大麦麦曲：探究浸渍和发酵对麦芽品质参数的影响

《Journal of the American Society of Brewing Chemists》：Barley Koji: Exploring the Effects of Steeping and Fermentation on Malt Quality Parameters

　　摘要：长期以来，日本一直使用 koji 为传统发酵食品和饮料提供酶、风味和营养成分。将其应用于酿造为特种麦芽提供了一种独特、多功能且创新的替代方案。本研究评估了使用 Aspergillus oryzae 培养的 koji 制作的烘焙大麦 koji（以下简称 BKM）的酿造适用性，通过研究浸泡时间（6、7 和 8 小时）和固态发酵（SSF）持续时间（40、44 和 48 小时）对麦芽质量和代谢组谱的影响来进行评估。BKM 表现出了理想的麦芽质量参数，包括与标准基础麦芽相当的提取物水平、快速的生产时间以及在基础麦芽烘焙条件下形成的高颜色。较短的浸泡时间提高了酶活性和技术性能，而SSF 持续时间的不同则产生了不同的颜色发展。这项研究表明，BKM 作为特种麦芽在精酿啤酒应用中具有广泛的应用潜力。

关键词：Aspergillus oryzae；代谢组学；固态发酵；特种麦芽

引言：许多啤酒馆和小型啤酒厂依靠开发具有独特风味的创新啤酒来吸引顾客。他们的商业模式通常包括季节性或实验性啤酒与一系列标准产品相结合。对新型啤酒风味的追求推动了啤酒花品种的激增以及新啤酒花品种和产品的开发。然而，啤酒制造商还通过将其他发酵饮料的元素（如清酒、葡萄酒或香槟酵母；葡萄酒葡萄；以前用于生产其他酒精饮料的烈酒；以及清酒中间体如 koji）混合到啤酒中来寻求进一步差异化。[Citation1–4] Koji 指的是用特定丝状真菌（包括 Aspergillus oryzae、A. sojae 和 A. luchuensis）发酵的谷物，这些真菌被认为是日本的国菌。[Citation5] Koji 在日本已有超过一千年的历史，用于生产发酵食品和饮料，如米酒（sake）、酱油（shoyu）、蛋白酱（miso）和烈酒（shochu），它是日本文化遗产的重要组成部分，塑造了该国传统发酵食品及其特有的风味特征。[Citation5] 在固态发酵（SSF）过程中， koji 霉菌可以产生超过 50 种酶，包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶。值得注意的是，来自 Aspergillus oryzae 的淀粉酶能够以 2000:1 的重量比将淀粉糖化，这突显了它们在酶工业中的特殊价值。[Citation6] 这些水解酶将复杂的底物（如淀粉和蛋白质）分解成较小的分子，包括糖、肽和氨基酸，为后续的微生物发酵提供营养。此外，它们还促进了多种生物活性化合物的形成，如阿魏酸、生物素和麴酸，这些化合物对肠道、心血管和免疫健康具有潜在益处。[Citation7] 此外， koji 发酵还产生了一系列风味活性化合物，包括酯类、醛类、醇类和呋喃类，根据真菌菌株和发酵条件的不同，这些化合物赋予了从花香和草本到蘑菇般的各种风味。[Citation5,Citation8] Koji 在日本发酵饮料中的作用类似于麦芽在啤酒生产中的作用，为最终产品提供酶、风味、颜色和口感——因此米 koji 常被称为“米麦芽”。麦芽和大麦 koji 之间的主要区别在于酶活性的来源：在 koji 中，酶是通过霉菌代谢产生的，而在麦芽中，酶是在谷物发芽过程中合成和激活的。此外，由于谷物外壳起到了物理屏障的作用，只有煮熟的珍珠状（抛光）或无壳（裸露）的谷物品种适合用于 koji 生产，因为这些形式有利于霉菌渗透到淀粉质胚乳中。相反，诸如爆米花等加工过程以及烘烤和滚动可以暴露谷物的胚乳，使其易于被霉菌侵袭。[Citation9] koji 的生产过程包括冲洗和浸泡谷物，然后沥干并蒸煮，直到谷物内部变软但外部保持坚硬。这些步骤确保了糊化而不粘稠，减少了结块和潜在的细菌污染。冷却到接种温度（35–38°C）后，将 koji 孢子均匀分布在谷物上。接种后的谷物在温暖潮湿的环境中发酵最多 24 小时，直到 koji 开始产生热量。此时，需要搅拌、将谷物摊成薄层并调节湿度。SSF 通常持续 37–72 小时，具体取决于 koji 的类型。[Citation5,Citation10] Koji 的生产速度比传统麦芽快（大约 3 天对比 5–7 天），并且可能使用更少的水和能源。[Citation11] 此外，选择不同的霉菌种类、菌株和底物谷物可以提供多种酶和风味特性。

麦芽生产是一种受控的发芽过程，通过热干燥终止，也始于冲洗大麦（或其他谷物）以去除污垢并减少微生物负荷。接下来是浸泡（1–2 天），使谷物的水分含量达到 42–46%，为发芽创造最佳条件。发芽在受控的温度（12-16°C）、湿度和通风条件下进行，以优化酶的产生和谷物的改良。[Citation12] 其持续时间（通常为 4–5 天）主要取决于所需的麦芽规格，但也受到麦芽厂条件和大麦品种的影响。较长的发芽时间会导致胚乳进一步降解，并增加底物向发育中的根须和芽尖的转移。当达到所需的改良程度后，绿色麦芽通过烘焙（某些特殊麦芽还需烘烤）进行干燥，工艺条件决定了最终麦芽的颜色和风味特征。[Citation12,Citation13,Citation14] 麦芽大致分为基础麦芽和特种麦芽。基础麦芽富含酶，提供提取物、游离氨基氮（FAN）和基础风味。然而，特种麦芽则提供独特的颜色、风味和功能，如增强泡沫、口感或酸度。这些可以通过传统或专门的方法使用大麦或其他谷物生产。[Citation14] 浸泡或浸渍阶段对 koji 和麦芽生产都至关重要。适当的水分确保了 koji 生产的充分糊化或麦芽的充分发芽。均匀的水分分布对于一致的结果至关重要，浸泡谷物的水分（铸水）影响酶的产生和两种产品的最终特性。在高质量清酒生产中，清酒大师甚至可以通过触摸检测到 2% 的谷物水分变化，从而确定浸泡何时结束。[Citation10,Citation15,Citation16] 类似地， koji 发酵和大麦发芽的温度曲线和持续时间强烈影响酶的产生。在麦芽中，较高的温度（19°C）和较长的发芽时间有利于 β-葡聚糖的降解，但也会导致更大的麦芽损失和提取物产量减少。[Citation15] 在 koji 中，Ito 等人报告称，酶的产生通常在发酵开始后约 24 小时开始，遵循不同的发展模式：一些酶达到平台期（例如 α-淀粉酶），其他酶达到峰值后下降（例如纤维素酶），而有些酶在整个发酵过程中持续增加（例如 β-葡糖苷酶）。总体而言，酶谱受到真菌菌株和环境条件的强烈影响。

