《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Low concentrations of sorafenib increase dihydrosphingomyelin during antifibrotic processes in human hepatic stellate cells
编辑推荐：
金妍秀（Yeonseo Kim）| 哈姆·巴克努恩（Baknoon Ham）| 金汝真（Yeojin Kim）| 郑秉华（Byung Hwa Jung）| 朴珍荣（Jinyoung Park）| 李贤范（Hyunbeom Lee）韩国科学技术院先进生物分子识别中心，首尔02792
金妍秀（Yeonseo Kim）| 哈姆·巴克努恩（Baknoon Ham）| 金汝真（Yeojin Kim）| 郑秉华（Byung Hwa Jung）| 朴珍荣（Jinyoung Park）| 李贤范（Hyunbeom Lee）
韩国科学技术院先进生物分子识别中心，首尔02792，大韩民国
摘要
背景
抑制肝星状细胞（HSCs）的活化是肝纤维化发生的初始步骤，因此这是治疗纤维化的关键策略。索拉非尼已被重新用作抗纤维化药物；然而，其报告的效果主要依赖于细胞毒性机制。而低剂量索拉非尼所诱导的抗纤维化机制仍不明确。我们的目标是利用低浓度索拉非尼来阐明HSC失活过程中基因表达和脂质代谢物的动态变化。
方法
通过转化生长因子（TGF）-β处理激活人肝星状细胞（LX-2），以创建一个纤维化环境。将激活的细胞用索拉非尼处理后，对其进行转录组学和脂质组学分析。在转录组学分析中，使用基于Benjamini–Hochberg方法的调整后的P值来评估统计显著性；而在脂质组学分析中，则使用MetaboAnalyst来评估显著性。
结果
在纤维化过程中，我们观察到与细胞外基质相关的基因（COL1A1（P <.001）、FN1（P <.001）、THBS1（P <.001）、P4HA3（P <.01）和CXCL12（P <.01））的表达上调，CXCL12是Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路的上游调节因子。同时，二氢神经酰胺（dhCer）和二氢鞘磷脂（dhSM）的水平下降（两者P <.001）。相比之下，索拉非尼诱导的抗纤维化条件显著逆转了这些分子和脂质组学趋势（所有P <.01）。
结论
根据观察到的趋势，我们提出激活dhSM合成通路可能在纤维化中起调节作用。总体而言，我们的研究为理解抗纤维化反应的分子机制提供了新的脂质学见解。
引言
肝星状细胞（HSCs）的活化是肝纤维化发展的第一步。活化后，HSCs会转变为类似肌成纤维细胞的细胞，这些细胞分泌细胞外基质（ECM）蛋白，从而引发纤维化[1]，[2]。ECM蛋白的持续积累最终会导致慢性纤维化，进而可能发展为肝硬化，需要肝脏移植。为了防止纤维化的进展，已经开发出一些策略来消除或使活化的HSCs失活[3]。然而，除了促进纤维化的作用外，HSCs在健康的肝脏中也执行多种重要的生理功能。例如，它们是维生素A（视黄酯）的主要储存场所，并参与肝脏组织再生、免疫调节（特别是在炎症反应中）[4]以及胆管发育[5]。因此，与其诱导HSCs凋亡，不如采取将活化的HSCs恢复到静止状态的治疗策略更为关键。
已经对HSC活化的机制进行了广泛研究，以确定有效的肝纤维化治疗靶点。许多研究报道了与HSC活化相关的关键表型和分子特征。例如，活化的HSCs表现出纤维化标志物的表达增加，包括α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、I型和III型胶原蛋白以及组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP）-1[6]，[7]，[8]，同时脂滴（LDs）的数量和大小显著减少[9]，[10]，[11]。此外，HSC活化伴随着PPARγ活性和表达的降低[12]，[13]，游离胆固醇的积累[14]，以及内源性大麻素和神经酰胺水平的升高[15]，以及脂质代谢相关酶（如FASN和MLYCD）在mRNA和蛋白质水平上的显著下调[16]。最近，Molenaar等人（2023年）表明，大鼠HSCs的活化会诱导脂滴内中性脂质的重塑[17]。相反，当HSCs恢复到非活化状态时，脂滴的大小会增加，与脂滴相关的ATG2A蛋白的表达也会增强[18]。这些发现表明，活化的HSCs在脂质相关因子方面发生了显著变化。因此，我们假设HSCs的脂质池的整体变化与纤维化和抗纤维化过程密切相关。
