评估振动和声学信号在二级生物安全柜中对角质形成细胞伤口愈合的影响 Mete ??ü? 和 Zeynep Güne? ?zünal

《Acoustics》：Evaluation of the Effect of Vibration and Acoustic Signals in a Class II Biological Safety Cabinet on Wound Healing in Keratinocytes Mete ??ü? and Zeynep Güne? ?zünal

　　摘要：II级生物安全柜（BSC）通过维持HEPA过滤的气流来保护用户、产品和实验室环境；然而，其风扇、警报器和结构共振会引入声学和振动刺激，这些刺激可能会干扰机械敏感的细胞培养实验。在本研究中，我们描述了细胞培养实验室和II级BSC的振动声学环境，根据测量和建模的结果选择了代表性的托盘位置，并在警报诱导的声学暴露下使用划痕实验评估了HaCaT角质形成细胞的体外伤口闭合情况。24小时后的伤口闭合程度通过一个相对面积闭合指标来量化，该指标定义为24小时时的伤口面积与0小时时的伤口面积之差。对于每个生物重复样本（一个烧瓶和一个划痕），选择两个不重叠的图像区域作为技术子样本，并取平均值以获得单个烧瓶级别的值。进行了三次独立的实验运行，每次实验每个托盘点对应一个烧瓶，因此每个托盘点有n=3个独立的烧瓶。托盘点P1、P5和P6的平均伤口闭合值分别为73.7%±15.6%、75.6%±7.2%和79.4%±14.8%（平均值±标准差）。在各点之间未检测到统计学上的显著差异（单因素方差分析，F=0.15，p=0.86）。这些发现表明，在解释划痕实验结果时，应记录与BSC相关的声学和振动刺激，并鼓励进行更大规模的、有对照组的研究，以解决对实验重复性有影响的微小效应问题。

1. 引言
生物安全柜（BSC）是生命科学实验室中的关键工程控制装置，用于容纳气溶胶并保护人员和生物材料[1,2,3]。BSC的发展是由生物安全需求和标准化努力推动的，最终形成了广泛采用的性能标准，如EN 12469（欧洲）和NSF/ANSI 49（北美）。这些标准强调保护效果，并包括噪音限制（EN 12469通常为65分贝，NSF/ANSI 49为67分贝，在规定的测量条件下），而振动则通过稳定性和性能要求间接得到处理[4,5]。
对于细胞培养工作流程，BSC通常被视为“中性”平台。实际上，其风扇、电机、气流湍流和可听见的警报可能会引入周期性机械激励和声压波动，频率范围从数十赫兹（结构振动）到千赫兹（警报音调）。由于贴壁细胞中的机械转导途径可以对微妙的机械信号作出反应，因此与BSC相关的刺激可能成为机械敏感实验（如划痕（伤口愈合）实验中的混淆变量[6]。这种潜在的混淆尤其重要，因为细胞培养研究是药物开发过程中疗效和安全评估的基本组成部分。基于细胞培养的模型不仅用于临床前药物开发和临床试验，还用于患者来源的类器官研究，为精准医疗方法做出贡献[7]。更广泛地说，已报道受控的声学和超声暴露可以诱导可测量的、特定于细胞类型的机能变化，包括在PVDF膜上通过超声介导的神经元样PC12细胞的压电分化[8]、由钙依赖机制调节的增强外泌体生成[9]，以及在高频超声下相对不动的人类精子的运动能力增强[10]。
越来越多的文献表明，机械和声学/振动刺激可以调节细胞行为，包括迁移和细胞骨架组织[11,12]。研究表明，在声学振动下纤维母细胞的迁移会发生变化[13]，并且表面声波已被证明会影响体外伤口模型中的集体迁移[14,15]。在临床背景下，振动疗法已被研究作为难愈合伤口的潜在辅助疗法[16]。然而，由标准化实验室设备（如II级BSC）引起的偶然声学/振动暴露的具体情况仍然没有得到充分探索。除了“刺激”之外，声学还广泛用作无接触的细胞操作方式：在驻波或声流系统中，干涉会产生结构化的压力场，细胞可以在声辐射力的作用下向压力节点移动，其运动受到声辐射和流体动力学阻力/流动效应的平衡控制[17,18,19]。例如，在组织工程背景下，超声驻波已被用于将肌母细胞群组织成排列整齐的结构，在报告的条件下，短时间的暴露并未显著改变alamarBlue测试中的代谢活性[17]。同时，综述强调生物结果可能是异质的，长期/参数敏感的效应需要仔细表征[11,19]。与此警告一致的是，一项驻波研究指出，结果可能对暴露条件敏感——这突显了在应用声场于细胞时需要稳健的方案和温度控制[20]。相关地，使用音频信号工作流程（例如，受控脉冲）构建的节奏性垂直振动范式已经从加速度和估计的剪切应力方面进行了表征，并在某些条件下与可测量的细胞骨架（F-actin）变化和细胞周期效应相关联[12]。总体而言，这些发现支持这样的前提：来自实验室设备的偶然声学/振动刺激——如II级BSC中的音调警报和机械耦合的托盘/烧瓶振动——可能会无意中再现这些机械刺激环境的元素，因此在解释机械敏感实验时应进行记录和控制。
划痕实验和其他迁移读数本质上是机械敏感的，因为集体运动取决于细胞-基底和细胞-细胞之间的力平衡，并可能受到微弱外部机械线索的干扰[21]。
声学激励可以通过基底传播的振动和变形以及培养容器中的压力场和流动（流动/剪切）扰动耦合到贴壁单层细胞中，这些已被证明可以在声波驱动下调节迁移方向性和类似伤口的实验[14,15,22,23]。因此，常规的BSC操作（电机谐波、音调警报）和房间声学条件（混响和模态结构）可能成为不受控制的实验因素。因此，本工作将BSC不仅视为一种生物安全装置，还视为应在机械生物学和药物筛选环境中记录和控制的潜在结构化机械/声学刺激源。
本工作的目标有两个：（i）描述细胞培养实验室和II级BSC的振动声学环境，包括相关共振（房间、BSC腔体和培养烧瓶）；（ii）在警报诱导的声学暴露下，评估选定的BSC托盘位置上的HaCaT角质形成细胞伤口闭合情况。为了加强生物测量流程，使用基于相对面积的闭合指标来量化伤口闭合，并在烧瓶级别进行分析，以避免伪重复。