在本手稿中，我们选择使用“大麦 koji 麦芽”（BKM）这一术语来描述烘焙的大麦 koji，尽管它不经历发芽过程，但它表现出与特种麦芽类似的功能特性。与麦芽一样，大麦 koji 产生的酶有助于谷物的改良以及风味和颜色的发展。从行业角度来看，使用 BKM 这一术语有助于与啤酒制造商沟通，使他们了解其在酿造应用中作为特种麦芽的替代品的作用。同时，这也强调了 koji 的千年传统工艺和日本文化遗产及其潜在的独特特性。本研究评估了烘焙大麦 koji 作为大麦特种麦芽替代品的生产情况，研究了三种浸泡时间（6、7 或 8 小时）和三种SSF持续时间（40、44 或 48 小时）对 BKM 麦芽质量和代谢组谱的影响。我们认识到大麦 koji 在日本文化中有着悠久而丰富的传统，对此我们深表赞赏。在这里，我们进一步通过烘焙大麦 koji 来实现新的风味和颜色——这一过程在传统 koji 制造中并不常见——从而增强了其在精酿麦芽中的应用潜力。

方法论：
Koji 麦芽的制备：Koji 的制作过程遵循了既定的方法。[Citation5,Citation10,Citation18,Citation19,Citation20] 使用 Montana Milling, Inc.（美国蒙大拿州 Great Falls）对 Buzz 品种的大麦（Montana State University, MT, U.S.A.）进行珍珠处理，去除了外壳（占谷物重量的 2%）和部分麸皮（占谷物重量的 10–15%）。总共 2 × 500 克的珍珠大麦被冲洗 4–5 次，并在 20°C 下浸泡 6、7 或 8 小时，然后沥干 3 小时。浸泡时间根据 Chapon 测试确定[Citation16]，并在两个 Mason Ball 罐（1/2 加仑，约 1.9 升）中进行，水与大麦的比例为 2:1，在 20°C 的 BOD 培养箱中培养。浸泡后的谷物在压力锅（15 psi）中蒸煮 10 分钟。冷却至 35–38°C 后，按照制造商的说明接种大麦 koji 孢子（Aspergillus oryzae，fermentationculture.eu，LUVI Fermente KG，奥地利 – 大麦 koji 品种）。接种后的大麦被分成九个灭菌的（1/2 加仑，约 1.9 升）Mason Ball 罐，在 Avantco HPI-1812（Avantco Equipment, USA）培养箱中以 31.5–33°C 培养，盖子用纱布替换以进行空气交换和保持湿度。在 12、19、23、27 和 33 小时以及发酵结束时（40、44 或 48 小时）对 koji 进行混合。使用 NutriChef Pro BBQ 数字温度计测量 koji 的内部温度，温度计有两个探头，放置在两个罐子的谷物层中，罐子位于培养箱的对面；同时使用 Taylor 数字温度计监测培养箱的内部温度和相对湿度。如果内部温度超过 38°C，则进行额外混合。发酵后，将罐子转移到冷藏室中 12 小时。然后使用 CLP 烘炉（Steep/Germ Combi Kiln，CLP，英国）按照标准拉格麦芽工艺对 koji 大麦进行烘焙。实验重复三次，实验设计如表 1 所示。

表 1. 实验设计。

麦芽质量分析（MQA）：MQA 在 Montana State University 的 Barley, Malt, and Beer Quality Control Lab 进行，遵循美国酿造化学家协会（ASBC）的官方方法。评估的参数包括水分（%）（ASBC Malt 3）、提取物（FG db, %）（ASBC Malt-4）、β-葡聚糖含量（mg/L）（ASBC Wort-18）、FAN（mg/L）（ASBC Wort-12）、可溶性蛋白质（%）（ASBC Wort-17）、糖化力（DP；°L）（ASBC Malt-6）、α-淀粉酶（DU）（ASBC Malt-7）、颜色（°SRM）（ASBC Wort-9）、过滤时间（160 mL，分钟）、浊度和 pH（ASBC Wort-8）。分析使用 koji 麦芽和质量控制（QC）基础麦芽的 1:1 混合物进行，所有结果转换后仅显示 koji 大麦样本的贡献，类似于焦糖麦芽分析（Malt-9，ASBC）。

Koji 麦芽代谢组学：在 MQA 之后，将浸泡时间固定为 6 小时，以评估SSF 持续时间对 koji 麦芽代谢组谱的影响。样品提取：进行 100% 甲醇单相提取。将研磨后的样品（100 mg ± 0.5 mg）与 1,800 μL 甲醇混合，在 4°C 下振荡 1 小时，然后在 4°C 下以 3,500 rpm 离心 20 分钟。上清液收集并储存在 -20°C。

非靶向代谢组学：分析在 Montana State Mass Spectrometry Facility 进行，使用 Waters Synapt-XS Q-IMS-TOF 与 Waters I-Class UHPLC 联用。分离使用 BEH HILIC 柱（2.1 × 100 mm，130 ?，1.7 μm），流速为 0.4 mL/min。梯度从 100% B（乙腈，0.1% 甲酸）变化到 30% B，持续 18 分钟。质谱数据在正离子模式下收集（50–1,200 m/z，5 Hz），并进行了锁质校正。MS^E 质谱使用 20–50 V 的碰撞能量坡度。

