《Viruses》：Genotype Diversity of Highly Pathogenic Avian Influenza H5N1 Clade 2.3.4.4b in Pennsylvania Poultry During Disease Outbreak from April 2022 to March 2023
Deepanker Tewari,
Manoj K. Sekhwal,
Chrislyn Nicholson,
Mary L. Killian,
Corey Zellers,
Julia Livengood,
Kristina Lantz,
Mia Torchetti and
Alex Hamberg
编辑推荐：
2022年高致病性禽流感（HPAI）H5N1分支2.3.4.4b疫情是主要禽流感疫情之一，导致多次溢出事件，感染了家禽和野鸟群以及哺乳动物。病毒在北美迁徙路线野鸟中的持续传播导致了疫情的扩散。宾夕法尼亚州拥有重要的家禽种群，支持零售和活禽市场。该州还位于大西洋
2022年高致病性禽流感（HPAI）H5N1分支2.3.4.4b疫情是主要禽流感疫情之一，导致多次溢出事件，感染了家禽和野鸟群以及哺乳动物。病毒在北美迁徙路线野鸟中的持续传播导致了疫情的扩散。宾夕法尼亚州拥有重要的家禽种群，支持零售和活禽市场。该州还位于大西洋迁徙路线上，是候鸟中途停留地，增加了感染HPAI的风险。本研究调查了2022年宾夕法尼亚州疫情期间H5N1分支2.3.4.4b病毒的临床表现和序列数据。在第一年检测到八种不同的H5N1分支2.3.4.4b基因型（A1、B1.1、B1.2、B1.3、B2.2、B3.3、B3.5和一种次要基因型）。最早在2022年4月于商业家禽中检测到基因型A1，这是一种完全欧亚来源的病毒。所有其他鉴定出的基因型均为A1与北美禽流感基因片段（以“B”表示）的重配株。基因型B3.3在首次溢出到活禽市场系统之前是一种罕见基因型，但直到2023年9月仍在宾夕法尼亚州及周边州的后院禽群中占主导地位。此后未在迁徙水禽中检测到基因型B3.3，表明该基因型已减弱且不再传播。本研究揭示了2022年宾夕法尼亚州家禽疫情中H5N1的基因型多样性，有助于理解病毒进化及其潜在影响。
研究背景与意义
高致病性禽流感病毒（HPAI）H5N1分支2.3.4.4b自2021年10月起在欧洲国家传播，并于2021年12月首次在美国南卡罗来纳州的野水禽中检测到。此后，该病毒已传播至美国几乎所有州的150多种野鸟物种，导致大量死亡事件。病毒在北美四大迁徙路线上的持续传播促进了与现有低致病性禽流感病毒（LPAI）在野鸟中的基因重配。这些广泛的重配事件，加上病毒复制过程中RNA依赖的RNA聚合酶的低保真度，导致迄今出现了超过100种遗传构型。此次疫情被宣布为历史上最大的禽流感疫情之一，涉及多次溢出事件，影响了哺乳动物和禽类物种。
HPAI疫情对商业和家庭后院家禽养殖产生重大影响，病毒导致家禽高发病率和高死亡率。为控制疾病传播，禽群被扑杀，家禽销售受到限制或暂停。2022年美国国内家禽中首次检测到HPAI疫情，此后因死亡或扑杀导致超过1.75亿只禽类损失，造成重大经济损失。宾夕法尼亚州的家禽业是其重要农业部门，2022年收入超过20亿美元。该州位于大西洋迁徙路线上，是许多候鸟的关键中途停留点。2022年HPAI疫情的疾病传播模型预测，宾夕法尼亚州东南部地区未来感染风险较高，部分原因是野鸟迁徙和2020年COVID-19大流行期间后院禽群数量的增加。因此，评估H5N1对商业和家庭后院家禽种群的影响至关重要。本研究旨在描述2022年4月至2023年3月期间宾夕法尼亚州商业和家庭后院禽群中检测到的H5N1分支2.3.4.4b的临床症状和基因型，并特别关注主要在供应活禽市场的家庭后院和家禽群中检测到的一种特定基因型。
研究方法
研究人员收集了商业和家庭后院家禽场所的样本（包括鸡的气管拭子和鸭的泄殖腔拭子），通过实时逆转录聚合酶链反应（rRT-PCR）进行甲型流感病毒（IAV）筛查，并对非阴性样本进行全基因组测序。使用GenoFLU版本1.04对175条H5N1全基因组序列进行基因分型。通过最近共同祖先时间（TMRCA）分析、系统发育分析以及vSNP（variant SNP）分析，探讨病毒进化与传播关系。样本来源于宾夕法尼亚州动物诊断实验室系统（PADLS）和美国农业部国家兽医服务实验室（NVSL）。
研究结果
3.1. 家禽中的H5N1感染与临床症状
在2022年4月至2023年3月期间，宾夕法尼亚州15个县的家禽中检测到HPAI H5N1分支2.3.4.4b。共67个商业和家庭后院禽群受到影响，包括10个商业蛋鸡和肉鸡场、11个火鸡场、10个鸭场以及36个混合物种的后院禽群。感染禽群主要集中在兰开斯特县、伯克斯县、利哈伊县和切斯特县。共进行了42,695次PCR检测，筛查了约451,303只禽类。
