相对于参考标记物抗吡林的胎盘透过程度。TI值是根据离体胎盘灌注数据计算的，而相对转移率则是根据之前的BeWo b30数据得出的（Li等人2013年）。有关计算的详细说明，请参见补充文件。

**初始转移率和胎儿-母体浓度比**
根据文献中的方法确定基底侧/胎儿灌注液的初始转移率和FM比率，并进行了少量修改（Poulsen等人2009年）。有关计算的详细说明，请参见补充文件。

**紧密连接（ZO-1）的染色**
如上所述，在膜上培养BeWo b30细胞9天。首先在室温下用4%的甲醛在PBS中固定细胞20分钟，然后用0.1%的Triton X-100在PBS中渗透细胞15分钟，之后加入3%的BSA溶液作为封闭剂30分钟。抗ZO-1单克隆抗体（ZO1-1A12，Invitrogen，339,188）以1:50的稀释度溶解在1%的BSA溶液中，于4°C下加入膜中过夜。最后，用PBS清洗细胞，并用1 g/mL的4′,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）在PBS中染色30分钟。使用Zeiss LSM900显微镜进行成像，并使用Fiji（ImageJ 1.53t，美国NIH）处理图像。

**液相色谱-质谱（LC–MS/MS）**
所有浓度均通过LC–MS/MS测定。有关方法的详细概述，请参见补充文件。

**统计分析**
数据以算术平均值±标准差表示。细胞活力数据使用Kruskal–Wallis检验结合Dunn校正的多重检验进行分析。使用Mann–Whitney U检验和Bonferroni校正比较混合物中化合物的体外转移与单独添加时的转移情况。所有初始转移率均使用Pearson相关系数进行评估。数据使用GraphPad Prism版本10.4.1进行简单线性回归分析，显著性标准设定为p<0.05。

**屏障完整性**
通过每天进行TEER和NaF测量来监测BeWo b30细胞层的形成情况，特别是在更换培养基的日子里，这样可以最小化对细胞在膜中生长时的基线培养条件的干扰。如图1a所示，从接种第1天（27±2 Ω*cm2）开始，TEER值逐渐增加，到接种后第9天（135±7 Ω*cm2）。从第9天开始，TEER值在93至127 Ω*cm2之间稳定波动。图1b显示了接种后特定天数内NaF在发育中的细胞层中的转移情况。在播种后第9天之前，可以观察到NaF转移量的减少，这一趋势在第12天趋于稳定。没有细胞的对照实验显示插入物中的NaF转移量没有差异（见补充图S1）。三小时后，基底侧隔室中TEER的增加与NaF浓度的降低之间存在高度相关性，相关系数R2为0.96（见补充图S2）。最后，在播种后第9天，可以观察到明确的紧密连接结构，如图1c所示。因此，在此评估之后进行的所有细胞实验中，BeWo b30细胞都在插入物中培养了9天后再使用。

图1：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

用于研究BeWo b30细胞屏障发育和完整性的标记物概览。a显示了播种后连续14天内每天的平均TEER值。b显示了播种后不同天数NaF的透过情况。c显示了在插入物中培养9天的BeWo b30细胞的ZO-1和DAPI染色的共聚焦图像，使用的是63倍物镜（63x/1.4 Oil Plan Apochromat），总放大倍数为630倍。绿色=ZO-1，蓝色=DAPI。数据以平均值±标准差显示，N=3个生物重复实验。

化合物的毒性和转移：阿莫西林、安替比林和沙利度胺在测试浓度下对细胞活力没有影响。如图S3所示，丙戊酸在临床相关的Cmax浓度50 μg/mL时略微降低了细胞活力。然而，由于这一浓度处于体内观察到的血浆浓度的较低范围内，并且细胞活力仍然约为80%，因此该浓度仍被用于BeWo b30转移实验以及胎盘灌注实验中。

图S4和S5（见补充文件）显示了这四种化合物在两种系统中的稳定性。可以观察到安替比林、阿莫西林和丙戊酸在两种模型系统中都是稳定的。然而，沙利度胺在胎盘灌注系统和体外插入物系统中都会随时间消失。在图S4（见补充文件）中，没有与实验系统的结合，因为玻璃中的稳定性与实验系统的数据结果相同。这证实了沙利度胺的丢失可以通过自发水解来解释。将沙利度胺数据的对数转换与时间作图后，得到胎盘灌注系统和插入物系统的降解动力学分别为R2=0.93和0.99。这些数据随后被用来校正由于自发水解而导致的沙利度胺转移。