代谢物鉴定：代谢组学数据使用 Progenesis QI（v3.0.7927.47290）处理。代谢物鉴定使用 PlantCyc 和 Waters “Biomolecules” 数据库进行，前体和碎片容忍度分别为 10 ppm 和 20 ppm。得分超过 40 的化合物通过与文献和外部数据库（包括 NIST、PlantCyc、YMDB、HMDB、FooDB 和 KEGG 通路图）的比较进行初步鉴定。Progenesis QI 提供了一个详细的文件，其中包含 m/z、化合物 ID（基于 Human Metabolome Database [HMDB] 或 PlantCyc）、加合物、分子式、得分、碎片得分、质量误差（ppm）和同位素相似性。得分范围为 0–100，用于评估鉴定的质量，包括五个同等权重的类别：(a) 质量相似性；(b) 同位素相似性；(c) 保留时间相似性；(d) 碰撞截面（CCS）相似性；(e) 碎片得分，代表碎片数据与搜索结果的匹配程度。根据之前使用该设备进行的实验，最低得分40被设定为可接受的识别置信度。[Citation21,Citation22]

**统计分析**
麦芽质量数据使用XLSTAT（2024.2.2，Addinsoft）进行分析，采用了双因素方差分析（ANOVA）（因素：浸泡时间和SSF时间）以及事后Tukey和Dunnett检验。皮尔逊相关性分析、主成分分析（PCA）和热图（RStudio）用于可视化相关性。还对比了麦芽和QC麦芽之间的差异。

**代谢组数据分析**
代谢组数据分析使用了MetaboAnalyst v6.0（加拿大麦吉尔大学Xia实验室）。排除了缺失值超过45%的特征，并使用K最近邻（KNN）方法估计了剩余的缺失值。注释过的化合物根据四分位数范围（IQR）进行了筛选，最终从694个峰中保留了211个特征。数据通过求和进行了标准化处理，然后进行了对数转换（以10为底），并进行了帕累托缩放以适应统计分析。识别出的化合物进行了自动缩放。

**数据分析方法**
PCA、PLS-DA（偏最小二乘判别分析）和层次聚类热图（使用欧几里得-沃德聚类方法）被用来分析实验结果。火山图（假发现率[FDR] < 0.1，倍数变化[FC] > 2.0）和正交偏最小二乘（oPLS-DA）用于比较处理组（例如，对照组与麦芽、SSF时间）。正交投影到潜在结构（OPLS）模型在SIMCA中用于将QC麦芽的质量数据与代谢组谱型进行回归分析，以识别技术特征（响应变量）和代谢组特征（预测变量）之间的关系。

**结果与讨论**

**麦芽质量分析（MQA）**
首先，我们讨论了烘干后的BKM质量参数与文献中的数据，以了解其整体特性及其在酿造中的潜在用途。接下来，我们研究了浸泡时间和SSF时间的变化对这些参数的影响。最后，我们将结果与分析过程中用作QC的基准麦芽进行了比较。麦芽样本按照“浸泡时间*SSF时间”进行编码。表2展示了BKM和QC麦芽的质量参数的均方最小值（LS均值）总结。皮尔逊相关系数显示在图1中。这些分析提供了SSF时间和浸泡条件对麦芽特性影响的见解，并为优化工艺以提高质量和适应酿造创新奠定了基础。

**表2. 麦芽质量分析的LS均值总结。**

**麦芽质量特征**
- **水分**：BKM的平均水分含量为5.44%，低于可能导致麦芽变得松软并易受霉菌生长的6%阈值。[Citation23,Citation24] 虽然基准麦芽通常的目标水分含量为3.8–4.6%，[Citation25] 但特殊麦芽（如焦糖化麦芽）根据工艺和所用谷物（如小麦麦芽）的不同，水分含量可达到6.5%。[Citation26] 在这个范围内的水分值是可接受的，特别是对于实验性的特殊麦芽如BKM。
- **细磨提取物干基（FGdb）**：FGdb是麦芽糖化过程中释放的可溶性固体的指标，在BKM中范围为83.93%至85.90%。这些值超过了AMBA推荐的蒸馏和酿造麦芽的最低标准81%。[Citation27] 由于无壳，用于BKM的裸麦通常能提供更高的提取物产量。[Citation28,Citation29] 例如，最近对加拿大裸麦品系的研究报告称，其细磨提取物平均值约为87.5%，而带壳品种为81.4%。[Citation29]
- **糖化力（DP）**：DP衡量负责淀粉水解的糖化酶的活性。BKM的平均值为62.16°L，与某些轻质慕尼黑麦芽相当。[Citation26] 尽管AMBA建议全麦芽酿造的最低DP为110°ASBC，但精酿啤酒商通常更喜欢较低的DP麦芽（约60°L），以实现更长且更一致的转化时间。[Citation12,Citation27,Citation30,Citation31] 这突显了BKM与精酿啤酒工艺的兼容性。
- **α-淀粉酶活性（aA）**：α-淀粉酶是酿造过程中分解淀粉的主要酶，在BKM中的活性范围为10.7至27.1 D.U.。AMBA[ Citation27] 的指南建议全麦芽酿造的α-淀粉酶活性为40–70 D.U.，而欧洲标准建议基准麦芽的活性应高于30 D.U。[Citation32] 与DP类似，精酿啤酒商通常更倾向于较低的活性水平（约30 D.U.），以获得更好的转化控制。[Citation12,Citation31] 尽管BKM的提取物含量较高，但其α-淀粉酶活性较低，这表明大部分淀粉水解发生在SSF阶段，导致最终麦芽中的酶活性有限，或者需要调整和优化用于麦芽的α-淀粉酶生产方法。
- **可溶性蛋白质和FAN**：可溶性蛋白质是麦芽糖化过程中蛋白质分解的指标，在BKM中范围为4.75至6.14 g/100 g，平均值为5.43 g/100 g。这与典型的麦芽值相符，[Citation27,Citation32] 尽管略低于Buzz品种的标准麦芽结果（约5.91 g/100 g）。FAN对酵母营养、啤酒颜色、泡沫和风味至关重要，[Citation14] 其范围为133至164 mg/L，符合AMBA[ Citation27] 的建议（全麦芽酿造为140–190 mg/L）。这些值足以支持健康的酵母发酵，同时避免过多的FAN对啤酒风味稳定性的负面影响。[Citation30]
- **颜色**：BKM的颜色范围较广（5.57至15.11°SRM），与慕尼黑和焦糖麦芽相当。[Citation14] 颜色与可溶性蛋白质（r = 0.818）呈正相关，与β-葡聚糖（r = ?0.737）呈负相关。麦芽颜色是氨基酸和麦芽修饰（浸泡和发芽）产生的还原糖以及烘干、烘焙或焦糖化参数的综合结果。[Citation14] 对于BKM来说，颜色的差异可能是由于在不同条件下麦芽发酵过程中淀粉和蛋白质的修饰程度不同，导致烘干过程中的美拉德反应程度不同。
- **β-葡聚糖含量**：BKM的β-葡聚糖含量非常高（1,809–2,245 mg/L），显著高于Buzz麦芽的85.3 mg/L。与Buzz去壳大麦（2.4 g/100 g）相比，所使用的A. oryzae菌株的β-葡聚糖水解能力有限。高分子量的β-葡聚糖（>120 kDa）会导致麦汁粘度增加，从而增加过滤难度，可能延长酿造时间并降低效率。[Citation33] 可以通过使用外源性β-葡聚糖酶来缓解这一问题。一些丝状真菌已知能产生β-葡聚糖酶和其他纤维素酶。[Citation34,Citation35] 然而，对于Aspergillus oryzae来说，这种活性是菌株特异性的。[Citation36] 尽管我们选择了大麦-麦芽菌株，但其β-葡聚糖酶活性较低。建议广泛筛选商业Aspergillus oryzae孢子，以找到能够降低大麦β-葡聚糖含量的菌株。

