三亚湾热带潮间带沙地病毒群落的年度动态与功能性状

《Viruses》：Annual Dynamics and Functional Traits of Viral Communities in Tropical Intertidal Sands of Sanya Bay Zijia Wang, Zongminghan Liu, Juntao Zeng, Jiwei Li, Jiahao Cheng, Xiaoxue Qi, Jingwen Li and Shijie Bai

　　

摘要 病毒是海洋微生物群落的关键调节者，但其在热带潮间带沉积物中的时间动态仍缺乏充分表征。研究人员对三亚湾沙质潮间带沉积物进行了一整年的宏基因组监测（从五个站点采集了60份月度样本），以解析病毒的分类、群落结构、裂解蛋白及辅助代谢基因（AMG）。在可分类的部分中，病毒群落始终以Assiduviridae（科）为主。然而，NMDS（非度量多维尺度）分析显示整体存在显著的季节性变化，10月至12月的样本与其他月份明显分离。共现网络分析识别出五个具有不同时间模式的共现模块，同时10月期间模块丰度与裂解蛋白同步下降。功能注释表明，在半胱氨酸和甲硫氨酸代谢途径中（主要由DNA甲基转移酶驱动），在被注释的功能中属于高度代表性的AMG类别，而其他通路则呈现季节性变异。总体而言，这些研究结果表明，尽管热带潮间带病毒群落以Assiduviridae为主导，但其高度复杂的结构和功能潜力经历了显著的季节性重组。

研究背景与问题

病毒是海洋环境中数量最多的生物实体，其丰度约是原核生物的十倍。作为微生物领域的重要组成部分，病毒与微生物适应和生态系统功能相关，同时是海洋生物多样性的主要驱动力。它们每天转化10%至20%的生物量，通过病毒分流（viral shunt）将有机物转化为溶解性营养物质，塑造热带和亚热带区域的全球生物地球化学循环。潮间带作为陆海交界处的重要生态交错带，是全球分布最广的沿海生态系统之一。这些环境以极端的环境异质性为特征，潮汐振荡在分钟到小时尺度和厘米级空间梯度上引发频繁的需氧与缺氧/低氧状态之间的快速转换。这种动态的物理化学条件需要居民微生物具备灵活的适应策略，导致群落结构比其他自然栖息地更具变异性。在这些复杂的底栖系统中，病毒与微生物种群动态和群落更替相关。先前的研究表明，病毒-原核生物比率（VPR）通常没有显著的季节性模式。然而，针对热带区域的系统性研究仍然稀少。本研究旨在通过提供热带潮间带生境中病毒群落动态的高分辨率年度视角，填补这一空白。

研究概要

本论文发表在《Viruses》，是一项针对中国典型热带沿海生态系统——三亚湾潮间带沙地中病毒群落的全年宏基因组学研究。研究人员通过每月从五个站点（A、B、C、D、E）采集沉积物样本，共获得60份高分辨率时间序列样本，利用宏基因组测序、病毒序列识别、病毒宏基因组组装基因组（vMAG）分箱、分类学与功能注释、共现网络构建及统计分析等方法，系统解析了病毒群落的分类组成、结构动态、裂解蛋白丰度及辅助代谢基因（AMG）的季节性变化。研究旨在明确核心分类结构、共现网络的模块化组织、裂解机制的时态动态以及AMG参与的代谢通路。研究结果表明，尽管可分类的病毒部分以_{Assiduviridae}为主，但群落整体在结构和功能潜力上经历了显著的季节性重组，特别是10月作为过渡期，伴随模块丰度和裂解蛋白的同时下降。AMG功能分析显示，半胱氨酸和甲硫氨酸代谢途径全年保持高丰度，而光合作用、硫代谢等途径则表现出严格的季节性限制。这项工作为理解热带潮间带病毒群落的生态角色和功能适应性提供了重要见解。

关键技术方法概述

研究样本来自2024年1月至12月期间在三亚湾沿海五个站点（A、B、C、D、E）每月采集的潮间带表层沙沉积物（0–5 cm深度），共60份。样本于低潮时采集，立即转移至含冰袋的便携式冷却箱，实验室-20°C保存，后存于-80°C直至分析。使用DNeasy PowerSoil Pro Kit（QIAGEN）提取DNA，经Illumina NovaSeq平台（PE150）进行宏基因组测序。原始reads经fastp v0.23.4进行质量过滤和接头去除，高质量reads通过SPAdes v3.15.4（meta模式，k-mer值21、33、55）进行从头组装。病毒序列通过ViWrap v1.3.0（整合VirSorter2 v2.2.4和VIBRANT v1.2.1）从组装contigs（最小长度1 kb）中识别，并使用vRhyme v1.1.0分箱为943个vMAGs，进一步通过dRep v3.6.2以95% ANI阈值去冗余，保留203个代表性病毒基因组。病毒分类通过PhaGCN v2.3.0推断。AMG通过DRAM v1.5.0（整合于ViWrap流程）识别，裂解蛋白（包括spanins、holins和endolysins）通过HMMER v3.4比对Prokaryotic DNA Virus Lytic Protein Database进行注释。下游统计分析在R v4.5.2中完成，共现网络基于Spearman相关（|r| > 0.6，BH校正p < 0.05）通过ggClusterNet v2.0构建，仅保留在所有60个样本中累积相对丰度≥1%的vMAGs。

研究结果

病毒群落组成

在可分类的病毒序列中，_{Assiduviridae}（科）是唯一最普遍且丰度最高的已知病毒科，在所有采样站点（A–E）和整个12个月期间持续存在，表明其在三亚湾底栖病毒景观中是一个稳定的组成部分。然而，很大一部分回收的病毒序列无法归入任何已知病毒科。