图2显示了基底侧/胎儿隔室中初始剂量的百分比。从定性排序的角度来看，阿莫西林在两种系统中的转移量最低，其次是沙利度胺。在胎盘灌注实验中（图2a），经过校正的沙利度胺转移数据（即考虑了自发水解后的数据）显示出比安替比林略高的转移量，其次是丙戊酸，显示出最高的转移量。在BeWo b30实验中，安替比林和丙戊酸的转移量几乎相同，而经过校正的沙利度胺转移量略低（图2b和2c）。这些化合物的转移量既作为单独的化合物也作为单一混合物在BeWo b30体外测定中进行了研究，以排除可能的相互作用，如转运蛋白和/或代谢酶的抑制。在每个采样时间点进行比较时，没有发现混合物中的化合物与单独测试的化合物之间存在统计学上的显著差异。TEER值在实验前后进行了测量。图S6显示了所有转移实验的实验前和实验后的TEER值。对照实验的实验前和实验后TEER值分别为135±7 Ω*cm2和98±4 Ω*cm2。对于混合物中的化合物，实验前和实验后的TEER值分别为128±5 Ω*cm2和102±6 Ω*cm2。当化合物单独添加时，实验前和实验后的TEER值分别为沙利度胺130±9 Ω*cm2、丙戊酸128±8 Ω*cm2、阿莫西林128±8 Ω*cm2和安替比林124±14 Ω*cm2和101±8 Ω*cm2。

图2：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

不同时间点胎儿/基底侧循环中初始剂量的百分比概览。a是在体外胎盘灌注系统中不同时间点胎儿循环中初始剂量的百分比。化合物以混合物形式测试。b是在BeWo插入物系统中不同时间点基底侧隔室中初始剂量的百分比。化合物单独测试。c是在BeWo插入物系统中不同时间点基底侧隔室中初始剂量的百分比。化合物以混合物形式测试。Thalidomide corr. = 经过自发水解校正的沙利度胺数据。数据以平均值±标准差显示。N=4个生物重复实验用于体外胎盘灌注，N=3个生物重复实验用于体外BeWo b30测定。

安替比林和丙戊酸在胎盘灌注实验中3小时内达到平衡，在BeWo b30系统中24小时内达到平衡，而阿莫西林在这两个实验期间均未达到平衡（见补充图S7-S9）。根据经过水解校正的数据，胎盘灌注实验中的平衡应在3小时内达到。由于体外BeWo b30实验中的顶端体积有限，无法进行更频繁的采样，因此无法校正24小时样本。

从图S10（见补充文件）可以看出，没有化合物在胎盘组织中积累过多。平均而言，所有化合物在实验结束时在胎盘组织中的含量都低于初始量的5%。体外胎盘灌注实验的质量平衡分别为沙利度胺（未校正）45±6%、丙戊酸101±8%、阿莫西林61±17%和安替比林80±4%。在BeWo b30中，相同化合物的质量平衡分别为4.0±0.7%、102±14%、72±2%和90±3%。对于胎盘灌注实验，未结合的分数分别为沙利度胺75±3%、丙戊酸25±1%、阿莫西林90±1%和安替比林95±2%。

表1概述了BeWo b30和胎盘灌注实验的转移数据的多项分析，包括胎盘灌注实验与BeWo b30测定相比的特定参数的倍数差异。Papp在胎盘灌注实验中计算为20分钟时，在BeWo b30实验中计算为60分钟时，因为这些时间间隔内的转移是线性的（基底侧隔室的斜率＞0.95，数据未显示）。胎盘灌注实验和BeWo b30实验之间的最大差异在于初始转移率，平均差异为4.5倍。另一方面，两种实验设置之间的所有化合物的转移指数和相对转移率的平均差异为1.1倍。胎盘灌注实验的Papp平均计算为BeWo b30实验的Papp的2.4倍。

图3显示了体外胎盘灌注的TI值与体外BeWo实验的相对转移率之间的相似性。总体而言，大多数数据点接近 identity 线（直线），表明体外和体外数据之间的结果相似。线性回归分析（虚线）显示斜率为0.89±0.07，截距为0.02±0.05，表明与体外胎盘灌注TI相比，BeWo b30的相对转移率略有低估。结合Li等人2013年的数据以及我们实验中测试的化合物，可以很好地了解两种模型系统之间的相关性。此外，所选的化合物涵盖了广泛的化学性质范围（logP从-3.0到4.5，分子量从122.12到780.97），表明当无法进行体外胎盘灌注时，BeWo b30实验可能是一个合适的替代方法。

