Langat病毒感染可在蜱虫吸血后24小时内于唾液腺和中肠同时被证实

《Viruses》：Langat Virus Infection Can Be Demonstrated in Both Tick Salivary Glands and Midgut Within 24 Hours of Blood Feeding Missiani Ochwoto, Danielle K. Offerdahl, Edwin O. Ogola, Barbara C. Weck, Dan Long, Greg A. Saturday and Marshall E. Bloom

　　

蜱传黄病毒（Tick-borne flaviviruses, TBFVs）如Langat病毒（LGTV）感染节肢动物宿主并在其中传播扩散的详细机制与序列尚不清楚。为了表征这些过程，研究人员利用人工膜饲喂系统（artificial membrane feeding chambers）使成年肩突硬蜱（Ixodes scapularis）吸食含有LGTV的血液。在蜱虫附着后的24、48、72和96小时（h），研究人员解剖部分饱血的蜱虫以获取中肠和唾液腺。组织学分析证实，随着吸血进程，消化上皮谱系细胞发生感染；在吸血过程中观察到了中肠生发细胞（generative cells）及分化程度更高的功能性消化细胞（digestive cells）的感染。在感染后48小时，在这些细胞中可轻易检测到病毒包膜（E）蛋白、非结构蛋白3（NS3）和双链RNA（dsRNA）。平行分析表明，唾液腺腺泡（acini）中的细胞在48小时时也受到感染，病毒靶细胞似乎是II型和III型腺泡中的颗粒细胞（granular cells）。因此，在48小时时，唾液腺和中肠均显示出直接的感染证据。虽然在24小时时未观察到病毒染色，但当器官在24小时时被取出并进行单独离体培养（ex vivo）时，检测到了病毒。综上所述，研究结果表明LGTV在吸血餐的最初24小时内即可感染唾液腺和中肠。这些发现应促使人们对受感染蜱虫体内TBFV的系统性传播进行重新评估。

论文解读：Langat病毒在蜱虫吸血早期对唾液腺与中肠的快速侵染机制

研究背景与意义

蜱传黄病毒（Tick-borne flaviviruses, TBFVs）构成了日益严重的全球公共卫生威胁，尽管已有有效疫苗，但感染病例仍呈上升趋势。在自然循环中，TBFVs依赖硬蜱属（Ixodes）蜱虫作为媒介，病毒在蜱体内呈持续性感染并可经卵传递（transovarially）和跨龄期传递（transstadially）。然而，病毒在节肢动物宿主体内的精确生物学特性，特别是病毒在蜱虫吸血后何时、以何种顺序侵染哪些器官，目前尚不明确。既往观点认为病毒需经中肠（midgut）侵入并复制后，再扩散至唾液腺（salivary glands）实现传播，但这一过程的时间节点缺乏细致的实验数据支持。本研究选用Langat病毒（LGTV）作为Powassan/deer tick virus (POWV/DTV) 的生物安全二级（BSL2）替代模型，旨在利用可控的人工膜饲喂系统，阐明LGTV在成年肩突硬蜱（Ixodes scapularis）吸血过程中的早期感染动力学，相关成果发表在《Viruses》杂志。

关键技术方法

研究人员从俄克拉荷马州立大学蜱虫饲养设施获取并维持蜱虫。采用基于人工膜饲喂系统的改良方案，使成年蜱虫吸食添加了7.5 × 10³ffu/mL LGTV（TP21株）的无菌去纤维蛋白牛血。在附着后24、48、72或96小时收集蜱虫，立即解剖分离中肠和唾液腺。样本分为两组：一组直接进行组织病理学分析；另一组进行离体培养（ex vivo）72或168小时以观察潜伏期感染。利用苏木精和伊红（H&E）、高碘酸-希夫（PAS）染色观察形态学变化，并通过免疫组织化学染色检测病毒包膜（E）蛋白、非结构蛋白3（NS3）及双链RNA（dsRNA）。此外，通过免疫聚焦试验（immunofocus assay）对离体培养上清液进行病毒滴度测定。

研究结果

1. 蜱虫吸血行为与器官形态学变化

利用人工膜饲喂腔室，约30%-40%的蜱虫成功附着吸血。雌性蜱虫在慢速吸血期（0-120小时）体长逐渐增加，在快速吸血期（120-192小时）体宽和周长显著增加。组织学分析显示，随着吸血进行，中肠和直肠囊显著增大。未吸血蜱虫的中肠壁由单层生发细胞（GCs）构成；吸血过程中，GCs增殖并分化为成熟的消化细胞（DGs），随后许多脱落消化细胞（DDGs）进入肠腔。唾液腺同样发生显著变化，三种类型的腺泡（acini type I, II, III）在吸血过程中形态各异，其中II型和III型腺泡富含颗粒。

2. LGTV在中肠的感染特征

通过对NS3和E蛋白的免疫荧光染色，研究人员在吸血48小时的蜱虫中肠中观察到了直接的病毒感染证据。感染的细胞主要是基于形态和位置鉴定的GCs和DGs。早期感染细胞呈孤立分布，72小时形成簇状。值得注意的是，虽然平滑肌细胞网络（经鬼笔环肽phalloidin染色）未显示感染迹象，但吸血蜱虫消化细胞的刷状缘或微绒毛（microvilli）尺寸增大且肌动蛋白聚合呈阳性。

3. LGTV在唾液腺的感染特征

免疫荧光检测显示，在吸血48小时和72小时的蜱虫唾液腺中存在LGTV感染。信号定位于II型和III型腺泡的含颗粒细胞中，导管内层细胞未见感染迹象。在单个感染的腺泡内，小叶导管细胞似乎未受感染，而外周腺泡细胞呈阳性染色。随着吸血时间延长，感染细胞数量增加，但在整个研究期间未发现I型腺泡感染。

4. 24小时时间点中肠与唾液腺感染的比较

在附着后24小时直接检查中肠和唾液腺切片时，未观察到直接的感染证据。然而，若将蜱虫在24小时移除并离体培养72小时后，则能在中肠DG和唾液腺II型/III型腺泡中观察到病毒感染。这表明在24小时时已发生了初始感染，但病毒载量低于检测限。

5. 感染中肠与唾液腺的病毒释放验证

对感染蜱虫的中肠和唾液腺进行为期六天的离体培养，每日收集上清液进行免疫聚焦试验。结果显示，病毒滴度呈现近2 log₁₀的增长，进一步证实了LGTV在吸血开始后24小时内即已发生感染并启动复制。

结论与讨论

本研究详细描述了LGTV在成年雌性肩突硬蜱中肠和唾液腺中的感染情况，证明了其可在受感染血液餐的最初24小时内发生。中肠的靶点是消化细胞谱系的细胞，而唾液腺的靶点则是II型和III型腺泡中的含颗粒细胞。这一发现挑战了传统认为病毒必须首先在中肠大量复制后再扩散至唾液腺的观点，提示了病毒可能在吸血极早期即通过某种机制突破了中肠屏障，甚至可能存在不经中肠复制的直接传播途径。该研究揭示了TBFV在媒介蜱虫体内传播的快速性，对于理解蜱传病毒的流行病学以及制定防控策略具有重要的科学意义。论文最后指出，关于幼虫和若虫阶段是否遵循相同的感染时序、雄性蜱虫的感染模式以及病毒在蜕皮期间的潜伏部位等问题仍需进一步研究。