2. 材料与方法
实验在伊斯坦布尔Atlas大学的细胞培养实验室进行，使用的是Nüve公司生产的II级A2型BSC（位于土耳其安卡拉）。进行了一系列声学评估，包括房间噪音和混响特性、矩形封闭体的模态估计以及BSC工作托盘上的振动测量。这些测量结果为选择划痕实验的代表性托盘位置提供了依据。

2.1. 噪音和混响测量
使用校准的micW i436麦克风（IEC 61672-1 Class 2合规[24]）和SignalScope Pro 2018（iOS）进行实验室内的噪音水平测量，用于数据采集和分析。测量在距离BSC前面开口1米的位置以及实验室内的多个位置进行，使用相同的采集链和分析设置以确保条件间的可比性。混响时间（）使用气球爆裂脉冲响应估算，并根据EN ISO 3382-2[25]进行处理。

2.2. 矩形腔体模态估计
对于矩形封闭体（实验室和BSC腔体），使用以下公式估算共振频率：
\[ f_n = \frac{2\pi c^2}{A\sqrt{\lambda^3}} \]
其中c是空气中的声速，A是封闭体的体积，\(\lambda\)是模式指数。

2.3. 烧瓶腔体模态分析
为了研究BSC产生的声音如何耦合到培养烧瓶中，构建了一个25平方厘米烧瓶腔体的三维声学模型。使用FEniCS（版本2019.1.0）通过有限元方法（FEM）进行了声学模态分析；烧瓶几何形状是在Gmsh中生成的。检查了前十个模态，并突出了接近BSC警报频谱内容的模态形状。

2.4. BSC托盘上的振动测量
使用333D01 Digiducer? USB数字加速度计（The Modal Shop, Inc., Cincinnati, OH, USA）和SignalScope Pro 2018在穿孔工作托盘的九个位置测量振动。选择测量点以代表典型的烧瓶放置位置。采集程序遵循ISO 4866:2010[26]指南进行振动监测。BSC工作托盘上的测量位置如图1所示。图1显示了II级BSC工作托盘上的加速度计测量位置（P1–P9）。下部阴影区域表示托盘的穿孔部分。所示尺寸以毫米为单位，对应于振动映射期间使用的测量布局。

2.5. 细胞培养和划痕实验
HaCaT角质形成细胞在37°C和5% CO2的DMEM培养基中培养，培养基中添加了10%的胎牛血清和1%的青霉素-链霉素。细胞接种到25平方厘米的烧瓶中并培养至汇合。使用无菌5毫升血清吸管尖端制作线性划痕。脱落的细胞用PBS清洗，并添加新鲜培养基。烧瓶底部做了标记，以确保在0小时和24小时时能够成像同一区域。图像使用倒置显微镜（×4放大倍率）和数码相机获取。