**结论**
尽管BKM的β-葡聚糖含量较高，但它并不完全是不利的。β-葡聚糖被认为是一种具有潜在健康益处的膳食纤维，包括免疫调节和降低胆固醇的作用，以及改善结肠和心血管健康。[Citation37,Citation38] 此外，Aspergillus spp.在其细胞壁中产生-(1→3)-葡聚糖，这些化合物具有生物活性。[Citation7] 但从酿造角度来看，BKM中的高β-葡聚糖含量需要通过选择具有增强β-葡聚糖酶活性的菌株或使用外源性酶来缓解过滤问题。

**过滤时间和浊度**
BKM的过滤时间（FT）较长，为160分钟，范围为123.3至152.6分钟，这可能是由于高β-葡聚糖含量和高分子量成分所致。浑浊的过滤液进一步支持了这一假设，因为高分子量的β-葡聚糖与麦汁和啤酒中的浑浊有关。[Citation39] 因此，在使用BKM酿造时建议使用外源性酶（如β-葡聚糖酶）以提高效率。然而，FT与β-葡聚糖含量之间存在弱但显著的相关性（r = 0.4），如图1和图2所示。这表明除了β-葡聚糖外，还有其他化合物在过滤过程中起作用。其他非淀粉多糖（NSP），如阿拉伯木聚糖（AX）和聚合阿拉伯木聚糖（PAX），以及高分子量氮也影响麦汁的过滤性。[Citation40,Citation41]

**图1. 显示因变量和自变量之间皮尔逊相关性的热图。圆圈的大小对应相关性的强度，颜色对应其值：绿色表示正相关，紫色表示负相关。缩写：Extract，细磨提取物干基；SSF_time，固态发酵时间；S. Protein，可溶性蛋白质；FAN，游离氨基氮；DP，糖化力；FT，过滤时间。**

**图2. 麦芽质量分析结果的箱形图表示。样本按其浸泡时间（小时）|SSF时间（小时）进行分类。缩写：Extract，细磨提取物干基；S. Protein，可溶性蛋白质；FAN，游离氨基氮；SSF，固态发酵。**

**图3. 按因素显示的麦芽质量分析统计结果图，展示了事后Tukey HSD检验的结果。不同字母表示显著差异（p < 0.05）。a) 将浸泡时间（小时）作为自变量（从左到右分别为6小时、7小时、8小时）；b) 将SSF时间（小时）作为自变量（从左到右分别为40小时、44小时、48小时）。缩写：HSD，真实显著差异；SSF，固态发酵；Extract，细磨提取物干基；S. Protein，可溶性蛋白质；FAN，游离氨基氮。SSF和浸泡时间以小时（h）表示。**

**图4. 主成分分析双图显示了按浸泡时间（小时）（a）或SSF时间（小时）（b）分类的样本及其对应的置信椭圆（95%）及其与麦芽质量参数的相关性。变量通过cos2 > 0.5进行筛选。缩写：SSF，固态发酵；cos2，余弦平方；Extract，细磨提取物干基；S. Protein，可溶性蛋白质；FAN，游离氨基氮；Contrib，变量贡献。**

**pH值**
BKM的麦汁pH值范围为4.83至5.07，低于典型基准麦芽的pH值（5.6–6.0）。[Citation42] 这种降低与A. oryzae在发酵过程中产生的有机酸（如麦角酸和苹果酸）有关。[Citation43,Citation44] BKM的较深颜色与其较低的pH值相关，因为酸性化合物在美拉德反应中释放。[Citation45] 此外，在麦芽生产过程中可能会发生细菌污染，尤其是在霉菌完全生长之前的早期阶段。麦芽霉菌的最佳温度和湿度也有利于细菌生长，麦芽与其相关细菌群落之间的关系及其对清酒风味和麦芽特性的影响已经研究了数十年。因此，尽管遵循了标准的食品卫生程序，观察到的pH值下降可能是由于细菌生长所致。[Citation5,Citation46]

这些发现表明，BKM具有独特的麦芽特性，表现为高提取潜力、独特的酶活性以及与高烘干度和轻质焦糖麦芽相当的颜色范围，使其非常适合用于精酿啤酒。通过菌株选择和工艺调整进一步优化可以增强特定性能，例如降低β-葡聚糖含量、提高糖化力（DP）和改善整体酿造性能。

**浸泡时间和SSF时间对BKM质量的影响**
麦芽质量结果使用双因素ANOVA进行分析，将浸泡时间和SSF时间作为自变量，并检查交互作用（浸泡时间 x SSF时间）。图2提供了趋势的箱形图表示，而表3总结了麦芽质量参数的ANOVA结果。图3按因素显示了LS均值，突出了通过Tukey真实显著差异（HSD）检验确定的统计差异。

