草甘膦及其与2,4-D和二甲四氯的混合物对成年大鼠肠道生化功能、肠屏障完整性和微生物组组成的影响——这些大鼠在妊娠前就开始接触这些物质

《Archives of Toxicology》：Impact of glyphosate and its mixture with 2,4-D and dicamba on gut biochemical function, intestinal barrier integrity and microbiome composition in adult rats with prenatal commencement of exposure

　　摘要
在转基因（GM）和非转基因农业中，大量使用草甘膦类除草剂导致了广泛出现的草甘膦抗性杂草。作为回应，农业生物技术行业推出了能够耐受草甘膦与2,4-D或草甘膦与二甲四氯混合剂的转基因作物。因此，人们越来越多地接触到这些除草剂的混合物，但目前尚未有研究来评估其健康风险。肠道结构和完整性以及肠道微生物组的组成和功能被认为是导致疾病的重要因素。因此，我们研究了草甘膦单独使用以及与2,4-D和二甲四氯联合使用对肠道结构和功能的影响。从妊娠第6天开始，通过饮用水给怀孕的Wistar大鼠喂食草甘膦，剂量为欧盟规定的无观察不良效应水平（NOAEL：50 mg/kg体重/天）和可接受每日摄入量（ADI：0.5 mg/kg体重/天），以及一种包含草甘膦（0.5 mg/kg体重/天）、2,4-D（0.02 mg/kg体重/天）和二甲四氯（0.3 mg/kg体重/天）的ADI混合物。后代在断奶后继续这种喂养方案13周。随后分离出大肠和小肠组织及其内容物，并对其炎症、肠道上皮完整性、氧化应激、微生物群组成和组织病理学进行了分析。结果显示，草甘膦单独使用或与2,4-D和二甲四氯联合使用均导致了肠道炎症和通透性的增加，这与氧化应激和微生物组成的改变有关。组织学分析证实了大肠和小肠的结构改变和炎症现象，且这种影响在雌性大鼠中更为明显。我们的研究结果表明，接触草甘膦单独使用或草甘膦与2,4-D和二甲四氯的混合物是导致肠道结构和功能失调的风险因素。

引言
在基于化学的集约化农业中广泛使用除草剂所带来的潜在负面后果日益引起关注（Mesnage和Zaller 2021）。在常用的除草剂中，草甘膦因其在全球范围内的大规模应用及其对环境和健康的潜在影响而受到特别关注（Klátyik等人2023, 2024, 2025；Myers等人2016；Van Bruggen等人2028；Peillex和Pelletier 2020），包括可能诱发脂肪肝病（Riechelmann-Casarin等人2025）、神经系统缺陷（Costas-Ferreira等人2022）和癌症（Weisenburger 2021；Weisenburger 2026；Panzacchi等人2025）。自1996年耐草甘膦的转基因作物（大豆、玉米、棉花、油菜、甜菜、苜蓿等）上市以来，草甘膦类除草剂的使用量呈指数级增长，尤其是在北美和南美地区。据估计，全球每年草甘膦活性成分的使用量约为7.49亿公斤（Benbrook 2016；Maggi等人2020）。然而，过度依赖草甘膦作为杂草控制剂，无论是在转基因还是非转基因作物系统中（例如谷物收获前的干燥处理），都不可避免地导致了草甘膦抗性杂草的出现。全球共有48种杂草进化出了草甘膦抗性（Baek等人2021），其中在美国的转基因作物田中抗性最为严重（Heap和Duke 2018）。因此，农民们开始使用草甘膦与其他除草剂（如2,4-二氯苯氧乙酸和二甲四氯）的组合来提高杂草控制效果。随着耐草甘膦与2,4-D和二甲四氯混合物的转基因作物的推出，草甘膦的使用量进一步增加（Mesnage和Antoniou 2021），2020年2,4-D的使用量超过了1510万公斤，比2002年增加了近200%（Freisthler等人2022；Survey U.G. 2021a），而二甲四氯的年使用量从2016年的约360万公斤增加到2019年的超过1400万公斤（Survey U.G. 2021b）。这引发了人们对接触草甘膦、2,4-D和二甲四氯混合物的担忧。一项生物监测研究证实了这一可能性，该研究比较了在引入耐草甘膦与2,4-D和二甲四氯混合物的转基因作物之前（2010-2012年）和之后（2020-2022年）孕妇尿液中2,4-D和二甲四氯的水平（Daggy等人2024）。在2010-2012年组中，尿液中检测到二甲四氯的频率为28%，而在2020-2022年组中上升至70%，两者之间的尿液几何平均浓度增加了4倍以上。所有分析样本中也都含有2,4-D，尽管2010-2012年和2020-2022年组之间的几何平均浓度有所增加，但未达到统计学显著性（Daggy等人2024）。目前尚不清楚接触草甘膦、2,4-D和二甲四氯混合物的健康风险，这构成了一个知识空白，可能对公共卫生产生影响。

除草剂可能影响的生理系统之一是肠道，这包括对生化功能、肠道屏障完整性和微生物组的影响（Tsiaoussis等人2019）。肠道微生物组在许多生理过程中起着关键作用，包括食物消化、营养代谢、免疫调节和维持肠道屏障完整性（Camilleri 2019）。肠道微生物组的紊乱与多种健康问题有关，包括代谢综合征、炎症性肠病、自身免疫和神经发育障碍（Gacesa等人2022；Ghosh等人2022）。虽然以往的研究主要集中在评估单一除草剂的毒性上，但迫切需要研究除草剂混合物的影响，因为这反映了现实生活中的暴露情况（Martin等人2021）。当除草剂混合使用时，它们之间的相互作用可能导致协同效应、叠加效应或拮抗效应，从而显著改变其毒性（Docea等人2018；Delfosse等人2021；Mesnage等人2021a）。出于监管目的进行的毒性测试主要考虑的是单独测试的高剂量暴露，忽略了实际生活中长期低剂量暴露混合物的潜在风险（Myers等人2009；Tsatsakis等人2017）。评估低剂量暴露混合物的影响对于全面了解潜在的健康后果和制定适当的监管政策至关重要。