纤维化的潜在机制非常复杂，这使得新型治疗方法的开发具有挑战性。因此，药物再利用被作为一种抗纤维化治疗的研究策略。索拉非尼是一种获得FDA批准的一线治疗肝细胞癌的药物，它针对多种酪氨酸激酶和Raf-MEK-ERK信号通路，从而抑制肿瘤生长、增殖和血管生成。尽管索拉非尼最初是为治疗肝癌开发的，但在许多研究中它已被重新用作抗纤维化药物。索拉非尼的抗纤维化效果归因于多种机制，包括半胱天冬酶介导的细胞凋亡[19]、短期治疗引起的自噬性细胞死亡[20]、ER应激触发的非凋亡性细胞死亡[21]以及HSCs的铁死亡[22]。因此，在大多数情况下，索拉非尼的抗纤维化效果与细胞死亡诱导有关。然而，Chongshu等人（2020年）证明了相对于标准治疗剂量，低剂量索拉非尼在体内治疗非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的临床可行性[23]。因此，在许多先前的研究中，索拉非尼经常被用作识别抗纤维化治疗靶点的药理学工具。在这项研究中，我们旨在阐明非细胞毒性剂量的索拉非尼所诱导的抗纤维化效果的分子机制，并提出能够抑制HSC活化的治疗靶点。
部分摘录
细胞培养
人肝星状细胞系LX-2购自MilliporeSigma（美国密苏里州圣路易斯）。细胞库存储存在含有10%胎牛血清（FBS，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）和1%抗生素抗真菌溶液（100倍稀释）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，GenDEPOT，美国德克萨斯州休斯顿）中。第二天，将培养基更换为添加了2% FBS和1%抗生素抗真菌溶液的DMEM（GenDEPOT）。
低浓度的索拉非尼以最小的细胞毒性抑制HSC活化
索拉非尼在两种处理时间下都以浓度依赖的方式降低了LX-2细胞的活力。然而，与24小时暴露相比，48小时的暴露导致细胞活力进一步下降（图1a）。尽管如此，在两种条件下，2.5 μM索拉非尼下的细胞活力仍保持在80%以上。因此，选择2.5 μM作为后续实验的最大浓度。为了确定低浓度索拉非尼是否具有抗纤维化效果，添加了5 ng/mL的TGF-β
讨论
在这项研究中，我们旨在识别用非细胞毒性剂量的索拉非尼处理后活化的HSCs中发生改变的基因和代谢物，索拉非尼具有抗纤维化特性。通过这样做，我们希望提出新的抗纤维化治疗靶点，能够在不引发细胞毒性的情况下抑制HSC活化。
我们发现2.5 μM的索拉非尼可以逆转LX-2细胞中的TGF-β诱导的纤维化。为了阐明这一结果的机制，我们进行了
结论
总之，2.5 μM的索拉非尼表现出最小的细胞毒性，有效地抑制了HSCs的活化，并显著降低了CXCL12的水平，同时增加了dhSM的水平。我们的发现表明，抗纤维化效果可以通过HSCs的失活而不是细胞死亡来实现，提供了一种保留HSCs生理功能的替代治疗策略。值得注意的是，dhSM作为一种脂质种类，在
CRediT作者贡献声明
金妍秀：撰写——原始草稿，可视化，研究，正式分析，概念化。朴珍荣：监督，概念化。郑秉华：监督，概念化。金汝真：可视化，正式分析。哈姆·巴克努恩：正式分析，数据管理。李贤范：撰写——审阅与编辑，监督，资金获取，概念化
数据可用性声明
支持本研究结果的数据可在文章及其补充信息中找到。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
资金声明
本研究得到了未来生物技术发展项目和韩国科学技术院（KIST）机构项目（2E33742）的资助。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