ANOVA显示，SSF时间显著影响了颜色、β-葡聚糖、可溶性蛋白质、α-淀粉酶、过滤时间和°Brix（oPlato）。延长的发酵导致淀粉、蛋白质和纤维素材料的进一步分解，表现为β-葡聚糖的减少和可溶性蛋白质的增加。在较高的SSF时间下，°Brix降低、FAN水平稳定以及颜色增加，表明一些糖和氨基酸发生了美拉德反应，形成了黑色素。糖和碳水化合物被霉菌代谢，为菌丝生长提供能量并转化为有机酸、酒精糖和酚酸等代谢物。A. oryzae已知会产生有机酸，包括TCA循环中间体如草酸、琥珀酸、富马酸、甘油酸、苹果酸、麦角酸和柠檬酸，[Citation47,Citation48,Citation49] 这些酸的生成导致SSF时间延长时pH值下降。

过滤时间随SSF时间的延长而减少，并与β-葡聚糖呈弱但显著的相关性（r = 0.395），表明其他物质（如木聚糖和凝胶蛋白）也影响过滤速度并在发酵过程中被分解。[Citation50] α-淀粉酶活性的下降可以归因于霉菌进入静止生长阶段。[Citation48] 麦芽酶的活性水平和峰值产生高度依赖于环境条件、菌株和底物组成。[Citation17,Citation51] 此外，在葡萄糖存在的情况下，调节淀粉酶产生的基因表达受到抑制，无论是否存在异麦芽糖等诱导物质，这种机制称为碳代谢物抑制（CCR）。[Citation52] 因此，在SSF后期阶段，由于淀粉水解产生的葡萄糖积累，预计α-淀粉酶和其他淀粉酶的活性会下降。

浸泡时间显著影响了水分、提取物、颜色、β-葡聚糖、可溶性蛋白质和α-淀粉酶。较长的浸泡时间似乎使谷物吸收了过多的水分，可能阻碍了霉菌的生长。大多数与酶相关的参数（可溶性蛋白质、提取物、FAN[不显著]和DP[不显著]）随着浸泡时间的延长而减少，而β-葡聚糖含量增加，这表明真菌生长减缓或酶活性降低。长时间浸泡后麦芽颜色变浅，支持了这一假设，表明用于美拉德反应的底物减少。可溶性蛋白质与颜色之间的高相关性（r = 0.818，R2 = 0.669）进一步证实了这一观察结果。这些样品中较低的水分含量可能是由于较少的溶质结合了水分，使得在烘干过程中有更多的自由水蒸发。Castro等人[Citation53]强调了具有高持水能力（WHC）的底物对于丝状真菌的SSF（固态发酵）的重要性，因为足够的水分可以支持发酵过程。然而，过量的水分吸收会破坏底物结构，降低孔隙率和氧气扩散，从而影响霉菌生长和酶的产生。大麦的WHC随着珍珠层的形成而变化，因为富含纤维的外层比富含淀粉的胚乳具有更高的WHC[Citation54]。这些发现表明，在实验条件下，超过6小时的浸泡时间足以改变谷物结构，从而影响霉菌生长。在科学研究中，大麦通常浸泡至35%的水分[Citation51,Citation55]。有经验的麦曲制造者提供的实用指南建议大麦的浸泡时间为1-4小时，而水稻的浸泡时间更长[Citation9,Citation18]。在本研究中，最低浸泡时间定为6小时，这是基于Chapon的测试[Citation16]，因为较短的浸泡时间得到的浸泡指数值不足。尽管大麦在3小时内达到了35%的水分，但更长的浸泡时间确保了充分的水合和蒸煮后的糊化。

交互项（浸泡时间×SSF时间）仅在颜色上具有统计学意义，但与水分、提取物、FAN、α-淀粉酶和°Brix呈中等负相关（表3）。水分与其他参数之间存在强相关性，突显了其在理解麦曲生长和麦芽生产过程中水分动态方面的重要性。浸泡时间显著影响了水分，这强调了需要进一步研究其对珍珠层大麦微观结构和麦曲-麦芽质量的影响。此外，温度、氧气浓度和气体交换等其他参数也值得考虑。

PCA双图（图4）显示了按浸泡时间（a）或SSF时间（b）分类的样本及其与麦芽质量参数的相关性。对于前两个因子，平方余弦值大于0.5的变量被包含在相关图中，而表现不佳的变量被排除在外。在95%的置信度下没有观察到明显的组间分离，尽管在质心周围出现了趋势。对于6小时的浸泡，SSF时间对麦芽特性有显著影响。对于更长的浸泡时间，样本之间的差异减小，如8小时浸泡的置信椭圆所示。质心表明6小时浸泡有利于更高的提取物、水分和可溶性蛋白质含量，而β-葡聚糖含量较低；而8小时浸泡则与更高的β-葡聚糖含量和较低的可溶性蛋白质、FG提取物、颜色和水分相关。SSF时间趋势显示，在48小时时颜色和可溶性蛋白质增加，但pH值和α-淀粉酶降低，而在40小时时则呈现相反的趋势。

图1上的相关性热图突出了麦芽质量结果与分类变量之间的相关性，显示浸泡时间与β-葡聚糖含量之间存在强正相关，与水分和可溶性蛋白质之间存在负相关。

尽管本研究旨在评估BKM作为替代特种麦芽用于酿造的可行性，但通过将其与基础麦芽进行比较可以更有效地了解其一般特性。为此，通过考虑每个浸泡时间和SSF持续时间的交互作用来分析结果。样品根据浸泡时间*SSF时间的交互作用进行分类。所有处理的BKM与对照麦芽相比均显示出总体上的显著差异，这一点通过Dunnett检验确定（双侧，p < 0.05）。BKM在颜色、β-葡聚糖和过滤时间（FT）方面显示出显著更高的值（Tukey HSD，p < 0.05），而在FAN、α-淀粉酶、pH和DP方面显示出显著更低的值（Tukey HSD，p < 0.05）。尽管BKM的淀粉酶和游离氨基氮（FAN）水平较低，但其提取物和可溶性蛋白质总体上与对照相当，但有一些例外。具体来说，BK 6*40和BK 6*44显示出显著更高的提取物值（p < 0.05），而BK 6*48显示出较高的可溶性蛋白质含量。虽然差异不显著，但8小时浸泡的实验倾向于表现出比对照更低的可溶性蛋白质含量，而延长发酵时间则导致更高的值。如前所述，与对照相比，FAN、pH和DP的较低值对于手工酿造应用中的基础麦芽来说是可接受的。然而，α-淀粉酶的结果并未完全反映麦曲酶的潜力，考虑到提取物值。鉴于这些参数，酿酒师可以潜在地用BKM替代任何比例的基础麦芽，而不会影响提取物产量和酵母营养。此外，BKM的较高颜色值会给啤酒带来温暖的独特色调——可能从蜂蜜色到琥珀棕色——这可能是由于在麦曲基质烘干过程中美拉德反应和焦糖化反应的增强。