2.6. 声学暴露协议
所有烧瓶在相同的实验室环境条件下同时暴露（相同的房间、暴露时间和托盘上的放置/方向），并在30分钟暴露后立即返回到培养箱中。烧瓶垂直放置在预定的托盘位置（P1、P5、P6）。细胞在室温下暴露于BSC警报声30分钟。监测室温以确保所有样本在暴露期间经历的条件相同。

2.7. 伤口量化
使用基于面积的相对闭合指标从0小时和24小时获取的成对相位对比图像中量化伤口闭合情况，该指标与已建立的体外伤口愈合/划痕实验工作流程和量化方法一致[27,28,29]。对于每个烧瓶（一个划痕），沿相同的划痕线拍摄两个不重叠的视野区域（区域1和区域2）。这些区域被视为技术子样本（即，来自同一生物重复样本的重复测量），因此在统计测试中不被视为独立观察。
对于每个区域和时间点，使用Paint.NET 5.0.13中的“魔法棒”工具根据图像间的对比度差异手动调整容差来分割伤口区域[30]。然后按照以下公式计算24小时时的相对伤口闭合程度[29]：
\[ \Delta A_{24} = \frac{A_{24} - A_0}{A_0} \]
首先分别获得区域1和区域2的\(\Delta A\)值。为了避免伪重复，通过平均每个生物重复样本内的可用区域值（每个托盘点一个烧瓶，每次实验运行）来计算单个烧瓶级别的闭合值，所有组比较都使用这些烧瓶级别的平均值进行。所有图像都在固定放大倍率（4×）和恒定像素分辨率下获取；因此，不需要进行几何缩放。
在分析之前对图像文件进行了匿名处理，以便执行分割的操作员不知道托盘点和实验日期。对于每张图像，选择容差以捕获整个伤口区域，同时尽量减少包含相邻细胞覆盖区域的情况；分割输出在成对的0小时和24小时图像之间进行了视觉检查以确保一致性。

2.8. 统计
数据以平均值±标准差（SD）的形式报告。由于区域1和区域2来自同一烧瓶，因此使用烧瓶级别的平均值（每次实验运行每个托盘点一个值）进行托盘点间的统计比较。使用单因素方差分析（ANOVA）测试组间差异；\(\Delta A\)被认为具有统计学意义。每个托盘点的有效样本量是独立生物重复样本的数量，即每次实验运行从三个独立实验中获得的烧瓶数量。

3. 结果
为了评估与BSC相关的声学和振动刺激是否可能影响划痕实验结果，我们首先描述了实验室和BSC环境，然后量化了选定的托盘位置上的\(\Delta A\)。

3.1. 声学和振动特性
为了确定影响细胞培养的振动和声学因素，收集了从房间声学到BSC腔体声学的数据，以及从细胞培养烧瓶振动到BSC托盘振动的数据。目的是检查在正常操作条件下可能与细胞相互作用的主导频率的影响。

3.1.1. 噪音和混响测量
图2a中的频谱测量显示了一个明显的与警报相关的音调成分，中心频率约为3526 Hz，叠加在实验室的宽带操作噪音上。在背景条件下，A加权等效声压级测量值为48分贝（A），而BSC警报的激活使整体声压级上升到77分贝（A），表明在警报事件期间存在显著的声学干扰。图2显示了细胞培养实验室的声学测量结果：(a) 背景条件和操作条件下的噪声谱；(b) 以三分之一八度带宽表示的频率依赖性混响特性。图2b中的混响时间测量结果显示，在135赫兹到315赫兹的低至中频范围内，混响时间显著延长，超过了典型的实验室设计目标。空间的整体混响时间被测量为……秒，表明这是一个相对反射性的声学环境。尽管与警报相关的频谱峰值位于千赫兹范围内，但高声压级和长时间混响的结合表明声能持续存在以及结构耦合的可能性增加，这需要进一步分析培养瓶的声学模式和托盘的振动响应。

3.1.2 矩形腔模式估计
房间尺寸为……米×……米×……米。第一个房间模式从……赫兹开始，对于前几个模式，提供了Bonello标准。在振动测量结果之后将考虑的其他模式频率为……赫兹和……赫兹。
BSC托盘的尺寸为……米×……米×……米。对于这种尺寸的体积，观察到第一个轴向模式发生在……赫兹。应该注意的是，这个声学模式也被考虑在后续分析中，因为它对托盘以及培养瓶有直接影响。

3.1.3 培养瓶腔模式分析
使用有限元模态分析研究了细胞培养瓶的前十个声学模式。特别关注这些低阶模式，因为它们预计会产生更高空间一致性的声压场，因此对细胞培养产生更强的机械影响。
图3展示了选定模式的代表性压力分布：(a) 第一个轴向模式在……赫兹，(b) 第二个轴向模式在……赫兹，以及(c) 第一个切向模式在……赫兹。其中，大约3700赫兹的切向模式特别值得注意，因为其共振频率接近实验室测量中观察到的主要警报相关频谱峰值（图2）。

