综述：抗分枝杆菌肽：从天然产物发现到人工智能引导设计

《Biochemistry》：Antimycobacterial Peptides: From Natural Product Discovery to AI Guided Design

　　

摘要： 分枝杆菌病原体仍然是全球主要的健康威胁，这因抗生素耐药性的快速获得和由刚性分枝杆菌膜 (mycomembrane) 呈现的强大药物扩散屏障而加剧。这些挑战重新激发了人们对抗分枝杆菌肽 (Antimycobacterial Peptides, AMyPs) 的兴趣，这是一类能够快速杀灭药物敏感性和耐药性分枝杆菌的多样化短两亲性序列。除了其内在效力之外，AMyPs 可以与现有抗生素协同作用，并且相对于传统小分子药物，其耐药性发展明显更慢。本综述综合了跨越天然生物勘探、机制引导的理性设计和化学优化策略的最新进展，这些策略已产生了效力日益强大且选择性的 AMyP 候选物。我们进一步强调了人工智能驱动发现平台的迅速兴起，这些平台利用在精选的、分枝杆菌特异性数据集上训练的机器学习模型，以越来越高的准确度预测和优化新型 AMyPs。总之，这些技术、生物学和计算学的进展勾勒了基于 AMyP 的治疗开发的快速扩展前景，并为下一代抗分枝杆菌药物设计奠定了基础。

论文主体内容总结：

1. 引言

分枝杆菌科 (Mycobacteriaceae) 包含多种细菌，存在于水生和陆地生态系统中。其中大多数是良性的环境腐生菌，但一小部分但后果严重的亚群已进化成高度成功的人类和动物病原体。其中最主要的是结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis, Mtb)，它是结核病 (tuberculosis, TB) 的病原体，结核病曾是“白色瘟疫”，目前仍是全球单一传染源导致死亡的主要原因之一。同时，非结核分枝杆菌 (nontuberculous mycobacteria, NTM)，包括脓肿分枝杆菌 (Mycobacteroides abscessus) 和鸟分枝杆菌 (Mycobacterium avium)，已成为日益普遍的机会性病原体，肺部感染估计以每年4%的速度增长，并表现出显著的内在抗生素耐药性。除此之外，牛分枝杆菌 (Mycobacterium bovis) 是牛结核病的病原体，每年给全球畜牧业造成重大经济损失（>30亿美元），并构成持续的人畜共患溢出威胁。这些相互交织的挑战突显了对抗致病性分枝杆菌的治疗策略的扩展和多样化的迫切和持续需求。

二十世纪中叶，小分子抗生素（如异烟肼和利福平）的发现将分枝杆菌感染从一种基本上是致命的疾病转变为一种可治愈的疾病。然而，数十年的选择压力推动了多重耐药和广泛耐药 (multidrug-/extensively drug-resistant, MDR/XDR) 分枝杆菌菌株的出现和全球传播，损害了现有疗法的有效性。因此，当前的治疗方案越来越依赖于长期、多种药物联合治疗，这些治疗方案成本高且副作用显著。分枝杆菌抗生素耐受性的核心在于分枝杆菌膜 (mycomembrane) 的独特组成，这是一个富含蜡质分枝菌脂的外层屏障，限制了许多小分子药物的细胞内渗透。因此，人们对非传统的抗分枝杆菌疗法越来越感兴趣，这些疗法能够有效突破这一屏障，通过直接细胞裂解或生化抑制细胞内靶点来消灭分枝杆菌。重要的是，通过损害膜完整性，这些药物可以增强现有抗生素的疗效，可能使原本耐药的菌株重新对标准治疗方案敏感。

