酒精性肝病中肝血窦内皮细胞通过磷脂酰丝氨酸依赖性途径清除损伤红细胞

《Biology》：Phosphatidylserine-Dependent Clearance of Damaged Red Blood Cells by Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Alcohol-Related Liver Disease Siyuan Li, Chaowen Zheng, Xiaowei Zha, Johannes Mueller, Anne Dropmann, Seddik Hammad, Steven Dooley and Sebastian Mueller

　　

酒精性肝病及其相关死亡率与溶血、红细胞吞噬作用增强及铁稳态紊乱相关。虽然巨噬细胞介导的红细胞吞噬作用已明确，但研究人员探究了肝血窦内皮细胞在酒精性肝病中处理氧化损伤或乙醇预处理的红细胞的作用。活细胞成像显示，损伤红细胞可被SK-HEP1细胞（一种具有LSEC样特征的内皮细胞系）快速摄取，且红细胞摄取与血红素加氧酶-1（HO-1）的诱导及其上游调节因子Nrf2的激活相关。siRNA介导的清道夫受体Stabilin-1敲低减弱了红细胞诱导的HO-1表达，支持了Stabilin-1在胞葬信号传导中的作用。将红细胞暴露于低至25 mM的乙醇浓度可诱导磷脂酰丝氨酸外翻，并使红细胞具备胞葬能力。裂解的红细胞和游离血红素引发了可比的氧化应激反应。在溶血和慢性乙醇喂养的小鼠模型中，血红蛋白来源的信号在窦状结构中被检测到，显示出与窦状清道夫区室一致的弥漫性CD206阳性分布模式。在具有溶血临床体征的人类重度饮酒者的肝血窦内皮区域也观察到了类似信号。总之，这些数据表明，肝血窦内皮细胞可能是酒精性肝病中红细胞清除的额外组成部分，与巨噬细胞和肝细胞一起，对肝脏铁处理具有重要意义。

研究背景与意义

酒精性肝病是欧洲肝硬化的最常见原因，全球约四分之一的肝硬化相关死亡可归因于酒精消费。该疾病常在多年亚临床进展后于失代偿期才被诊断，实验室特征常包括AST、ALT、γ-GT、铁蛋白和平均红细胞体积升高。非侵入性纤维化评估已成为标准诊断工具，但由于临床表现多变且缺乏酒精摄入的特异性生物标志物，酒精性肝病常被漏诊。近期一项针对重度饮酒者的前瞻性15年随访研究将溶血确定为酒精性肝病死亡率的关键预测因子。在同一队列中，近50%的肝活检观察到病理性铁过载，影响肝细胞和Kupffer细胞。这种铁积累与红细胞周转紊乱和肝脏红细胞吞噬作用增加有关。在生理条件下，衰老红细胞主要被巨噬细胞吞噬，从而实现有效的铁循环。然而在酒精性肝病中，这种稳态过程似乎出现失调。溶血因释放血红蛋白和游离血红素（强效促氧化和促炎化合物）而具有高度毒性。为减轻这种毒性，损伤或破裂的红细胞必须被有效清除。其主要机制通常是上述巨噬细胞的红细胞吞噬作用，随后通过血红素加氧酶（由HMOX基因编码）降解血红素，产生一氧化碳、胆绿素和铁。铁以铁蛋白形式储存于肝细胞和巨噬细胞内，约90%的全身铁来自衰老红细胞的循环。巨噬细胞还通过不同的清道夫系统清除游离血红蛋白和血红素：血红蛋白与结合珠蛋白结合，血红素与血凝素结合，分别形成被CD163和CD91内化的复合物。CD163在组织巨噬细胞上表达，并提供针对血红蛋白诱导的氧化应激的保护。可溶性CD163是巨噬细胞活化的临床标志物，并与酒精性肝病的肝脏炎症和纤维化相关。既往研究表明，重度饮酒会促进红细胞膜损伤和溶血，导致通过CD163介导的途径增强肝脏巨噬细胞对红细胞的摄取。这伴随着HO-1和Nrf2的强烈诱导，表明细胞防御机制的激活。此外，最近的研究表明，氧化损伤和乙醇预处理的红细胞不仅可被巨噬细胞内化，也可被肝细胞内化，表明酒精性肝病中的红细胞清除涉及多种肝细胞类型。因此，虽然肝脏驻留巨噬细胞和肝细胞是酒精性肝病中清除红细胞的已知参与者，但肝血窦内皮细胞在红细胞清除中的潜在贡献尚未得到充分探讨。肝血窦内皮细胞代表了血肝屏障处特化的清道夫界面，表达多种内吞和凝集素受体，包括Stabilin-1和甘露糖受体CD206。这些细胞显示出特征性的连续窦状分布模式，在解剖学上不同于Kupffer细胞的点状、细胞限制性染色模式，且越来越多的证据表明肝脏中的红细胞处理并不局限于单一细胞类型。先前报告表明，肝血窦内皮细胞可能在肝微血管系统中栓系损伤的红细胞，并且在镰状细胞病中已记录到肝血窦内皮细胞中的铁积累。其他内皮细胞系，包括HUVECs，已证明具有磷脂酰丝氨酸依赖性的红细胞摄取，但对肝血窦内皮细胞的机制研究仍然稀少。肝血窦内皮细胞不仅参与局部红细胞滞留，还是全身铁稳态的核心调节者。本研究旨在探究肝血窦内皮细胞是否参与酒精性肝病中氧化损伤或乙醇预处理的红细胞的清除。