鸡的临床症状包括死亡率增加、抑郁、产蛋量下降、鼻腔分泌物，部分无临床症状。鸭表现为死亡率增加、神经症状、腹泻、饮水量减少、产蛋量下降、呼吸道症状、抑郁，部分无临床症状。火鸡主要表现为死亡率增加或无临床症状。后院禽群（主要是鸭，也包括鸡、火鸡、鹅、珍珠鸡和鹌鹑等混合物种）表现为无临床症状，或出现结膜炎、喘息、鼻腔分泌物等呼吸道症状，以及死亡率增加、嗜睡、腹泻、神经症状、产蛋量下降和采食量减少。临床症状的出现与禽流感病毒（IAV）检测时机密切相关。通常在诊断后24小时内实施安乐死，此时临床症状尚未出现或较轻微。建立HPAI控制区并实施强制性每周AIV监测后，病例被迅速识别，观察到的临床症状较少。
3.2. H5N1基因分型与基因型B3.3基因组分析
基因分型分析共鉴定出八种基因型：A1、B1.1、B1.2、B1.3、B2.2、B3.3、B3.5和minor24。其中基因型A1和B3.3检出频率最高。基因型B3.3是A1基因型与北美（am）PB2、PB1、NP和NS片段的四基因重配株。该基因型仅在短时间内传播，但除A1基因型外，其感染水平最高。
TMRCA分析显示，早期B3.3基因型聚集在一起，代表至少三条迁徙路线，病毒来自加拿大、伊利诺伊州、密歇根州、北卡罗来纳州和德克萨斯州。2023年宾夕法尼亚州的B3.3病毒在鸭、鹅、鸡、火鸡和珍珠鸡中快速传播，与早期病毒分开聚类。2023年基因型B3.3集群包括来自纽约、新泽西和弗吉尼亚的病毒，表明强烈的区域连通性。vSNP分析进一步证实了这一点。
各基因片段的单独系统发育分析进一步证实了这些发现。所有病毒基因组在可用数据中显示超过99%的同一性，包括与宾夕法尼亚州一只红尾鹰病毒序列的对比。vSNP和系统发育分析表明，B3.3在宾夕法尼亚州家禽种群中快速扩张，包括后院鸭、鸡、鸸鹋、鹌鹑以及商业珍珠鸡、鸭、鸡和火鸡群。数据审查和分析还显示，多个禽群在短时间内感染相同基因型，且该基因型内存在明显集群。病毒仅在一只食腐动物（秃鹫）和一只猛禽中检测到，且自家禽疫情结束后未在野生迁徙鸟类中检测到基因型B3.3。B3.3序列的vSNP分析识别出代表纽约、弗吉尼亚和宾夕法尼亚活禽市场的病毒集群。
讨论与结论
2022年由H5N1分支2.3.4.4b引起的高致病性禽流感疫情是历史上规模最大的疫情之一。疫情导致感染家禽被扑杀，造成重大经济损失，甚至影响了一些哺乳动物。此外，疫情还引发了对农业工人健康风险的担忧。宾夕法尼亚州庞大的家禽产业和众多的后院禽群增加了该州的脆弱性，主要的鸟类迁徙路线进一步加剧了疾病控制工作的复杂性。监测和减轻HPAI对于保护农业经济和全球生物安全至关重要。
宾夕法尼亚州禽群感染H5N1分支2.3.4.4b的临床症状与美国农业部描述的HPAI感染症状一致。鸡表现为死亡率增加、抑郁、产蛋量减少、鼻腔分泌物或无临床症状。鸭表现为死亡率增加、神经症状、腹泻、呼吸道问题，轻微病例症状较少或无。火鸡主要表现为死亡率增加或无临床症状。混合后院禽群表现为呼吸道症状、嗜睡、神经症状、产蛋量减少和采食量下降。监测死亡率、饮水量和产蛋量是及时发现禽群疾病问题的重要指标。大多数病例缺乏广泛的临床症状，可能是由于通过有效监测和流行病学调查早期发现。这些发现强调了监测监控和主动策略对于有效管理商业和家庭后院禽群H5N1疫情的关键重要性。
宾夕法尼亚州H5N1序列的基因分型分析表明存在多种基因型，包括A1、B1.1、B1.2、B1.3、B2.2、B3.3、B3.5和minor24。基因型A1和B3.3在家禽中检测频率最高。家禽中的感染高峰出现在2022年春季（A1）和2023年春季（B3.3），与候鸟迁徙时间一致，此时点源引入风险最高。基因型B3.3事件与初始野鸟暴露后在家禽中的横向传播一致，进一步在宾夕法尼亚州传播，随后在邻近州的家禽中检测到。B3.3在家禽中的事件结束后，没有证据表明其在野生迁徙鸟类中继续传播；在该基因型在家禽中传播期间，仅在食腐动物（秃鹫）和猛禽中有两次检测。
2023年初春，基因型B3.3在宾夕法尼亚州家禽种群中的检测和进一步传播影响了至少14个后院禽群和3个商业禽群。B3.3序列在多个病毒片段上表现出高度相似性（≥99%成对同一性），表明不同地点毒株之间的遗传变异有限。这强调了农业和生产中生物安全实践在避免传染病溢出事件中的重要作用。
结论
总之，2022-2023年宾夕法尼亚州的HPAI疫情对家禽种群和农业产生了显著影响。感染高峰与春季候鸟迁徙之间的相关性表明，候鸟，特别是大西洋迁徙路线上的候鸟，在宾夕法尼亚州病毒传播的启动中发挥了核心作用。在宾夕法尼亚州以外检测到基因型B3.3，突显了加强生物安全以及持续关注有效检测和监测策略的必要性，特别是针对 destined for live bird markets 的禽类。总体而言，本研究提供了关于2022年宾夕法尼亚州疫情期间H5N1基因型多样性的宝贵信息，强调需要持续监测和监控，以减轻未来对家禽、牲畜和公共健康的风险。