为了模拟因接触草甘膦、2,4-D和二甲四氯混合物而可能增强的毒性这一现实情况，我们使用大鼠模型进行了体内研究，并将其与单独接触草甘膦的情况进行了比较。为了符合政府监管实践，我们没有评估这些除草剂活性成分的商业制剂（Mesnage和Antoniou 2018；Mesnage等人2019）。此外，为了更真实地反映人类生活情况，动物从妊娠第6天开始暴露于草甘膦单独使用或草甘膦、2,4-D和二甲四氯的混合物中，考虑到胎儿对毒素的敏感性较高，这可能导致发育缺陷和成年后发病（Rager等人2020；Potiris等人2025）。我们评估了暴露对这些动物的肠道生化功能（炎症、氧化还原状态）、完整性和微生物组（细菌和真菌种群）的影响。我们还评估了“肠道通透性增加”这一指标，这是胃肠道功能障碍的一个特征，它可以触发免疫反应，并导致消费者肠道及其他部位的病理变化（Christovich和Luo 2022；Aleman等人2023）。

材料与方法
除草剂活性成分
草甘膦（纯度≥98.0%）、二甲四氯（纯度≥98.0%）和2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）（纯度97.0%）均为分析级，购自德国Sigma-Aldrich公司。准备了0.5 g/L草甘膦、3 mg/L二甲四氯和0.2 mg/L 2,4-D的储备溶液，并储存在4°C下。每天根据需要从储备溶液中配制溶液，通过饮用水给予各组动物。

动物除草剂暴露程序
本研究的实验设计见已发表的研究方案（Mesnage等人2023）。该研究符合欧洲共同体理事会关于科学用途动物使用和护理的指令（2010/63/EU），并获得了罗马尼亚克拉约瓦大学医学与药学院伦理委员会的批准。研究设计符合经合组织测试指南414（产前发育毒性研究）和经合组织测试指南408（90天重复剂量口服毒性研究）。

简要来说，每组包含5只怀孕的Wistar大鼠，分别接受以下除草剂暴露：（i）对照组仅接受标准饮食和饮用水；（ii）一组接受欧盟规定的每日可接受摄入量（ADI）的草甘膦（0.5 mg/kg体重/天）；另一组接受无观察不良效应水平（NOAEL）的草甘膦（50 mg/kg体重/天）；（iii）第四组同时接受草甘膦、2,4-D和二甲四氯，剂量分别为它们的EU ADI（二甲四氯0.3 mg/kg体重/天；草甘膦0.5 mg/kg体重/天；2,4-D 0.02 mg/kg体重/天）。这些物质从妊娠第6天开始通过饮用水给予，持续到断奶（每组5窝），之后后代（每组10只雄性和10只雌性）继续这种喂养方案13周。具体来说，每组中每窝选取大约2只雄性和2只雌性动物，根据最初的暴露方案继续暴露13周。在13周的产后暴露期结束后，通过注射氯胺酮和赛拉嗪进行全身麻醉后处死动物。收集大肠和回肠的内容物并储存在-80°C下。回肠和盲肠组织样本要么储存在-80°C下，要么立即用10%甲醛溶液固定24小时以进行组织病理学检查。

组织处理和组织病理学评估
对来自小肠（回肠）和结肠（盲肠）的样本进行了组织病理学分析。样本在室温下立即用10%中性缓冲甲醛固定24小时以保持组织形态。固定后，组织用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，并嵌入石蜡中。进行苏木精和伊红（H&E）染色以评估总体组织病理变化。石蜡包埋的块状组织用Leica RM 2125切片机切成4 μm厚的切片。H&E染色的组织切片在Panthera L光学显微镜（Motic Europe, S.L.U., 巴塞罗那, 西班牙）下进行观察，观察不同放大倍数下的变化。由于观察到的变化是局部的而非弥漫性的，我们采用了一种标准化的半定量评分方法：每张切片选择三个预定义的随机非重叠高倍视野（x400）并进行平均。这种方法旨在确保跨动物和组别的一致性，并避免因单一局部“热点”或视野选择导致的评分偏差。病变的形态学特征由两位经验丰富的病理学家在不知实验组的情况下进行评估。在解释上存在分歧的情况下，病理学家们讨论了研究结果并达成了共识。病变的识别和报告采用了标准化的命名法和诊断标准，这些标准符合《国际大鼠和小鼠病变命名及诊断标准协调》（INHAND）关于胃肠道病理学的建议（Nolte等人，2016年）。组织病理学改变根据病变的严重程度、受影响组织的范围以及受影响的动物数量，使用半定量评分系统进行分级（Meyerholz等人，2018年）。病变严重程度的评分系统如下：(-) 无变化：组织中未观察到组织病理学改变；(+) 轻微：组织病理学改变很小，仅限于组织的小范围；(++) 中度：组织病理学改变较为明显，影响的范围较大但仍然有限； (+++) 重度：组织病理学改变明显且严重，组织形态发生广泛或非常显著的变化。

**RT-qPCR分析**
通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析了指示紧密连接结构改变的5个基因在结肠（盲肠）和回肠中的表达情况。提取的总RNA使用SuperScript VILO cDNA合成试剂盒（ThermoFisher Scientific，英国拉夫堡）逆转录为cDNA。然后使用TaqMan检测试剂盒扩增了总共100 ng的cDNA，以确定Muc2 (Rn01498206_m1)、Ocln (Rn00580064_m1)、Zo1 (Rn07315717_m1) 和 Cldn4 (Rn01196224_s1)的mRNA水平。此外，还评估了3个基因（Il22 (Rn01760432_m1)、Lcn2 (Rn00590612_m1) 和 Tlr4 (Rn01458370_m1）在结肠和回肠中的表达情况，这些基因是炎症发生的标志物。所有RT-qPCR分析都使用Gapdh (Rn01775763_g1)作为内部参考标准。反应在Applied Biosystems QuantStudio 6 Flex实时定量PCR（RT-qPCR）系统上进行，使用TaqMan Fast Advanced Master Mix（ThermoFisher Scientific，英国）。2^-ΔΔCt方法用于计算目标基因的相对表达量（Livak和Schmittgen，2001年）。

**Calprotectin ELISA**
通过使用Immundiagnostik S100A8/S100A9 ELISA试剂盒（Immundiagnostik，德国本斯海姆，目录号：KR6936）根据制造商的说明，检测了100 μL盲肠内容物中的calprotectin水平，以研究肠道炎症。添加底物后的吸光度在450 nm处使用微孔板读数器（Promega，英国）读取。Calprotectin水平以ng/mL盲肠内容物的形式表示，检测限为0.076 ng/mL。