3.1.4 BSC托盘的振动测量
从所有测量点获得的BSC电机和警报运行时的振动加速度结果被绘制在1赫兹到10千赫兹之间，如图4所示。因此可以在托盘上看到不同培养瓶放置点的高加速度振动。这些测量显示了相对于背景振动加速度的峰值，特别是在22赫兹、30赫兹、50赫兹、135赫兹、178赫兹和3525赫兹的频率。图4显示了BSC电机和警报开启时工作托盘上的振动测量结果。三个位置P1、P5和P6对警报声音以及房间和BSC腔模式频率都敏感。观察到这些点在20赫兹到50赫兹之间由于结构和BSC源产生了峰值振动加速度，在3520赫兹到3550赫兹之间由于警报声音产生了峰值振动加速度，如图5所示。图5显示了BSC电机和警报开启时工作托盘上P1、P5和P6点的振动测量结果，分别显示了(a)警报引起的振动，(b)结构和BSC引起的振动。根据这些分析，主要振动成分及其可能的来源在表1中进行了总结。

4. 讨论
本研究将实验室声学和设备产生的振动与一种机械敏感的生物读数——HaCaT角质形成细胞的体外划痕闭合联系起来。使用相对面积闭合度量标准，并通过培养瓶级别的推断来避免伪重复，24小时时的闭合值在选定的托盘点（P1、P5、P6）之间具有相似的大小，并且在这个初步数据集中没有检测到统计学上的显著点对点差异。重要的是，测量活动仍然揭示了结构化的振动声学条件，包括托盘振动的空间变异性以及BSC警报内容与培养瓶腔模式之间的频谱接近性，这些共同提供了常规BSC操作可能作为机械敏感检测中未被识别的实验因素的合理耦合途径。这种解释与先前的研究一致，这些研究表明外部施加的振动或声学介导的机械刺激可以改变粘附培养物中的迁移相关或机械生物学细胞结果和细胞骨架组织。此外，仔细表征的声学刺激也被证明可以在受控暴露条件下驱动细胞类型的特定功能变化（例如，压电基底分化、外泌体生成和运动能力的恢复），这加强了频率内容、剂量和耦合在生物学上的意义。

4.1 限制和未来工作
限制包括：(i) 同一实验块中缺乏无警报（假）对照，这阻止了将警报暴露效应与HaCaT培养物的基线划痕闭合动态分离；(ii) 选择的托盘位置被选为振动/声学敏感点，并且没有包括一个故意的低暴露比较位置；(iii) 对培养瓶表面声学场的有限表征（例如，空间声压级映射）以及使用单轴加速度计而不是三轴测量；(iv) 在30分钟暴露期间外部环境条件（例如，温度、二氧化碳、pH值和处理）的潜在影响，尽管温度被监测并且所有培养瓶同时暴露。未来的研究应包括匹配的假暴露，增加生物学重复性，并使用具有量化剂量指标的受控声音/振动源来测试与预测的房间/BSC/培养瓶共振相一致的频率特定假设。
先前的工作强调，细胞在声学暴露下的反应可能对协议细节和次要效应敏感，因此需要仔细表征暴露条件以区分主要声学效应和混杂因素。同样，多轴测量和机械剂量估计（例如，加速度和诱导的流动/剪切代理）提供了施加的振动信号与粘附细胞所经历的刺激之间的更清晰的机械联系。在更广泛的层面上，声机械生物学研究强化了振动/声学刺激可以通过多种机械途径与细胞功能相互作用。

4.2 样本大小规划和重复的独立性
由于目标是检测BSC引起的偶然刺激的潜在混淆效应，即使是很小的差异（例如，5个百分点）也可能对检测的重复性和下游药物筛选解释具有实际意义。因此，我们提供了基于初步数据的样本大小估计，用于两个托盘点之间平均值的双侧比较，注意到平均值是从一个小规模初步数据集中估计的，并且应该随着额外重复数据的出现而更新。假设共同的标准差、相等的组大小、显著性水平和目标功效，每个组所需的独立生物学重复次数（培养瓶）可以通过以下公式估算：（3）其中是平均闭合度的最小可检测绝对差异（例如，对于5个百分点）。使用初步数据集中的培养瓶级别变异性，每个托盘点的所需样本大小分别为……和……，在……和80%的功效下。在三次独立实验运行中，每个培养瓶点有……个独立培养瓶。然后计算每个区域的平均值和标准差（），并在每个培养瓶级别值上平均（）。