与基础麦芽的比较

尽管本研究旨在评估BKM作为替代特种麦芽用于酿造的可行性，但通过将其与基础麦芽进行比较可以更有效地了解其一般特性。为此，通过考虑每个浸泡时间和SSF持续时间的交互作用来分析结果。样品根据浸泡时间*SSF时间的交互作用进行分类。所有处理的BKM与对照麦芽相比均显示出总体上的显著差异，这一点通过Dunnett检验确定（双侧，p < 0.05）。BKM在颜色、β-葡聚糖和过滤时间（FT）方面显示出显著更高的值（Tukey HSD，p < 0.05），而在FAN、α-淀粉酶、pH和DP方面显示出显著更低的值（Tukey HSD，p < 0.05）。尽管BKM的淀粉酶和游离氨基氮（FAN）水平较低，但其提取物和可溶性蛋白质总体上与对照相当，但有一些例外。具体来说，BK 6*40和BK 6*44显示出显著更高的提取物值（p < 0.05），而BK 6*48显示出较高的可溶性蛋白质含量。尽管差异不显著，但8小时浸泡的实验倾向于表现出比对照更低的可溶性蛋白质含量，而延长发酵时间则导致更高的值。如前所述，与对照相比，FAN、pH和DP的较低值对于手工酿造应用中的基础麦芽来说是可接受的。然而，α-淀粉酶的结果并未完全反映麦曲酶的潜力，考虑到提取物值。鉴于这些参数，酿酒师可以潜在地用BKM替代任何比例的基础麦芽，而不会影响提取物产量和酵母营养。此外，BKM的较高颜色值会给啤酒带来温暖的独特色调——可能从蜂蜜色到琥珀棕色——这可能是由于在麦曲基质烘干过程中美拉德反应和焦糖化反应的增强。

BKM的高β-葡聚糖含量和增加的过滤时间需要像处理其他高麦汁粘度和β-葡聚糖含量的成分（如燕麦或黑麦）一样进行处理。这可以通过添加外部β-葡聚糖酶来实现，这些酶可以水解β-葡聚糖以降低粘度并提高过滤效率。或者，向糖化槽或过滤槽中添加燕麦或稻壳可以改善谷物床的渗透性，从而提高麦汁分离效果[Citation56]。PCA（图5）展示了按浸泡时间（a）或SSF时间（b）分类的样本及其与麦芽质量参数的相关性。对于前两个因子，平方余弦值大于0.5的变量被包含在相关图中，而表现不佳的变量被排除在外。在95%的置信度下没有观察到明显的组间分离，尽管在质心周围出现了趋势。对于6小时的浸泡，SSF时间对麦芽特性有显著影响。对于更长的浸泡时间，样本差异减小，如8小时浸泡的置信椭圆所示。质心表明6小时浸泡有利于更高的提取物、水分和可溶性蛋白质含量，而β-葡聚糖含量较低；而8小时浸泡与更高的β-葡聚糖含量和较低的可溶性蛋白质、FG提取物、颜色和水分相关。SSF时间趋势显示，在48小时时颜色和可溶性蛋白质增加，但pH值和α-淀粉酶降低，而在40小时时则呈现相反的趋势。

图1上的相关性热图突出了麦芽质量结果与分类变量之间的相关性，显示浸泡时间与β-葡聚糖含量之间存在强正相关，与水分和可溶性蛋白质之间存在负相关。

尽管本研究旨在评估BKM作为替代特种麦芽用于酿造的可行性，但通过将其与基础麦芽进行比较可以更有效地了解其一般特性。为此，通过考虑每个浸泡时间和SSF持续时间的交互作用来分析结果。样品根据浸泡时间*SSF时间的交互作用进行分类。所有处理的BKM与对照麦芽相比均显示出总体上的显著差异，这一点通过Dunnett检验确定（双侧，p < 0.05）。BKM在颜色、β-葡聚糖和过滤时间（FT）方面显示出显著更高的值（Tukey HSD，p < 0.05），而在FAN、α-淀粉酶、pH和DP方面显示出显著更低的值（Tukey HSD，p < 0.05）。尽管BKM的淀粉酶和游离氨基氮（FAN）水平较低，但其提取物和可溶性蛋白质总体上与对照相当，但有一些例外。具体来说，BK 6*40和BK 6*44显示出显著更高的提取物值（p < 0.05），而BK 6*48显示出较高的可溶性蛋白质含量。尽管差异不显著，但8小时浸泡的实验倾向于表现出比对照更低的可溶性蛋白质含量，而延长发酵时间则导致更高的值。如前所述，与对照相比，FAN、pH和DP的较低值对于手工酿造应用中的基础麦芽来说是可接受的。然而，α-淀粉酶的结果并未完全反映麦曲酶的潜力，考虑到提取物值。鉴于这些参数，酿酒师可以潜在地用BKM替代任何比例的基础麦芽，而不会影响提取物产量和酵母营养。此外，BKM的较高颜色值会给啤酒带来温暖的独特色调——可能从蜂蜜色到琥珀棕色——这可能是由于在麦曲基质烘干过程中美拉德反应和焦糖化反应的增强。

BKM的高β-葡聚糖含量和增加的过滤时间需要像处理其他高麦汁粘度和β-葡聚糖含量的成分（如燕麦或黑麦）一样进行处理。这可以通过添加外部β-葡聚糖酶来实现，这些酶可以水解β-葡聚糖以降低粘度并提高过滤效率。或者，向糖化槽或过滤槽中添加燕麦或稻壳可以改善谷物床的渗透性[Citation56]。PCA（图5）展示了特征与样本之间的相关性，提供了质量控制麦芽（对照）和BKM之间的清晰分离（95%置信度）。对照和BKM样本之间的差异主要由PC1解释，它解释了71.6%的变异。PC1将对照麦芽与更高的FAN、α-淀粉酶、DP和pH相关联，而BKM与更高的β-葡聚糖、过滤时间、水分和颜色相关联。