**血清zonulin和细菌脂多糖的检测**
使用Abbexa Rat Haptoglobin Precursor/Zonulin (HP) ELISA试剂盒（Abbexa，英国剑桥，目录号：abx256353）根据制造商的说明，检测了血清中的zonulin水平。ELISA使用100 μL血清进行。添加底物后的吸光度在450 nm处使用微孔板读数器（Promega，英国）读取。Zonulin水平以ng/mL血清的形式表示。同样，使用Abexxa Lipopolysaccharides (LPS) ELISA试剂盒（Abexxa，英国剑桥，目录号：abx150357）根据制造商的说明，检测了50 μL血清中的LPS浓度，添加底物后的吸光度在450 nm处使用微孔板读数器（Promega，英国）读取。LPS水平以ng/mL血清的形式表示。

**氧化还原生物标志物的检测**
如前所述（Nechalioti等人，2023年），采用分光光度法测量了大肠组织匀浆液中的氧化还原状态标志物（还原型谷胱甘肽、过氧化氢分解速率、总抗氧化能力、硫代巴比妥酸反应物质、蛋白质羰基）。

**肠道微生物群组成**
按照先前的描述（Mesnage等人，2022年），通过序列分析细菌16S V3–V4区域和真菌ITS2区域来分离盲肠和回肠内容物的DNA并分析其微生物群组成。使用Roche High-Fidelity PCR系统（Roche Life Science，英国韦尔温花园城）在10 μL的反应体积中，通过聚合酶链反应（PCR）扩增了总共5 ng的DNA。细菌16S V3-V4区域的扩增引物为：ACACTGACGACATGGTTCTACACCTAC GGGNGGCWGCAG（正向）和TACGGTAGCAGAGACTT GGTCTGACTACHVGGGTATCTAATCC（反向）。真菌ITS2区域的扩增引物为：TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTGTATAAGAGACAGGCATCGATGAAGAACGCAGC（正向）和GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAG AGACAGTCCTCCGCTTATTGATATGC（反向）。PCR反应混合物包括2 μL的10X FastStart High Fidelity反应缓冲液、0.2 μL的10μM正向或反向引物、0.2 μL的10mM PCR Grade Nucleotide Mix、0.25 μL的2U/μL铂金SuperFi II DNA聚合酶和5.35 μL的无RNase水。将其加入2 μL的5 ng/μL样本DNA中，在95°C下进行35次循环的PCR扩增，分别为30秒、55°C下30秒、72°C下30秒，最后在72°C下延伸5分钟。扩增产物的大小通过在2%琼脂糖凝胶上进行电泳来验证。然后，使用1 μL的100倍稀释的PCR产物在TE缓冲液（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.5）中进行第二轮PCR，以添加TSP FLD条形码和Illumina适配器。条形码反应混合物包括1 μL的10X FastStart High Fidelity反应缓冲液、1.8 μL的25mM MgCl2、0.5 μL的DMSO、0.2 μL的10mM PCR Grade Nucleotide Mix、0.1 μL的5U/μL FastStart High Fidelity酶混合物和1.4 μL的无RNase水。将其加入4 μL的Fluidigm Barcode和1 μL的1:100稀释的PCR产物中。PCR扩增在95°C下进行15次循环，分别为15秒、60°C下30秒、72°C下60秒，最后在72°C下延伸3分钟。条形码的附着使用Agilent Tapestation 4200仪器（Agilent，美国加州）进行控制。将每种条形码PCR产物的等体积混合，最终混合物稀释至4 nm。根据制造商的说明，将混合文库加载到300bpx2的paired-end MiSeq（Illumina，美国加州）上。

**微生物组DNA序列数据的生物信息学分析**
使用DADA2（v1.16）在R（v4.0.0）中处理扩增子序列变异（ASVs），并通过DADA2的朴素贝叶斯分类器针对SILVA数据库（v138）对16S进行分类，对真菌使用UNITE ITS进行分类。通过q2-picrust2插件（Douglas等人，2020年）从16S rRNA基因进行功能预测。清洁后的读段、ASV分类和元数据整合到phyloseq（v1.32.0）中进行多样性分析。使用ANOVA和Tukey事后检验评估α多样性（观察到的物种、Shannon指数）。使用NMDS基于Bray-Curtis差异性评估β多样性，显著性通过PERMANOVA（adonis，vegan v2.4-2）进行检验。分类可视化使用microViz（v0.7.1）和ggplot2（v3.3.0）进行。在分类水平上检查了群落组成；包括性别作为协变量的属级差异，并在性别分层分析中进行检验。数据通过总和缩放进行标准化，使用反正弦平方根变换进行方差稳定，并使用假发现率（FDR）校正进行多重检验。

**统计分析**
除了肠道微生物群数据分析外，所有标志物的统计分析都使用双向ANOVA进行，以暴露组和性别作为因素，然后使用GraphPad Prism 8.0.1软件进行Tukey事后检验，以比较不同实验组之间的差异。残差的正态性通过Shapiro-Wilk检验进行评估。所有结果均表示为平均值±标准误差（SEM），p值小于0.05的差异被认为具有统计学意义。组织病理学数据的统计分析通过使用SPSS软件（IBM，美国纽约）比较暴露组与未暴露对照组的得分来进行卡方检验。p值小于0.05被认为具有统计学意义。

**结果**
我们评估了草甘膦或草甘膦、二甲四氯和2,4-D混合物在监管允许的每日摄入水平下是否不仅会改变大鼠肠道微生物群的组成，还会影响肠道的完整性和功能，这包括雄性和雌性以及大肠和回肠，从发育的产前阶段开始。暴露于除草剂混合物的雄性动物体重有所下降（p = 1.1 × 10^-5）（补充图1A）。暴露于草甘膦NOAEL的雄性大鼠的水分摄入量较低（p = 0.0007）。在雌性中，暴露于草甘膦ADI（p = 4.6 × 10^-9）和NOAEL（p = 0.02）的组水分摄入量较低（补充图1B）。对照组和除草剂暴露组之间的食物摄入量没有统计学上的差异（补充图1C）。