关键技术方法

研究人员采用互补的体外、体内和人体组织方法。体外研究使用具有肝血窦内皮细胞样特征的SK-HEP1细胞系（源自肝腺癌男性患者）与从新鲜人血中分离的红细胞进行共培养，建立胞葬模型。红细胞通过CuSO₄和抗坏血酸氧化或用不同浓度乙醇处理以模拟损伤。通过活细胞成像系统记录摄取过程。通过siRNA转染敲低Stabilin-1基因表达。通过qRT-PCR和Western blotting分析基因和蛋白表达。通过MTT法评估细胞活力。体内研究使用雄性C57BL/6小鼠建立慢性乙醇喂养和苯肼诱导的溶血模型。通过免疫荧光染色和血红蛋白自发荧光技术，使用CD206抗体标记肝血窦内皮细胞区室，在肝组织切片中可视化血红蛋白信号和细胞分布。人体组织研究纳入来自德国海德堡Salem医疗中心的重度饮酒者队列，获取肝活检样本，进行mRNA表达分析和免疫荧光染色，以验证临床相关性。

研究结果

3.1. 肝血窦内皮样细胞摄取氧化损伤红细胞的证据

通过建立使用SK-HEP1细胞的体外胞葬模型，研究人员发现氧化红细胞在温和洗涤后仍附着或内化于SK-HEP1细胞内，而非氧化红细胞则被完全移除。活细胞成像显示氧化红细胞在约2分钟内被快速内化。这提供了肝血窦内皮样细胞在体外能够识别和内化氧化损伤红细胞的实验证据。

3.2. SK-HEP1细胞中红细胞胞葬对HO-1表达的动力学调控

时间进程实验显示，暴露于氧化红细胞后，HO-1 mRNA水平在8小时开始上升，24小时达到峰值。剂量反应分析表明，HO-1诱导在低至0.01%的血细胞比容浓度时开始，在0.5%时达到峰值，在更高红细胞密度时逐渐下降。SK-HEP1细胞计数在高达0.1%血细胞比容时随红细胞浓度增加而增加，但超过此点则下降，反映了HO-1表达谱。这些发现表明，肝血窦内皮样细胞对氧化红细胞的摄取或关联在低红细胞负荷时启动，但在更高暴露水平时变得自我限制。

3.3. SK-HEP1细胞对红细胞摄取的转录反应：Nrf2、Bmp6和铁蛋白的参与

研究人员检查了SK-HEP1细胞对氧化红细胞胞葬反应中涉及的关键转录调节因子。Nrf2在共培养早期被诱导，在0.05%血细胞比容时观察到最大mRNA表达。BMP6显示出与HO-1相似的诱导模式，在中等红细胞浓度时达到峰值并在更高水平时下降。同样，铁蛋白表达遵循HO-1反应曲线，在0.5%血细胞比容时表达最大。这些发现表明，氧化红细胞的摄取触发了涉及Nrf2激活、血红素降解和铁螯合反应的协调转录程序。

3.4. Stabilin-1介导氧化红细胞的磷脂酰丝氨酸依赖性胞葬

为识别红细胞被肝血窦内皮样细胞识别的受体，研究人员在暴露于氧化红细胞后分析了候选清道夫受体。在测试的基因中，只有Stabilin-1在mRNA和蛋白水平上被显著诱导。表达在0.5%血细胞比容时达到峰值并在更高浓度时下降，反映了HO-1表达。Western blot证实Stabilin-1蛋白水平与其mRNA表达一致。siRNA介导的Stabilin-1敲低使HO-1表达降低了约60%，表明胞葬信号传导受损。免疫荧光染色显示，氧化红细胞与未氧化红细胞相比，其磷脂酰丝氨酸暴露显著增加。这些发现表明，Stabilin-1识别损伤红细胞上的磷脂酰丝氨酸，启动它们被肝血窦内皮样细胞摄取。