图5. PCA双图显示了样本与特征之间的相关性。每个分类变量（对照 vs. BKM）都配有相应的置信椭圆（95%）。变量通过cos2 > 0.5进行筛选。PCA（主成分分析；BKM，大麦麦曲；cos2，余弦平方；提取物，细磨干基；S. Protein，可溶性蛋白质；FAN，游离氨基氮；DP，糖化力；FT，过滤时间）。PC2解释了15.6%的变异，主要反映了BKM样本之间的差异，其中可溶性蛋白质的贡献最大，其次是颜色。

基于MQA，我们选择了一个固定的浸泡时间来进一步研究SSF时间对BKM代谢组学谱的影响。选择浸泡6小时的BKM是因为它们具有有利的特性，包括较低的β-葡聚糖含量、更快的过滤时间（FT）以及更高的提取物和α-淀粉酶活性，使其更适合酿造应用。总共检测到2,657种代谢物，其中694种被注释，导致3,405个潜在的鉴定结果。在这些代谢物中，39种化合物的鉴定得分超过40分。其中16种被算法自动接受，23种通过文献和数据库进行假定鉴定。鉴定出的化合物列表及其鉴定编号、保留时间和m/z值、描述、化学式和子类在附录（表A1）中呈现。每个化合物的假定鉴定和完整分类在在线补充材料（S1. Metabolites ID描述和分类）中呈现。

从40小时到48小时的SSF过程中，麦曲-麦芽的代谢组学谱发生了变化。层次聚类热图（在线补充图S2.1）清晰地可视化了样本和特征的聚类情况，显示了每个样本中化合物的浓度。这项分析揭示了发酵过程中注释化合物的形成和降解的明显模式。SSF时间为40小时和44小时的BKM（BK40和BK44）彼此之间共享的化合物比与BK48共享的化合物更多，基于欧几里得-沃德方法聚类在一起。类似地，化合物被分为两个主要组：一组在BK48中浓度较高，另一组在BK40和BK44中占主导地位。这些组进一步分支成子组，表明在BK44或BK40中的浓度较高。有趣的是，一些化合物在SSF时间为44小时时达到峰值，然后在48小时时大部分被降解。PCA（在线补充图S2.2）是一种无监督的多变量方法，它在保留样本间方差的同时减少了数据集的维度。PCA将BKM分为三组。PC1（解释了59.2%的方差）主要区分了BK48与其他两组，而PC2（解释了20.5%的方差）将BK44与其他组区分开。Permanova分析确认了每组的R2值较高，表明发酵时间差异可以很好地通过PCA模型解释。然而，p值（0.1）表明组间存在一些重叠。

在得分超过40的39个特征中，大多数是脂质（26%）、有机酸（20%）、有机氧化合物（18%）和核苷/核苷酸（13%）（图6）。统计分析显示的模式与层次聚类热图（图7）中显示的注释化合物一致。在PLS-DA得分图（图8）中，BK40和BK44彼此更接近，而BK48形成了一个独立的组。PLS-DA是一种监督分类方法，它在组内最大化了协方差，并通过变量重要性（VIP）得分识别出区分变量[Citation57]。图7. 识别化合物的层次聚类热图。彩色细胞代表样本中变量的浓度（红色=高浓度，蓝色=低浓度）。图8. PLS-DA得分图（a）、载荷图（b）和VIP化合物（c）。PLS-DA生成了三个性能优异的组分（R2 > 0.95，Q2 > 0.80），并且结果偶然发生的概率较低（p = 0.04）。根据VIP结果（图8c），对模型最重要的化合物是羟基肉桂酸（对香豆酸或类似物）、腺苷和鸟嘌呤，这些化合物在BK40中的含量较高，并且随着发酵时间的延长而减少。羟基肉桂酸是一种存在于大麦中的酚类化合物，具有收敛性风味，并作为黄酮类、单宁和姜黄素类化合物的前体[ASBC风味数据库][Citation58]。鸟嘌呤和腺苷是参与DNA和RNA合成的嘌呤核苷酸，在能量代谢和其他细胞功能中至关重要[Citation59]。然而，过量摄入嘌呤会导致体内嘌呤代谢物和尿酸的过度积累，这与痛风疾病有关[Citation60]。一些麦曲霉菌，包括A. luchuensis[Citation61]和某些清酒菌株[Citation62]，已被报道能产生降解嘌呤的酶。其他区分化合物包括氨基酸（例如二肽和L-吡咯烷酸）以及来自白三烯脂质氧化的化合物。氨基酸具有多种作用，包括参与含氮化合物的途径、辅因子、核苷酸和次级代谢物（如风味化合物）[Citation63]。它们还可以参与美拉德反应，形成颜色和风味化合物。样品中鉴定出的脯氨酸、天冬酰胺和谷氨酸赋予甜味或类似鲜味的风味，而核苷酸如腺苷单磷酸则增强鲜味感知（ASBC啤酒风味数据库[Citation64–66]）。

随着SSF时间的延长，某些化合物减少，包括N-乙酰神经氨酸（唾液酸，与真菌粘附相关）和氰苷糖苷linamarin（具有苦味[Citation67,Citation68]。linamarin的减少可能反映了A. oryzae的解毒过程，已知它可以将氰苷糖苷代谢为更安全的化合物[Citation69]。相反，随着SSF时间的延长，一些化合物增加，包括糖基化代谢物，如（37）寡糖、（20）N2-果糖吡喃基精氨酸和（23）6-(α-D-葡糖胺基)-1D-肌醇，这些化合物表明了真菌细胞壁的调节和应激反应。应激保护性代谢物如（S）Homostachydrine也增加，反映了真菌在发酵过程中的适应[Citation70]。