群落结构季节性变化

基于Bray–Curtis和Jaccard距离的NMDS（非度量多维尺度）分析显示，病毒群落存在显著的整体季节性变化，10月、11月和12月的样本聚集在一起，并与1月至9月的样本明显分离。PERMANOVA和MRPP分析证实了月份（R²= 0.41, p = 0.001）和站点（R²= 0.14, p = 0.001）的显著影响，但月份效应占主导。

共现网络与模块动态

共现网络分析将群落划分为五个不同的共现模块。模块1中的_{Plymouthvirus}、_Immutovirus、_{Unclassified_Caudoviricetes}和_{Unclassified_Schitoviridae}被识别为连接者（connectors），而模块2中的_Noahvirus被识别为模块枢纽（module hub）。模块相对丰度在全年呈现波动：模块1在年初组合中最为丰富，2月达到峰值后于4月迅速下降；模块5在6月开始稳步增加，9月达到峰值。10月所有模块丰度同步下降，表明网络状态发生显著转变。

裂解蛋白动态

病毒裂解蛋白（lytic proteins）丰度分析显示，内溶素（Endolysins）是所有样本中鉴定出的最丰富类别，其中溶菌酶（Muramidase）和内肽酶（Endopeptidase）在12个月期间保持最高的相对丰度。内溶素显示出清晰的季节性趋势，而孔蛋白（holins）和跨膜蛋白（spanins）则呈现更零星的分布，没有明确的月度模式。裂解潜力在5月至9月普遍增加，6月达到峰值，此时转糖基酶（transglycosylase）、m-EAD和溶菌酶等多个蛋白亚类达到年度最大值。10月几乎所有裂解蛋白类别的丰度急剧下降，显著低于9月，与群落结构分析中观察到的转变一致。

辅助代谢基因（AMG）与代谢通路

在已识别的AMG类别中，半胱氨酸和甲硫氨酸代谢是被注释功能中代表性最高的通路，主要由DNA甲基转移酶基因（_DNMT1和_DNMT3A）驱动。该通路全年保持高且稳定的相对丰度，但在10月达到年度最低值。其他主要功能类别包括全年保持稳定的卟啉和叶绿素代谢（主要由_cobS和_cobT主导）以及在1月至3月期间丰度显著的烟酸和烟酰胺代谢（由_NAMPT和_nadM支持）。与叶酸（folate）生物合成和一碳库（one-carbon pool）相关的通路（涉及_que和_fol基因家族）表现出不同的时间模式：叶酸生物合成在10月达到峰值，而一碳库则相对稳定。类似地，主要由_wbp基因家族代表的氨基糖代谢也在10月达到最大占比。值得注意的是，某些通路表现出强烈的季节性限制：光合作用（主要由_psbA代表）几乎只在10月至12月检测到，而硫代谢（主要由_cysH代表）则限制在3月至9月期间。在排名前10的通路中，脂多糖（LPS）生物合成以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢的相对丰度最低。前者在年底急剧增加，后者则始终较低。

讨论与结论

研究发现，在可分类部分中，_{Assiduviridae}（科）在研究区域全年的已知病毒组成中持续占主导地位，尽管存在显著的空间异质性，但月度变化是主要驱动力。NMDS分析将群落结构分为两个主要集群：1月至9月和10月至12月，其中10月作为一个明显的转折点，与季风转换（从西南季风到东北季风）和典型的干湿季交替在时间上重合。共现网络显示10月所有模块丰度同步下降，这可能反映了在季风转换相关的环境变化中发生的系统性群落重组，而非特定生物相互作用的崩溃。裂解蛋白分析表明，内溶素是全年最丰富的裂解蛋白类别，其丰度在5月至9月（西南季风/雨季）显著增加并在6月达到峰值，符合“杀胜者”（Kill-the-Winner）生态模型；而10月几乎所有裂解蛋白类别的急剧下降则表明病毒裂解潜力的显著降低，与季节性季风转换一致，提示病毒生活策略的可能调整。AMG功能分析揭示，半胱氨酸和甲硫氨酸代谢通路（主要由DNA甲基转移酶基因驱动）全年高度丰富，其广泛存在可能与病毒逃避宿主限制-修饰（RM）系统或维持与宿主表观遗传模式的兼容性有关。叶酸生物合成AMG在10月至12月显著增加，可能代表了对环境转变期间宿主代谢压力的适应反应。光合作用通路（_psbA）仅在10月至12月检测到，可能与高辐照度条件下维持宿主光合活性有关；而硫代谢通路（_cysH）仅限于湿季（3月至9月），可能协助宿主维持细胞内氧化还原稳态，以应对潮间带沉积环境剧烈的水文和氧化还原（Eh）波动。这些裂解和代谢基因标记的同步波动表明，病毒群落在10月经历了功能潜力的重大重组，与NMDS分析中识别的结构转变一致。

结论

这项研究提供了三亚湾热带潮间带沙地中病毒群落的全年宏基因组特征。研究人员观察到，在可分类的病毒谱系中，_{Assiduviridae}（科）占主导地位，同时群落结构、网络组织和功能潜力存在明显的季节性变化。值得注意的是，10月作为一个过渡期，与模块丰度降低和裂解蛋白代表性下降相关。功能分析表明，病毒AMG，特别是那些参与半胱氨酸和甲硫氨酸代谢的基因，持续丰富，而其他几条通路则表现出季节性变异。总体而言，研究发现表明热带潮间带病毒群落经历了与季节相关的结构和功能调整，可能与季风驱动的环境变化有关。虽然特定的已知谱系如_{Assiduviridae}全年持续存在，但大量未分类的病毒表明整体群落复杂性需要进一步探索。