3.5. 乙醇预处理红细胞以用于肝血窦内皮样细胞的胞葬

为模拟酒精性肝病相关的病理生理条件，研究人员建立了一个体外模型，其中红细胞用递增浓度的乙醇预处理24小时，然后与SK-HEP1细胞共培养。Annexin V染色显示，磷脂酰丝氨酸外化随乙醇浓度增加而逐渐增加。低至25 mM的乙醇诱导了显著比例的Annexin V阳性红细胞。相应地，SK-HEP1细胞中的HO-1 mRNA表达在25 mM乙醇时开始并以剂量依赖性方式增加，在400 mM乙醇时达到与氧化红细胞对照相当的水平。这些发现表明，红细胞对乙醇高度敏感，并经历表面变化，即使在生理相关酒精浓度下也能促进它们被肝血窦内皮样细胞识别和摄取。

3.6. 裂解红细胞和血红素对HO-1的诱导：与氧化完整红细胞的比较

基于计算的1%氧化红细胞约相当于100 μM血红素，研究人员比较了肝血窦内皮细胞对裂解红细胞和相应浓度游离血红素的HO-1反应。两种应激源都引发了双相HO-1诱导，分别在0.5%裂解红细胞和50 μM血红素时达到峰值。然而，在此峰值浓度下，血红素诱导的HO-1反应比裂解红细胞强约6.5倍，表明游离血红素对肝血窦内皮细胞施加了更高的氧化负担。相比之下，0.5%血细胞比容的氧化完整红细胞诱导的HO-1表达比相同红细胞含量的裂解红细胞高1.5倍，表明膜结合氧化产物可能比细胞碎片发挥更持续的胞葬信号。

3.7. 在溶血和慢性乙醇暴露小鼠模型中肝血窦内皮细胞体内处理红细胞来源物质

为在体内验证肝血窦内皮细胞介导的胞葬，研究人员分析了来自对照小鼠、苯肼处理小鼠和慢性乙醇喂养动物肝切片中的血红蛋白自发荧光和CD206表达。在健康对照中，血红蛋白自发荧光几乎不存在。苯肼处理的小鼠在CD206阳性窦状结构中显示出强烈的血红蛋白来源信号，这些结构显示出连续的内皮样分布模式。慢性乙醇暴露的小鼠在类似的CD206阳性窦状区域显示出中度的血红蛋白积累。值得注意的是，CD206表达在对照动物中最低，苯肼处理后中等，乙醇喂养小鼠中最高。这些发现支持肝血窦内皮细胞在急性和慢性溶血条件下参与处理红细胞来源物质的概念。

3.8. 肝脏Stabilin-1表达反映重度饮酒者的红细胞吞噬应激

为研究红细胞清除和内皮反应在酒精性肝病中的临床相关性，研究人员分析了一个由47名重度饮酒者组成的队列。实验室数据显示转氨酶升高和GGT显著增加，与酒精相关肝损伤一致。存在系统性炎症和巨红细胞性贫血迹象，同时铁蛋白升高，提示铁过载和溶血。平均血清sCD163水平超出正常范围，表明巨噬细胞清道夫活性增加。弹性成像显示平均肝脏硬度为21.5 kPa，18%的患者有超声肝硬化迹象。脂肪变性和CAP值增加也很常见。为获得机制性见解，在海德堡生物库的25名活检确诊的酒精性肝病患者中测量了肝脏stabilin-1 mRNA水平。Stabilin-1表达与ASGPR1和Nrf2强烈相关。与HO-1 mRNA呈中等相关，支持stabilin-1与酒精性肝病中血红素降解和抗氧化途径相关的假设。观察到与色素巨噬细胞浸润、小叶炎症和血清AST呈负相关，表明stabilin-1上调可能反映了减轻炎症和肝细胞损伤的代偿性内皮机制。

3.9. 在有和无溶血临床体征的重度饮酒者中肝血窦内皮细胞对血红蛋白的摄取

为评估溶血小鼠模型的发现是否适用于人类酒精性肝病，研究人员对来自酒精性肝病患者的冷冻保存肝切片进行了免疫荧光染色，比较了有和无临床溶血证据的个体。在非溶血患者中，血红蛋白自发荧光极少，且大多不存在于CD206阳性区域。相比之下，具有溶血临床和实验室体征的患者的肝切片显示强烈的血红蛋白自发荧光与CD206阳性肝血窦内皮细胞共定位。这些患者也表现出肝硬化结构和肝脏硬度增加。重要的是，血红蛋白自发荧光不仅限于内皮结构，也在肝细胞和非内皮区域观察到。血红蛋白来源信号在CD206阳性窦状区域内的存在支持了窦状内皮清道夫区室在处理人类酒精性肝病中溶血来源物质中的作用。