讨论：在这项研究中，四种化合物在体外双侧胎盘灌注和体外BeWo b30模型系统中进行了研究。通过每日TEER和NaF转移测量来监测BeWo b30细胞的单层形成。观察到NaF转移率和TEER值之间存在高度线性相关性，这与（Poulsen等人2009年的发现一致）。这些标志物表明进行转移实验的最佳时间是播种后第9天，这一点通过染色9天后在插入物中培养的BeWo b30细胞中明显存在的发达紧密连接得到了进一步证实。

不同的文章报告了BeWo b30单层的TEER值截止值，以帮助决定何时开始转移实验。文献中建议的TEER值截止值介于30到>160 Ω*cm2之间（Ali等人2013年；Mathiesen等人2014年；Morck等人2010年）（Albekairi等人2015年）（Poulsen等人2009年）（Li等人2013年）（Kloet等人2015年）。还有报道更高的实验前TEER值，介于70到394 Ω*cm2之间（Dusza等人2022年）（Aengenheister等人2018年；Heaton等人2008年；Liu等人1997年），这些与我们自己的测量结果更为一致。在我们的研究中，测试化合物对实验后的TEER没有影响，无论是以混合物形式还是单独添加，这表明暴露似乎没有破坏单层的完整性。

多篇论文还报告了NaF通过BeWo细胞的转移作为细胞旁转移的标志物。报告的穿过细胞层的百分比在0.5%到1.6%之间，部分取决于使用的不同孵育时间（Dusza等人2022年）（Aengenheister等人2018年）（Poulsen等人2009年）（Nielsen等人2011年）。此外，被动扩散对照标志物安替比林的Papp值在2.6到11.2*10^-5之间（Aengenheister等人2018年；Dimopoulou等人2018年；Li等人2013年；Poulsen等人2009年）。在这项研究中，观察到的平均Papp为2.3±0.2*10^-5 cm^-1，这与一些报告的值非常接近。总体而言，不同标志物值存在一些变异性，尤其是在监测BeWo b30细胞单层发育的TEER方面。播种的细胞数量、胶原蛋白类型和插入物类型的差异可能解释了部分变异性。然而，我们报告的TEER和NaF值清楚地表明了进行转移实验的最佳播种时间。除了TEER和NaF转移之外，还包括安替比林作为额外的对照标志物，可以研究实验室间的变异性，并可能用作BeWo b30转移实验中的参考/标准化标志物。所有这些参数都强调了适当模型表征和报告普遍接受的参考标志物的重要性，以研究实验室间的变异性。这将对促进这些新的体外模型在风险评估中的监管应用具有高度相关性。考虑到这里研究的化合物，沙利度胺的自发水解会导致数据解释的困难。体外和体内实验设置之间的质量平衡差异很大程度上可以由实验时间的不同来解释，因为胎盘灌注实验进行了3小时，而BeWo b30实验则持续了24小时。然而，尚不确定这种水解过程的动力学在体外系统和体内实验条件之间是否具有可比性。由于降解动力学的差异可能会影响沙利度胺的校正率，因此分别在体外和体内系统中确定了其自发水解的动力学。校正沙利度胺的水解后，体外和体内数据之间的相关性得到了改善。校正水解后，胎盘转移的估计值有所提高。确定在实验系统中发生某种形式降解的化学物质的动力学有助于确定其对转移的影响，并随后将其纳入胎盘转移值的计算中。这是体外毒理学家应该意识到的，并且理想情况下应在实验设置和数据分析中加以考虑，正如本研究所展示的那样。

对于丙戊酸，Fowler等人（Fowler et al. 1989；Semczuk-Sikora et al. 2010）也进行了体外胎盘转移实验，而Fragki等人（Fragki et al. 2022）在BeWo b30细胞中进行了转移实验。将这些研究的数据与这里获得的数据进行比较时，可以观察到类似的转移动力学。达到平衡所需时间的差异可能是由于母体血液循环流速的不同以及实验中使用了白蛋白所致。体内研究表明，胎儿循环中的丙戊酸浓度可能高于母体循环中的浓度。这归因于妊娠后期游离脂肪酸水平升高导致其与结合位点的结合能力下降（Fowler et al. 1989）。脐带血清中的未结合部分显著低于母体血清，且游离脂肪酸浓度与未结合的丙戊酸之间存在强相关性（Albani et al. 1984）。另一种可能的解释是涉及质子连接的单羧酸转运蛋白（MCT）（Utoguchi & Audus 2000）。尽管在本研究中使用的临床相关浓度下，MTT实验中观察到细胞活力略有但统计学上显著的下降，但在实验后的TEER与未暴露于化合物的对照组相比没有发现差异。这表明本研究中观察到的细胞活力下降对体外转移研究没有显著影响。此外，Ohyama等人（Ohyama et al. 2023）在BeWo细胞中未发现丙戊酸浓度高达1 mM（= 144.2 μg/mL）时对细胞活力有统计学上的显著影响，这表明细胞活力略微下降的影响可能是有限的。