为了更好地理解代谢物的演变，使用oPLS和火山图对样本进行了成对比较。火山图（图9a）识别了BK40和BK44之间变化幅度较大的显著特征，包括鸟嘌呤、腺苷、羟基肉桂酸和倍半萜类化合物，这些化合物在BK40中的含量较高。图9. BK40和BK44的火山图（a）和o-PLS（b）VIP图。火山图考虑了BK44/BK40。蓝色（左）的特征表示显著下调，红色（右）的特征表示显著上调，根据阈值FDR < 0.1和FC = 2.0。o-PLS模型（图9b）是一种基于PLS回归的监督多变量方法，它最大化了两组之间的类别差异，识别出额外的关键化合物。这些化合物包括黄素普兰宁（xanthoplanine），一种苯基异喹啉生物碱，以及与应激信号传导相关的茉莉酸衍生物——块根酸葡萄糖苷（tuberonic acid glucoside）。这两种化合物在固态发酵（SSF）进行40到44小时后含量都有所增加，这突显了它们在发酵过程中作为次级代谢产物的作用。块根酸葡萄糖苷可能是由米曲霉（A. oryzae）的β-葡萄糖苷酶对茉莉酸进行酶促分解产生的。[Citation71,Citation72] 黄素普兰宁属于苯基异喹啉生物碱中的阿朴啡类（aporphine），这类生物碱具有多种生物活性，包括抗菌和细胞毒性作用、抗氧化效果以及与神经递质受体的相互作用。[Citation73] 在SSF过程中其浓度的增加表明它可能在微生物生态系统中发挥作用，或是米曲霉产生的应激响应代谢物。

通过比较BK44和BK48，火山图（Figure 10a）和oPLS VIP图（Figure 10b）显示最显著的变化是倍半萜类化合物和(S)-Homostachydrine的含量增加，同时三糖的含量减少。此外，(GPI)-anchors（如6-(alpha-D-Glucosaminyl)-1D-myo-inositol）和寡糖含量的增加可能表明了霉菌的生长和细胞壁的调节。这些趋势揭示了米曲霉在SSF过程中的动态适应，包括细胞壁的重塑和代谢产物的产生。

为了研究麦芽与对照麦芽之间的主要差异，并突出麦芽的独特性，对其代谢谱进行了评估。数据过滤后，最初的694个特征（mz/rt数据矩阵）被缩减为216个最能代表数据集的特征。样品经过总和归一化、对数转换和帕累托缩放处理。与对照麦芽相比（在线补充图S3.1），可以看出只有三分之一的特征在麦芽中的含量更高。使用欧几里得-沃德方法（Euclidean-Ward method）生成的层次聚类热图（在线补充图S3.2）显示，BKM根据SSF时间（BK_48、BK_44、BK_40）形成了一个与对照麦芽不同的群体。特征还根据其浓度被分为两大组：一组在对照麦芽中含量高，另一组在BKM中含量高。总体而言，大多数在对照麦芽中含量高的特征在BKM中的含量较低，反之亦然。PCA分析（在线补充图S3.3）进一步证明了BKM与对照麦芽的分离。第一个主成分（PC1）解释了94%的变异，清晰地将BKM与对照麦芽区分开来。第二个主成分（PC2）解释了3.9%的变异，根据SSF时间将BK样品分为三个不同的组。

在关注的39种化合物中，统计分析显示出了与所有注释代谢物相似的聚类趋势。这些趋势在层次聚类热图（Figure 11）和PCA得分图（在线补充图S3.4）中得到了可视化。然而，这些特征在区分BK40和BK44方面的效果较差。

PCA分析（Permanova方法：F值52.763；R2 = 0.84067；p值=0.004，基于999次排列）沿PC1轴将对照麦芽与BK样品区分开来，解释了82.3%的变异，而PC2轴（解释了3.9%的变异）根据SSF时间将样品分为三个不同的组。

火山图和oPLS模型（Figure 12）被用来识别区分对照麦芽和BKM的最重要特征。oPLS模型的p1成分解释了75.5%的变异，R2Y=99.5%，R2X=99.3%，p值为0.002。

根据VIP和火山图（Figure 12），在麦芽中浓度显著较高的关键化合物包括倍半萜类化合物（如melleolides）、单萜类吲哚生物碱、酚类糖苷（5-Hydroxy-tryptophol glucuronide）和二肽（Asparaginyl-Proline）。萜类化合物如melleolides因其抗菌特性而具有生物活性。[Citation74] 单萜类吲哚生物碱，包括tabersonine和vindoline，被认为具有抗癌活性。[Citation75] 这些发现强调了麦芽的代谢多样性及其潜在的生物活性。相比之下，对照麦芽中浓度显著较高的化合物包括黄酮类糖苷（Glucoliquiritin apioside）、三糖、腺苷一磷酸（adenosine monophosphate）和二萜类化合物。二萜类化合物参与植物脂质代谢（例如细胞信号传导和膜稳定），在对照麦芽中更为丰富。[Citation59] 需要强调的是，对照麦芽保留了大麦的麸皮和胚芽，而大部分脂质、萜类化合物和其它微量营养素位于大麦的外层，在珍珠化过程中被去除。[Citation76] 对照麦芽中这些化合物的较高浓度也可能表明麦芽发酵过程中的酶活性促进了某些代谢物的更广泛分解和转化。相反，麦芽制造过程似乎保留了来自大麦的化合物，如黄酮类和二萜类，这可能有助于对照麦芽的独特特性和工艺性能。

为了探索代谢组学与麦芽品质参数（MQA）之间的关系，我们使用了代谢物作为预测变量（X变量）和MQA作为响应变量（Y变量）进行了O-PLS回归分析。

在评估不同SSF时间的三种麦芽样本时（Figure 13），模型生成了四个成分，累积R2X=0.98，R2Y=0.547，Q2=0.38。尽管模型捕捉到了大部分X（预测变量）的变异，但它只能部分解释Y（响应变量），导致分类能力较低。由于BK40和BK44样品的工艺特性相似，模型难以准确分类它们。

在比较BKM与对照麦芽时（M），模型生成了两个成分（R2X=0.935，R2Y=0.87，Q2=0.736），在OPLS双图中清晰地将两组区分开来，这是由于代谢物浓度的显著差异和不同的工艺特性。

BKM与对照麦芽在火山图（a）和o-PLS（b）VIP图中表现出显著差异。蓝色（左侧）的特征在BKM中下调，红色（右侧）的特征在BKM中上调，根据阈值FDR<0.1和FC=2.0。