**肠道炎症的测量**
我们首先评估了除草剂暴露是否会引起炎症，从而导致肠道菌群失调。首先，我们评估了草甘膦、二甲四氯和2,4-D除草剂混合物对雄性和雌性动物大肠盲肠和回肠组织中与炎症相关的基因Il22、Lcn2和Tlr4表达的影响（图1）（RT-qPCR检测的摘要统计见补充表1和2）。在暴露于草甘膦、二甲四氯和2,4-D除草剂混合物的动物中，与未处理的对照组相比，所有三个炎症标志基因在大肠（图1A-C）和回肠（图1D-F）中的表达均显著增加（p < 0.0001）。平均表达增加幅度在大肠中为4.1至10.2倍，在回肠中为4.5至8.1倍（补充表1和2）。总体而言，暴露后的敏感性更高，即大肠中的基因表达增加幅度大于回肠，特别是在Il22表达方面（图1A）。此外，在所有情况下，无论是雌性还是雄性动物，除Il22在回肠中的表达外，回肠和大肠中的表达水平都显著更高（补充图2；补充表1和2）。单独暴露于草甘膦的情况下，大肠（4.3至6.6倍）和回肠（3.7倍）中Lcn2的表达显著增加（图1B，E；补充表1和2）。我们还检测到雌性和雄性动物的大肠和回肠中Tlr4的表达显著增加（2.4至3.1倍）（图1C，F；补充表1和2）。仅在雄性大鼠的回肠中观察到Il22的表达增加（3.7倍）（图1D；补充表2）。此外，在草甘膦NOAEL组中，雌性大鼠的回肠和大肠中Lcn2的表达显著高于雄性（补充图2；补充表1和2）。在草甘膦EU ADI下，雄性和雌性动物的这些炎症标志基因的表达均没有变化（图1；补充表1和2）。

接下来，我们测量了calprotectin的水平，这是一种临床公认的肠道炎症标志物（Jukic等人，2021）。分析集中在大肠盲肠内容物上，我们观察到炎症标志基因的表达最大增加（图1；补充图2；补充表1和2）。在大多数情况下，由于值低于检测限（0.076 ng/mL），无法准确确定calprotectin水平，从而无法进行统计分析（图2）。然而，暴露于草甘膦、2,4-D和二甲四氯混合物的雌性大鼠的calprotectin水平远高于检测限，表明炎症反应增强。相比之下，无论是单独暴露于草甘膦的雄性还是雌性大鼠，在ADI或NOAEL下，calprotectin水平均未增加（图2）。

**图1**
该图像的替代文本可能是使用AI生成的。
**图2**
该图像的替代文本可能是使用AI生成的。
**图1**
草甘膦NOAEL和草甘膦、二甲四氯、2,4-D混合物增加了与肠道炎症相关的基因的表达。分析了暴露于草甘膦EU可接受每日摄入量（ADI）或无不良效应水平（NOAEL）或草甘膦、二甲四氯和2,4-D混合物（EU ADI）的大鼠的盲肠和回肠中的基因表达；Il22（A，盲肠；D，回肠）、Lcn2（B，盲肠；E，回肠）和Tlr4（C，盲肠；F，回肠）通过RT-qPCR检测。每个点代表一个动物的结果。每个数据集中的较长水平线表示平均值。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；****p < 0.0001，在Tukey多重比较检验中，该检验基于单向ANOVA。
**图2**
该图像的替代文本可能是使用AI生成的。
**图2**
盲肠内容物中calprotectin水平升高揭示了暴露于草甘膦、2,4-D、二甲四氯混合物的雌性大鼠的肠道炎症。分析了暴露于草甘膦ADI和No-observed adverse effect level（NOAEL）以及草甘膦、2,4-D、二甲四氯混合物的雄性大鼠的盲肠内容物中的calprotectin，使用ELISA检测。对照组、单独暴露于草甘膦的组和暴露于除草剂混合物的组的测量值低于检测限。每个点代表一个动物的结果。

**肠道完整性和通透性的评估**
肠道炎症与肠道通透性增加有关（Ahmad等人，2017）。肠道屏障完整性的受损可能导致肠道炎症，从而引发一系列健康问题。在大鼠模型系统中，这可能表现为关节炎（Hecquet等人，2023年）；在女性绝经期间可能导致骨密度下降（Shieh等人，2020年）；肥胖（Keirns等人，2023年）；心理健康问题（Madison和Bailey，2024年）以及癌症（Sánchez-Alcoholado等人，2020年）。因此，我们接下来通过测量大肠和回肠中紧密连接蛋白编码基因Muc2、Ocln、Zo1、Cldn3和Cldn4的表达来研究除草剂是否会影响肠道完整性和潜在的通透性。研究结果显示，接触草甘膦、二甲四氯和2,4-D混合物显著降低了雌性和雄性动物这些紧密连接蛋白编码基因的表达水平（p < 0.0001），无论是在大肠（图3A-E）还是回肠（图3F-J）中。在雌性动物中，大肠中的表达水平平均下降了16.7至25倍，回肠中下降了5.9至14.3倍（补充表1）。在雄性动物中，大肠中的表达水平平均下降了7.7至16.7倍，回肠中下降了4至10倍（补充表2）。接触草甘膦的ADI剂量并未对雌性或雄性大鼠的大肠（图3A-E）或回肠（图3F-J）中的这5个肠道完整性标志基因的表达产生可测量的影响（补充表1和2）。然而，在更高的草甘膦NOAEL剂量下，我们观察到雌性动物的大肠（图3A-E）和回肠（图3F-J）中所有5个肠道完整性标志基因的表达水平均显著下降（p < 0.0001）。同样，在雄性大鼠中，除了Muc2之外，所有肠道完整性标志基因的表达水平也显著下降（图3F-J）。这些下降幅度在大肠中平均为7.7至16.7倍，在回肠中平均为4至10倍（补充表1）。在雄性大鼠中，大肠中的表达水平平均下降了2.4至7.1倍，回肠中平均下降了2至4.8倍（补充表2）。值得注意的是，草甘膦在NOAEL剂量下的影响在大肠中比在回肠中更为明显，而在雌性动物中比在雄性动物中更为显著。

图3：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

草甘膦的NOAEL剂量以及草甘膦、二甲四氯和2,4-D混合物会降低紧密连接蛋白编码基因的表达。分析了从GD6开始直到断奶后13周，暴露于可接受日摄入量（ADI）和未观察到不良效应水平（NOAEL）的草甘膦，以及ADI混合物（包含二甲四氯、草甘膦和2,4-D）的大鼠的盲肠和回肠中，编码紧密连接蛋白Muc2（A，盲肠；F，回肠）、Ocln（B，盲肠；G，回肠）、Zo1（C，盲肠；H，回肠）、Cldn3（D，盲肠；I，回肠）和Cldn4（E，盲肠；J，回肠）的基因的表达情况，使用RT-qPCR方法。每个点代表一只动物的结果。每个数据集中的水平线表示平均值。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；****p < 0.0001（在Tukey多重比较测试中）。在单因素方差分析之后）。比较雌性和雄性大鼠这些肠道完整性标志基因的表达情况显示，仅在大肠中，雌性的Cldn4表达水平略有但显著降低（p < 0.05）（补充图3）。