3.10. 共定位验证人类肝硬化肝脏中的血红蛋白自发荧光

为验证在来自溶血性酒精性肝病患者的冷冻肝切片中观察到的自发荧光确实代表血红蛋白，研究人员使用抗血红蛋白抗体进行了额外的免疫荧光染色。抗体信号显示与自发荧光强烈共定位，证实自发荧光主要来源于血红蛋白。值得注意的是，非溶血患者表现出较低的CD206表达。

讨论与结论

本研究提供了机制性的体外证据和解剖学一致的体内观察，表明肝血窦内皮清道夫区室参与了酒精性肝病中氧化损伤红细胞来源物质的处理。虽然肝血窦内皮细胞长期以来因其内吞和清道夫功能而被认可，但它们在红细胞胞葬中的作用尚未被探索。研究人员现在提出了一种新的红细胞-肝血窦内皮细胞轴，它补充了已知的巨噬细胞介导的通过CD163的清除，并揭示了酒精性肝病中一种独特的内皮驱动途径。通过活细胞成像，研究人员观察到氧化红细胞被SK-HEP1细胞快速摄取。在体内，研究人员为苯肼处理小鼠肝脏中肝血窦内皮细胞摄取红细胞提供了间接证据。在机制上，氧化红细胞在SK-HEP1细胞中诱导了强烈的HO-1和Nrf2激活。在所有测试的受体中，只有Stabilin-1被持续上调。沉默Stabilin-1使HO-1诱导减少约60%，支持其作为肝血窦内皮细胞中胞葬受体的作用。研究人员进一步表明，乙醇通过磷脂酰丝氨酸外化预处理红细胞以进行胞葬。比较分析表明，血红素比裂解红细胞引发更强的HO-1诱导，但完整的氧化红细胞比裂解物更有效，突出了膜相关信号在胞葬中的作用。在乙醇喂养的小鼠中，研究人员观察到Stabilin-1阳性肝血窦内皮细胞增加，表明对持续红细胞应激的适应性重塑。在人类酒精性肝病样本中，肝脏Stabilin-1表达与Nrf2和ASGPR1相关，但与经典炎症标志物无关，强调了一条独特的内皮途径。重要的是，患者数据与这些实验结果一致。在人类肝硬化肝脏中，血红蛋白自发荧光与CD206阳性肝血窦内皮细胞在有溶血临床/实验室体征的患者中共定位，但在无溶血的患者中则不共定位。自发荧光也出现在肝细胞和巨噬细胞中，支持一种多细胞清除反应，其中肝血窦内皮细胞是一个未被充分认识的贡献者。为验证自发荧光确实反映血红蛋白，研究人员进行了与抗血红蛋白抗体的共染色。在溶血性酒精性肝病患者中，抗体信号与488 nm自发荧光通道强烈共定位，而非溶血患者仅显示基线自发荧光且无可检测的抗体染色。这强烈表明血红蛋白来源的自发荧光是溶血性酒精性肝病的特异性标志，并排除了非特异性背景信号。研究数据支持一种由乙醇触发的、由Stabilin-1和潜在的CD206介导的肝血窦内皮细胞胞葬途径。一个值得注意的发现是暴露于氧化红细胞的SK-HEP1细胞中BMP6的强烈诱导。先前的数据表明，内皮BMP6对于肝细胞铁调素的诱导至关重要。当前数据将红细胞摄取（不仅仅是血红素）确定为BMP6表达的有效触发因素，表明溶血和红细胞周转直接激活内皮铁感应途径。溶血日益被认为是酒精性肝病发病率的驱动因素。研究表明，不仅巨噬细胞和肝细胞，而且肝血窦内皮细胞也内化了红细胞来源物质，这在酒精性肝病肝组织中的血红蛋白自发荧光中得到证明。本研究也存在一些局限性，例如SK-HEP1细胞并非真正的肝血窦内皮细胞，而是具有内皮和肿瘤来源特征的替代模型。Stabilin-1敲低后红细胞摄取的直接定量尚未进行。人体肝组织分析依赖于血红蛋白自发荧光和免疫荧光，这不允许明确区分完整红细胞摄取和细胞内血红蛋白沉积