进一步阐述胎盘转移值，不同的研究从我们在这里进行的实验类型中得出了不同的参数（Li et al. 2013；Poulsen et al. 2009）。其他研究比较了多种体外胎盘细胞系，包括BeWo b30和HUVEC细胞的共培养。然而，在这些研究中，没有与体外数据进行比较，在Aengenheister等人的研究中得出结论，水平摇晃和与HUVEC细胞的共培养并没有改善用于排序的标准BeWo b30模型（Aengenheister et al. 2018；Rothbauer et al. 2017）。基于这些研究，本文进行的广泛比较表明，对于所测试的四种化合物，BeWo b30细胞和胎盘灌注实验之间的转移指数差异最小。最大的偏差出现在基底侧培养基和胎儿灌注液浓度的初始转移率值上。尽管这些参数有助于根据彼此之间的胎盘转移程度对化合物进行排序，但它们并不能量化胎盘转移，这限制了其在NRGA背景下估计胎儿暴露的适用性。因此，除了通常为体外BeWo b30实验计算的Papp值外，我们还引入了一套略微修改的方程来计算体外胎盘灌注实验的Papp值。这个值被认为更适用于纳入PBK模型，从而能够估算胎儿暴露。这种比较可以直接评估定量转移值，进而可用于直接评估不同实验方法对胎儿暴露预测的影响。为了调整这个新的Papp值，我们必须做出的最关键假设是关于灌注叶子的表面积（SA）。由于需要对每个灌注叶子进行全面的显微分析，因此确定灌注叶子的SA并不容易。由于这超出了本研究的范围，我们使用了基于多项形态测量研究的足月胎盘平均SA值11.8 m2（Dallmann et al. 2017），并将其除以足月胎盘中的平均35个叶子数量（Mian et al. 2021）。使用平均SA可能会导致对实验中使用的叶子实际SA的高估或低估。然而，在风险评估中，可以通过应用不确定性分析或最坏情况假设来考虑这一点。

有趣的是，虽然初始转移率在胎盘灌注中显示更快的转移，但在BeWo b30细胞中的Papp值却显示比胎盘灌注实验更高的转移。这表明实验数据的分析方式部分影响了两种模型系统之间的比较。初始转移率的差异可能可以由实验设置的差异来解释，因为在体外实验中胎盘是持续灌注的，而BeWo b30细胞则处于静态（无流动）条件下（Poulsen et al. 2009）。在胎盘灌注实验中连续流动条件下获得的Papp值并不比从静态BeWo b30系统获得的Papp值更高。然而，表观渗透性的差异可能部分可以由计算方法和关于胎盘SA的假设来解释。接下来，当比较在体外BeWo b30测定中以混合物形式添加和单独添加的化合物的参数时，只观察到了微小的差异。这表明化合物可以作为混合物添加而不会影响从测定中得出的转移率。因此，在筛选具有胎盘转移能力的化合物时，使用混合物可以节省大量时间和资源。然而，需要注意的是，在联合研究化合物时可能会发生转运蛋白和/或代谢酶之间的相互作用。充分的文献回顾，结合计算机模拟的QSAR筛选，可以帮助确定可能的相互作用风险（Cheng et al. 2011；Sedykh et al. 2013）。总体而言，当将本研究的数据与Li et al. 2013的数据结合起来时，观察到体外和体内模型的TI和相对转移率具有高相关性（P = 0.93）。所研究化合物的logP和分子量分布广泛，表明BeWo b30模型在TI方面可以产生与金标准体外胎盘灌注非常相似的结果。

总之，我们比较了四种化合物的体外BeWo b30和体外胎盘灌注实验，并计算了多个参数以指示胎盘转移情况。正如本研究所示，比较矩阵使得能够系统地评估这两种模型系统。TI和相对转移率的一致性最好，而之前描述的初始转移率差异最大。尽管如此，所有观察到的差异都远低于十倍。从实验数据中计算和提取哪些参数本质上是由提出的科学问题决定的。特别是在NGRA框架下，像这里为两种系统计算的Papp值这样的定量值有助于参数化PBK模型，并估计母体外部暴露后的胎儿暴露。理解实验条件和数据分析策略的影响对于提高体外测定在生成合适的定量胎盘转移数据方面的适用性至关重要。