为了确认肠道屏障完整性的受损，正如紧密连接蛋白编码基因表达水平的变化所表明的那样（图3），我们测量了血清中的紧密连接蛋白zonulin和肠道细菌脂多糖（LPS）的水平，因为如果肠道完整性受损，这两种物质的水平应该会上升。血清zonulin和LPS的水平是通过ELISA方法测量的，该方法已在临床环境中成功应用（Dutta等人，2019年；Zheng等人，2021年；Hoshiko等人，2021a, b；Hoshiko等人，2021a, b；Yuan等人，2021年；Niewiem等人，2022年）。分析显示，接触草甘膦、二甲四氯和2,4-D混合物导致雌性动物血清中这种蛋白质的水平平均增加了8倍（p < 0.0001），而在雄性动物中增加了2倍（但仍然显著，p < 0.05）（图4A）。雌性和雄性动物之间血清zonulin水平的4倍差异也具有统计学意义（p < 0.0001；补充图4）。通过分析血清中的细菌LPS浓度，进一步证实了暴露于除草剂混合物的雌性动物肠道屏障完整性的更大程度受损，LPS浓度从对照组的平均1.3ng/mL显著升高到1.308ng/mL（图4B）。

图4：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

血清zonulin和细菌脂多糖水平的升高表明，接触草甘膦、2,4-D和二甲四氯混合物会导致肠道完整性受损。分析了暴露于ADI剂量和NOAEL剂量的草甘膦，以及ADI混合物（包含草甘膦、2,4-D和二甲四氯）的大鼠的血清中zonulin（A）和细菌脂多糖（LPS）（B）的水平，使用ELISA方法。每个点代表一只动物的结果。每个数据集中的水平线表示平均值。*p < 0.05；**p < 0.01；****p < 0.0001（在Tukey多重比较测试中，该测试基于单因素方差分析）。

氧化应激

总体而言，我们的测量结果显示，与回肠相比，大肠在暴露于草甘膦NOA剂量以及草甘膦、2,4-D和二甲四氯混合物后，炎症更为明显（图1和2），肠道完整性也更为受损（图3和4）（补充表1和2）。导致这种肠道结构和功能完整性受损的一个机制可能是氧化应激引起的氧化失衡（Li等人，2023a，2023b）。为了验证这一可能性，我们测定了还原型谷胱甘肽（GSH）的水平、H2O2的分解速率、总抗氧化能力（TAC）、硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）和蛋白质羰基（CARBS），以了解这些因素是否对大肠的抗氧化能力和氧化应激有影响（图5），正如我们之前在同一组动物的肝脏中观察到的那样（Nechalioti等人，2023年）。暴露于草甘膦NOA剂量的雌性和雄性动物的GSH水平显著增加（p < 0.01），分别增加了166%和108%（图5A）。暴露于草甘膦、2,4-D和二甲四氯混合物的雌性大鼠的GSH水平显著增加了248%（p < 0.0001）；而雄性大鼠相比未处理对照组仅增加了87%（图5A）。除草剂混合物还导致雌性动物的GSH水平显著增加了113%（p < 0.001）（图5A）。与草甘膦ADI剂量组相比，GSH水平在暴露于草甘膦NOA剂量和草甘膦、2,4-D和二甲四氯混合物的雄性动物中平均增加了67%（p < 0.05）和86%（p < 0.01）（图5E）。然而，TBARS仅在暴露于除草剂混合物的组中增加，雌性（增加115%；p < 0.05）和雄性（增加53%；p < 0.05）大鼠中也有类似的效果（图5D）。这表明除草剂混合物的暴露导致了氧化应激，进而导致肠道膜脂质的过氧化。在H2O2的分解速率（图5B）和总抗氧化能力（图5C）方面，对照组和除草剂暴露组之间没有差异。

图5：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

我们通过ANOVA模型分析了暴露于草甘膦可接受日摄入量（ADI）和NOAEL剂量的草甘膦，以及ADI混合物（包含草甘膦、2,4-D和二甲四氯）的大鼠的大肠中抗氧化防御（GSH、H2O2分解速率、TAC）和氧化损伤（TBARS、CARBS）的情况。A：GSH浓度；B：H2O2分解速率；C：TAC水平；D：TBARS水平；E：CARBS水平。每个点代表一只动物的测量结果。*p < 0.05；**p < 0.01；****p < 0.0001（在Tukey多重比较测试中，该测试基于单因素方差分析）。

我们通过进行ANOVA模型分析来评估性别与暴露之间的交互作用。这种方法被认为是评估性别影响的最具统计有效性的方式，因为它使用了与计算除草剂暴露效应相同的统计模型（图1、2、3、4和5）。因此，所有的比较都是内部一致的，并基于相同的框架。ANOVA分析显示，除草剂暴露对性别有明显的特异性影响（补充表3），例如在几个参数中性别与除草剂暴露之间存在显著交互作用。例如，在盲肠中，交互作用项解释了Muc2基因表达总变异的0.81%（p = 0.0113），而在回肠中解释了1.65%（p = 0.0082）。总体而言，交互作用的幅度从0.25%到11.54%不等，其中血清中zonulin浓度的交互作用最为显著。

性别本身也对观察到的变化有显著贡献，性别因素解释了血清zonulin浓度变化的4.49%（p = 0.0023）和Il22基因表达变化的3.83%（p = 0.0016）（在回肠中）。然而，除草剂暴露的影响占主导地位，解释了大多数参数变化的80%以上，例如在盲肠中Muc2基因表达的变化达到了92.83%（p < 0.0001）。

肠道完整性的另一种受损机制可能是肠道微生物群组成的变化（Christovich和Luo，2022年；Aleman等人，2023年；Di Tommaso等人，2021年）。我们研究了除草剂对细菌和真菌群落的影响，因为之前我们发现草甘膦会影响大鼠肠道中的真菌，降低其定植能力（Mesnage等人，2022年）。在肠道中，真菌在维持肠道稳态和整体健康方面起着关键作用，通过参与营养代谢、免疫调节和维持平衡的微生物生态系统（Huseyin等人，2017年）。我们分析了盲肠和回肠区域的细菌多样性（图6）。ANOVA统计测试显示，除草剂暴露对细菌多样性没有明显影响（p = 0.047），尽管在暴露于草甘膦、2,4-D和二甲四氯混合物的动物组中观察到细菌多样性有所下降，但这种下降在事后TukeyHSD测试后未达到统计学意义（p = 0.09）（图6，左上角面板）。尽管如此，盲肠中的细菌多样性显著高于回肠（p = 0.0001）（图6，左上角面板）。从Bray-Curtis距离计算出的β多样性显示，不同组别之间的差异明显（p = 0.001），对照组与除草剂暴露组分离明显（图6，右上角面板）。在真菌种群中，变化更为明显。暴露于草甘膦ADI剂量或除草剂混合物的大鼠的肠道微生物组中，真菌的α多样性较低（p = 0.0005）或除草剂混合物（p = 0.0002）（图6，左下角面板）。由于检测到的物种数量较少，无法对真菌种群的β多样性进行精确的Bray Curtis距离计算。

