Computational design of an ultrapotent deltacoronavirus miniprotein inhibitor

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Computational design of an ultrapotent deltacoronavirus miniprotein inhibitor

　　

海地发生了多起猪δ冠状病毒（PDCoV）溢出事件，目前尚无批准用于人类的疫苗或疗法。研究人员通过计算设计了PDCoV微型蛋白抑制剂（又称微型粘合剂，MBs），并鉴定出一种（MB11）能以皮摩尔（picomolar）亲和力与PDCoV受体结合域（RBD）结合，其效力强劲且能广谱中和亲缘关系较远的δ冠状病毒（DCoVs）。MB11可抵抗多种生化应激，这是便于储存和递送的理想特性。这些数据为开发治疗药物以应对未来可能出现的PDCoV疫情铺平了道路。在此，研究人员报道了PDCoV微型蛋白抑制剂的从头设计，并表明其中一种抑制剂MB11能以皮摩尔亲和力与PDCoV受体结合域（RBD）结合。MB11能有效抑制PDCoV，优于单克隆抗体，并能交叉反应和广谱中和一系列亲缘关系较远的DCoVs。研究人员解析了MB11与PDCoV RBD结合的冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构，揭示了其通过干扰宿主受体结合实现广谱DCoV中和的分子机制。对PDCoV RBD的深度突变扫描（deep mutational scanning）显示，MB11具有很高的病毒逃逸屏障，仅有少数突变介导逃逸而不削弱APN受体结合。MB11能抵抗严格的生化应激，包括高温、低pH值和蛋白水解，这可能使其能够递送至各种组织以抑制病毒。这项工作确定了一个用于PDCoV感染临床评估和大流行防范的主要候选药物。

本研究聚焦于猪δ冠状病毒（PDCoV）的防治难题，针对目前缺乏有效人用疫苗及广谱治疗药物的现状，研究人员通过计算生物学手段设计并验证了一种超强效的微型蛋白抑制剂MB11。该研究不仅证实了MB11在体外对PDCoV及其相关病毒的卓越抑制能力，还从原子层面揭示了其作用机理，并评估了其作为候选药物的成药性潜力。此项研究成果已发表于《Proceedings of the National Academy of Sciences》。

研究背景与意义

冠状病毒（CoVs）属于冠状病毒科，能够引起从温和到严重的肠道、呼吸道及神经系统疾病。其中，δ属冠状病毒（DCoVs）的自然宿主被认为是禽类，然而PDCoV在海地的多次跨物种传播事件凸显了其人畜共患的潜在风险。尽管针对SARS-CoV-2和MERS-CoV的研究已取得显著进展，但目前尚无任何针对DCoVs的获批疫苗或特效疗法。PDCoV利用氨基肽酶N（APN）作为受体进入细胞，其刺突（S）糖蛋白是介导病毒感染的关键。此前虽有少量PDCoV单克隆抗体或小分子药物被报道，但它们普遍存在中和谱窄或效力中等的问题。因此，开发能够应对未来DCoV潜在大流行的广谱抑制剂迫在眉睫。

关键技术方法

研究人员主要采用了以下关键技术：1. 利用Bindcraft进行微型蛋白（MBs）的从头设计，并结合AlphaFold3预测其与PDCoV RBD的结合构象；2. 生物膜干涉技术（BLI）筛选并测定MBs与RBD的结合动力学及亲和力；3. 基于VSV假病毒系统评估MBs对不同DCoVs的中和活性；4. 冷冻电子显微镜（cryo-EM）解析MB11-RBD复合物的高分辨率结构；5. 深度突变扫描（DMS）绘制病毒逃逸图谱；6. 通过蛋白酶消化、极端pH及高温孵育实验评估MB11的生物物理稳定性。

研究结果

Computational Design of PDCoV Miniprotein Inhibitors

研究人员利用Bindcraft生成了靶向PDCoV RBD的微型蛋白库，经AlphaFold3结构预测筛选后，通过生物膜干涉技术（BLI）和生物活性测试，从17个候选分子中筛选出6个具有结合活性的MBs。其中，MB11表现出最慢的解离速率和最高的单体分散性，其与PDCoV RBD的平衡解离常数（K_D）达到155 ± 28 pM，对PDCoV假病毒的中和半数抑制浓度（IC₅₀）为216 pM。

MB11 Broadly Neutralizes Distantly Related DCoVs

为了评估MB11的广谱性，研究人员测试了其对涵盖DCoV系统发育多样性的多个RBD的结合能力。结果显示，MB11不仅能结合亲缘关系较近的SparrowCoV，还能结合与PDCoV RBD序列同一性仅为59%的MuniaCoV。BLI和假病毒中和实验证实，MB11对SparrowCoV和MuniaCoV均表现出纳摩尔级甚至皮摩尔级的强效中和活性，显著优于此前报道的PD33抗体Fab片段。深度突变扫描进一步揭示，MB11的逃逸位点极少，且大多数逃逸突变会严重损害病毒与受体的结合能力，表明其具有较高的抗病毒逃逸屏障。

MB11 Is Resilient to Various Biochemical Stresses

考虑到PDCoV的肠道致病特性，口服给药可能是理想的给药途径。研究人员模拟胃肠道环境对MB11进行了稳定性测试。结果表明，MB11在胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和羧肽酶A的消化下结构基本稳定，且在pH 2.2的酸性环境或70°C的高温处理后，仍能保留对PDCoV RBD的结合能力。这一特性使得MB11具备了在恶劣环境下储存和递送的潜力。

MB11 Inhibits Viral Entry Via Interference With Binding to the Host Receptor

研究人员解析了MB11与PDCoV RBD复合物的2.8 ?冷冻电镜结构。结构分析显示，MB11主要呈α螺旋结构，其结合界面与宿主受体APN存在空间位阻冲突。通过将MB11结合态的RBD结构与APN结合态的RBD结构进行叠加，证实了MB11通过占据受体结合环（loops 1和3）来竞争性阻断APN与病毒的结合。竞争BLI实验也进一步验证了MB11能有效干扰APN与PDCoV及MuniaCoV RBD的相互作用。

讨论与结论

研究人员指出，冠状病毒频繁从自然宿主溢出至人类，如SARS-CoV-2和MERS-CoV等，这凸显了开发广谱冠状病毒防治策略的必要性。本研究描述的MB11微型蛋白不仅在抑制PDCoV方面具有超高活性，还能交叉中和亲缘关系较远的DCoVs，其性能超越了现有的抗体和小分子药物。与通常需要权衡效力和广谱性的传统抗体不同，MB11同时实现了高 potency 和 broad breadth。此外，MB11在生化应激下的稳定性使其非常适合通过口服或黏膜给药的方式应对肠道病毒感染。未来通过评估MB11的同源寡聚体构建体或与其它具有不同逃逸谱的抑制剂联用，有望进一步提高其抗病毒屏障。综上所述，MB11作为一种成本低廉、效力强劲且稳定性高的病毒抑制剂，为应对未来可能出现的DCoV大流行提供了重要的临床前候选药物和战略储备。