图6：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

分析了暴露于草甘膦或草甘膦、2,4-D和二甲四氯混合物的大鼠的盲肠和回肠内容物的微生物组。比较了暴露于GD6开始直到断奶后13周的雌性（F）和雄性（M）大鼠的盲肠和回肠中细菌（左上角面板）和真菌（左下角面板）的α多样性。细菌（右上角面板）和真菌（右下角面板）的β多样性是通过Bray-Curtis距离来测量的并进行了可视化表示。在门水平上，细菌主要为厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）和变形菌门（Proteobacteria），其中厚壁菌门在盲肠中的比例高于回肠（补充表4）。拟杆菌门在回肠中的数量比在盲肠中更多。细菌的数量没有观察到变化，在门水平上是可以检测到的且结果稳定（补充图5）。肠道微生物组中的大多数真菌为子囊菌门（Ascomycota）（>99%），而担子菌门（Basidiomycota）的比例低于1%（补充图6）。在不同除草剂暴露组之间，这些真菌的比例没有变化（补充图7）。暴露于草甘膦或草甘膦、二氯苯氧乙酸（dicamba）和2,4-D混合物的大鼠肠道微生物组的变化在属水平上更为明显（图7）。由于性别之间没有明显差异，分析没有按性别分层进行，以提高统计功效。然而，分析分别针对盲肠和回肠两部分进行，这两部分的微生物组成存在差异（图6）。暴露于草甘膦ADI、草甘膦NOAEL或除草剂混合物后，盲肠中有9个、8个和9个细菌属发生了变化（图7A）。回肠中的变化较少，分别有1个、2个和4个细菌属受到草甘膦ADI、NOAEL或除草剂混合物的影响（图7B）。导致细菌数量最大变化的暴露是除草剂混合物，其中拟杆菌属（Bacteroides）或幽门螺杆菌属（Helicobacter）的一些菌株与促炎反应有关。这与Lachnospira、Akkermansia、Ruminococcus和Alistipes的数量减少同时发生，这些菌株是已知的短链脂肪酸（SCFAs）的生产者，通常与更平衡和抗炎的肠道环境相关。总体而言，这种微生物群的变化表明形成了一个促炎环境。

**额外提示：**
- 图中的文本可能是使用人工智能生成的。
- 完整尺寸的图像。
- 暴露于草甘膦或草甘膦、2,4-D、二氯苯氧乙酸混合物后差异丰度的细菌属：左侧面板为热图，显示与对照组相比，某种细菌属在盲肠（A）或回肠（B）中的丰度是增加（红色）还是减少（蓝色）。右侧面板（C）展示了差异最显著的个别属。统计显著性是通过使用动物ID作为随机效应的线性混合模型和 arcsin 转换后的丰度值来确定的。FDR（q值）用于判断统计显著性（+q<0.2, *q < 0.05; **q < 0.01; ****q < 0.0001）。每个点代表来自单个动物的测量值。

**进一步分析：**
为了了解除草剂暴露后微生物组组成改变可能带来的代谢功能后果（图6和7），使用Picrust2（Douglas等人，2020年）对细菌16S rRNA序列数据集进行了分析。结果显示，与对照组相比，与丁酸发酵相关的MetaCyc通路（PWY-5022、PWY-5676、P162-PWY、P163-PWY、CENTFERM-PWY、PWY-5677）在除草剂处理组中没有统计学上的显著差异（补充表5）。然而，在对照组与暴露于草甘膦ADI、草甘膦NOAEL和除草剂混合物的组之间，有66条、22条和2条MetaCyc通路的丰度发生了变化，调整后的p值低至6.8×10^-5（补充表6）。

**除草剂暴露的影响：**
草甘膦暴露导致了几条影响能量代谢的关键代谢通路的显著紊乱。值得注意的是，参与核苷酸代谢的通路受到影响，包括嘌呤和嘧啶脱氧核苷酸降解的超级通路，以及腺苷核苷酸的从头合成通路I和II。此外，与赖氨酸相关的氨基酸合成通路也发生了显著变化。对于蛋白质合成至关重要的tRNA充电通路也受到了干扰。碳水化合物代谢通路，包括蔗糖降解III（蔗糖 invertase）、糖酵解I（从葡萄糖6-磷酸开始）和糖酵解III（从葡萄糖开始）以及同型乳酸发酵，在除草剂暴露组和对照组之间也有显著差异。此外，对细胞壁和脂质代谢至关重要的通路也受到影响，如肽聚糖合成I（含有meso-二氨基吡梅酸）、肽聚糖合成III（分枝杆菌）、CDP-二酰甘油合成I和II以及gondoate合成（厌氧条件）。

**组织病理学分析：**
进行了组织病理学分析，以确定生化指标预测的炎症异常和肠道完整性受损是否在组织和细胞水平上可见（图1、2、3和4）。用于从无到重度分类病理情况的评分系统的结果汇总在表1和表2中。补充图8-11展示了观察到的主要病理情况的组织切片代表图像。

**结论：**
- 在暴露于欧盟草甘膦可接受日摄入量（ADI）、草甘膦无观察到的不良效应水平（NOAEL）以及草甘膦、二氯苯氧乙酸、2,4-D混合物后，雌性和雄性大鼠的回肠和盲肠均观察到正常的结构，没有明显的炎症或损伤迹象（表1和表2；补充图8-11，A面板）。
- 在盲肠中，草甘膦NOAEL组的4/10只雌性和5/10只雄性表现出轻度病理变化，如黏膜隐窝细胞形态改变（例如微泡/血管细胞质）（补充图8B、9B）。雌性（5/10；补充图8B）和雄性（5/10；补充图9B）大鼠还表现出轻度血管扩张和充血。草甘膦ADI组的雄性表现出更明显的改变，3/8只动物的细胞形态轻微改变，以及5/8例的黏膜下层中度慢性炎症和血管扩张、充血（补充图9C）。在草甘膦ADI组中，观察到4/10例轻度慢性炎症和5/10例的黏膜下层中度血管扩张和充血（补充图8C）。在草甘膦、2,4-D和二氯苯氧乙酸混合物暴露组中，雌性的最显著变化是血管严重扩张和充血，其中7/10只动物的白细胞边缘聚集在血管壁上。还观察到轻度局部炎症（4/10例）。
- 在盲肠中，草甘膦NOAEL组的病理评分显著高于对照组，尤其是在细胞形态和血管外观方面（p<0.05；表1）。在草甘膦ADI和除草剂混合物组中，与炎症和血管外观相关的病理情况也显著增加（p<0.05；表1）。在雄性动物中，暴露于草甘膦NOAEL和ADI的组中，所有参数的病理发生率显著增加，包括细胞形态和慢性炎症（p<0.05；表1）。
- 在回肠中，草甘膦NOAEL组的病理结果如下：雌性和雄性（补充图10B和补充图11B）的草甘膦NOAEL组均表现出绒毛高度降低和绒毛核心中度慢性炎症。草甘膦ADI组中，雄性（3/8例）和雌性（4/10例）的细胞形态有轻微变化（细胞大小；存在微泡细胞质；补充图10C、11C）。雌性6/10例和雄性3/8例的绒毛中出现中度血管充血和局部慢性炎症。
- 组织病理学分析显示，与对照组相比，草甘膦NOAEL组的细胞形态和血管外观有显著增加（p<0.05；表1）。在草甘膦ADI和除草剂混合物组中，病理情况的增加也显著（p<0.05；表1）。

**讨论：**
本研究是对草甘膦对肠道结构和功能影响的最全面调查，也是首次在大鼠模型系统中研究草甘膦与2,4-D和二氯苯氧乙酸联合使用的潜在毒性，这些剂量被认为是安全的（欧盟ADI、NOAEL）。我们的结果表明，与单独使用欧盟ADI剂量的草甘膦相比，大鼠暴露于草甘膦、二氯苯氧乙酸和2,4-D混合物（每种剂量均为其欧盟ADI）会引发肠道炎症和通透性增加，这与肠道渗漏状态相关。这些效应与氧化应激反应和微生物群结构的改变有关。单独使用欧盟NOAEL剂量的草甘膦也导致了类似的肠道炎症和完整性变化，尽管不那么明显，但同样与氧化应激反应相关。组织病理学分析证实了生化指标预测的大肠和回肠的结构改变和炎症。这些效应在雌性动物中比雄性动物更为明显。因此，我们的发现揭示了肠道微生物群和相关肠道功能的显著变化，对肠道健康有影响。

**值得注意的结果：**
- 在暴露于除草剂混合物和草甘膦NOAEL的雌性和雄性大鼠的大肠和回肠中，Il22、Lcn2和Tlr4等关键炎症介质的基因表达增加（图1），且在雌性动物中更为明显（补充图2）。与炎症标志物基因表达增加同时，与肠道通透性相关的基因（如Muc2、Ocln、Zo-1、Cldn3和Cldn4）的表达减少，这些基因也在暴露于除草剂混合物和草甘膦NOAEL的雌性和雄性大鼠的大肠和回肠中检测到（图3）。这些基因表达模式的变化在暴露于除草剂混合物的雌性大鼠中更为显著，表明草甘膦、二氯苯氧乙酸和2,4-D在允许的监管剂量下可以诱导肠道的促炎状态，引发了关于慢性炎症可能性的担忧。
- 雌性大鼠大肠中calprotectin的显著增加证实了暴露于除草剂混合物后肠道炎症反应的诱导（图2）。此前已有报道指出，大鼠（Tang等人，2020年）、小鼠（Panza等人，2021年；Lehman等人，2023年）和猪仔（Qiu等人，2020年）暴露于草甘膦后会出现肠道炎症。我们首次记录了与肠道通透性相关的基因表达变化，这表明肠道完整性可能受损，允许有害物质通过肠道壁，可能导致全身炎症和健康并发症（Jayashree等人，2014年）。
- 我们发现，在暴露于草甘膦、2,4-D和二氯苯氧乙酸混合物的大鼠中，血清中的肠道紧密连接蛋白zonulin和肠道细菌来源的LPS水平升高（图4），其中zonulin在雌性大鼠中的水平显著高于雄性（补充图4），这提供了肠道屏障功能受损的一致证据，并支持了全身炎症增加的观点，进一步强调了我们的发现的重要性。这一观察结果可能对健康产生长期影响，因为血液中zonulin和LPS水平的升高表明肠道屏障的完整性受损，这与Graves病（Zheng等人，2021年）、儿童食物过敏（Niewien等人，2022年）和代谢功能障碍（Hoshiko等人，2021a、b和2021b）等临床状况有关。此外，系统循环中的肠道细菌片段与多种慢性疾病的发展有关，包括动脉粥样硬化（Violi等人，2023年）、脂肪肝病（Kim和Ko，2018年）、2型糖尿病（Jayashree等人，2014年；Yuan等人，2021年）和癌症（Li等人，2023a、b）。我们测量的大肠抗氧化能力和氧化应激标志物（图5）突显了农药暴露对肠道健康的影响。还原型GSH和CARBS水平的升高表明氧化应激加剧，这可能意味着细胞成分和膜脂质受到损伤。暴露于除草剂混合物的大鼠中TBARS水平的升高进一步表明了脂质过氧化和氧化损伤。这些观察结果与同一动物肝脏中的发现一致（Nechalioti等人，2023年）。氧化应激的诱导是草甘膦产生毒性的最典型机制之一，这源于草甘膦与呼吸链复合物相互作用后线粒体功能的破坏（Chaufan等人，2014年；Bailey等人，2018年；Pereira等人，2018年）。此外，有充分证据表明2,4-D暴露会诱导氧化应激（国际癌症研究机构，Loomis等人，2015年）。这种除草剂被认为是一种强效的氧化应激诱导剂，因此可能在本研究中观察到的农药混合物的毒性效应中起着核心作用。这一可能性得到了我们在使用ToxTracker细胞培养检测系统进行的体外研究的支持，其中2,4-D引发了明显的氧化应激反应，而dicamba和草甘膦则没有（Mesnage等人，2021a）。此外，一项流行病学研究描述了农场工人在GBH施用后24小时内尿液中分子氧化应激标志物的显著增加（Chang等人，2023年），这表明这里呈现的动物模型中的现象也可能发生在人类身上。

对细菌和真菌微生物组组成的研究提供了关于农药暴露对肠道微生物群影响的见解（Tsiaoussis等人，2019年）。在细菌多样性水平上观察到的有限影响表明，总体细菌丰富度和多样性受到除草剂暴露的影响较小。然而，在属水平上发生了变化，特别是在暴露于除草剂混合物的组中，Helicobacter和Alloprevotella的水平较高，其中一些菌株已知会促进炎症状态（Hansen等人，2011年；Valour等人，2014年），这表明微生物组成受到了影响，可能改变了共生菌和病原菌的平衡。与此同时，已知产生短链脂肪酸（SCFA）的细菌水平下降，例如Lachnospira（Abdugheni等人，2022年）、Eubacterium spp（Louis等人，2010年）、Intestinomonas（Kl?ring等人，2013年）和Alistipes（Parker等人，2020年）。这些细菌种类的减少可能导致SCFA水平下降，从而可能增加炎症，正如本研究中观察到的那样。我们无法使用PICRUSt2计算工具确认细菌种类的变化是否导致了SCFA生产的减少，该工具可以预测与微生物组改变相关的功能变化（Douglas等人，2020年）。这可能是因为PICRUSt2是为人类微生物组数据集优化的，不太适合用于推断大鼠的毒理学信息，因为大鼠的微生物群在功能方面研究较少。尽管如此，PICRUSt2分析预测草甘膦暴露会破坏几个关键代谢途径，如能量代谢、核苷酸代谢、嘌呤和嘧啶脱氧核苷降解以及腺苷核苷酸的从头合成途径I和II（补充表5和6）。然而，这些预测的代谢变化的毒理学相关性仍不确定，因为需要通过直接实验（如非靶向代谢组学）来确认。我们之前在一个大鼠模型系统中证明了草甘膦及其基除草剂能够改变肠道微生物组的组成和功能，代谢组学显示了氧化应激的诱导（Mesnage等人，2021c）。在随后的研究中，我们发现从妊娠前开始暴露于草甘膦及其基除草剂的大鼠中，细菌微生物群显著改变，有利于机会性真菌的生长（Mesnage等人，2022年）。

迄今为止发表的两项关于2,4-D对小鼠微生物组影响的研究显示，促炎细菌（如Deferribacteres（Romualdo等人，2023年）和Spirochaetes（Tu等人，2019年）的数量增加。在我们的研究中，这两种细菌的数量没有变化，可能是由于小鼠和大鼠之间的反应差异。相比之下，据我们所知，目前还没有研究探讨dicamba对肠道微生物组的影响。虽然无法区分暴露于草甘膦、2,4-D、dicamba混合物中各个化合物的贡献，但我们的研究首次确定了本研究中测试的环境相关除草剂混合物对肠道微生物群可能产生的影响标志物。

肠道功能和微生物组组成的改变与人类肠道菌群失调的病因学相符。在健康的肠道中，通过控制释放电子受体（如氧气）来维持氧化还原状态的平衡，从而调节微生物的能量来源（Litvak等人，2018年）。炎症期间的氧化应激可能会促进有害细菌的生长，从而抑制有益微生物的生长，导致菌群失调。这反过来又可能导致肠道屏障的脆弱性，引发肠道渗漏。这表明所测试的除草剂对肠道微生物群的影响可能源于它们改变氧化还原反应的能力，许多研究都证明了这一点（Mesnage和Antoniou，2021年）。

我们研究的局限性在于，我们仅测试了草甘膦、2,4-D和dicamba的混合物，因此无法确定观察到的肠道菌群失调是由于所有三种除草剂共同作用还是其中两种（草甘膦加2,4-D、草甘膦加dicamba、dicamba加2,4-D）的作用。此外，这一知识空白也限制了我们对除草剂混合物毒理学的理解，即这些除草剂之间是否存在叠加或协同作用。此外，没有评估农业和非农业环境中使用的代表性商业草甘膦、dicamba和2,4-D制剂，这也限制了我们对这些产品中存在的共成分的毒理学贡献的评估（Mesnage和Antoniou，2018年；Mesnage等人，2019年）。然而，这些信息的缺乏并不影响我们发现的健康意义，因为我们的研究旨在反映监管机构的实践以及人类同时暴露于这三种除草剂的现实世界情况。因此，从这一角度来看，三种或仅两种除草剂活性成分的组合是否导致肠道健康问题是一个次要但有趣的考虑因素。我们研究的另一个局限性是它仅关注了一个时间点（断奶后13周，暴露在妊娠中期开始），因此没有探讨这些除草剂对肠道健康的潜在长期影响。实际上，在除草剂暴露期结束时的动物并没有表现出明显的外部健康问题。然而，我们在仅亚慢性暴露期间就观察到了肠道结构和功能的明显改变，这表明更长时间的暴露可能会导致肠道健康问题，进而影响其他生理系统的功能。尽管如此，需要长期的（1-2年）暴露期来全面了解肠道健康变化的轨迹和持久性（Docea等人，2018年）。

我们的发现也可能具有监管意义。首先，鉴于肠道结构和功能完整性在健康和疾病中的重要性，我们的结果增加了越来越多的证据，表明将我们在这里呈现的测量方法纳入农药风险评估是必要的。其次，我们观察到暴露于草甘膦、dicamba和2,4-D混合物（每种除草剂均以其欧盟允许日摄入量ADI剂量）会导致肠道结构和功能的显著改变，这建立在之前的研究基础上（Mesnage等人，2021b、d）。这些结果共同表明，基于单一农药风险评估的ADI值可能是不准确的——这对公共卫生有影响。

结论

这项研究提供了关于草甘膦及其与dicamba和2,4-D混合物对肠道结构、微生物组组成和生理功能潜在危害的重要见解。观察到的炎症标志物、屏障完整性、氧化应激和微生物组组成的改变表明，这些农药对肠道结构和功能有多方面的影响，包括肠道屏障完整性的受损。这些结果在大肠和雌性动物中更为明显，表明胃肠道区域和性别可能存在敏感性差异。然而，需要进一步的研究来阐明这些农药通过何种机制对肠道产生影响，以及潜在的长期健康风险。我们的结果对美国尤为重要，因为该国正在持续增加2,4-D和dicamba的使用，导致人类暴露量增加（Daggy等人，2024年；Gillezeau等人，2020年），其健康影响目前尚不清楚。总之，我们的观察结果表明，需要继续进行研究，以更好地了解农药混合物对人类和环境健康的长期影响。