在这些新兴方法中，抗分枝杆菌肽 (antimycobacterial peptides, AMyPs) 作为一类表现出强大杀分枝杆菌活性的抗菌肽的专门子集，已成为领先的候选药物。结构多样，这些短（5-50个氨基酸）的两亲性序列通常以线性α-螺旋或大环支架的形式天然存在，并包含蛋白质原性和非蛋白质原性氨基酸。其两亲性使 AMyPs 能够静电结合带负电荷的分枝杆菌膜，导致膜快速去稳定化和/或易位到细胞质中，抑制分枝杆菌生存和毒力所必需的细胞内过程。至关重要的是，这两种机制都设置了高耐药性屏障，因为物理破坏需要细胞包膜的耗能重塑，而针对保守的细胞内过程严重限制了病原体通过突变逃逸的能力。化学序列优化的最新进展，包括对映异构化、环化和末端修饰，已经开始解决 AMyPs 体内翻译所固有的蛋白水解和生物利用度障碍，将此类化合物转变为临床相关的治疗候选物。

本综述调查了过去七年 AMyP 发现和设计的最新进展，特别关注新兴的理性设计方法及其结构引导的治疗优化。从历史上看，AMyP 的发现依赖于两种不同但互补的策略。第一种模仿经典的天然产物发现，涉及筛选来自与分枝杆菌相互作用的生物体（包括宿主、生态竞争者和噬菌体）的多样化生物和化学库。第二种方法，机制引导的理性设计，将必要分枝杆菌途径的知识与高分辨率结构技术的见解相结合，以工程化具有明确靶点的高度有效的从头候选物。虽然强大，但这两种策略都需要大量的时间和资源投入才能产生临床上可行的先导物。最近，人工智能 (artificial intelligence, AI) 驱动的发现已成为这些瓶颈的变革性解决方案，利用机器学习 (machine learning, ML) 模型在计算机中快速预测和优化 AMyP 序列。鉴于近年来基于 ML 的 AMyP 预测工具的快速扩散，本综述批判性地审视了最近的文献，并提供了一个概念框架来指导未来人工智能支持的反分枝杆菌肽发现。

2. 天然 AMyP 发现

天然产物的生物勘探长期以来一直是抗生素发现的基础，产生了当今许多最有效的结核病药物。同样，许多强效的 AMyP 类别也来自不同的环境来源。此外，宿主防御肽 (host defense peptides, HDPs)，即作为针对分枝杆菌病原体的先天免疫反应一部分表达的抗菌肽，已被确定为 AMyP 发现的丰富储存库。事实上，通过广泛的进化压力，大自然在生命的许多领域中产生了庞大且化学多样的 AMyP 库。

2.1. 动物来源

动物，特别是，与分枝杆菌病原体共存并防御了数千年。由此产生的军备竞赛相应地产生了各种各样的强效 AMyPs，范围从宿主防御肽到隐藏肽。以下部分介绍了从动物生物储存库中发现 AMyP 序列的最新更新，并讨论了它们作为临床治疗药物相关的疗效和药理参数。

2.1.1. 宿主防御肽

宿主防御肽在控制分枝杆菌感染中的重要性在整个动物界已得到充分证实。防御素是这类富含半胱氨酸的 HDPs 的一个典型超家族，是先天免疫的基石。在人类中，这些序列主要分为两个主要亚家族，α-防御素和β-防御素，主要通过其二硫键的连接性来区分。突出的代表包括人类中性粒细胞肽 (human Neutrophil Peptides, hNP 1-3) 和人类β-防御素 (human β-Defensins, hBD 1-3)。生物信息学分析揭示了 >30 个 hBD 样序列，尽管只有一小部分经过了实验表征。Rodriguez 等人的一项值得注意的研究评估了 hBD10 和一种从所有已知β-防御素的序列比对设计的共有肽 (hBDconsensus) 对各种病原体（包括 Mtb）的活性。两种肽都表现出强烈的抗分枝杆菌活性，hBDconsensus 的改善性能归因于其更大的阳离子电荷和结构稳定性。推测掺入其他防御素中常见的 N 端α-螺旋可能会进一步增强其效力。

鉴于人类防御素肽的相对较大尺寸（30-40 个残基），最近的工作重点是利用生物信息学预测工具（如 iAMPred 和 CellPPD）识别更短的片段。通过这种策略，从 hBD-1 和 hNP-1 中分别衍生出两个 15 个残基的序列 Pep-B 和 Pep-H。尽管这些截短的肽对强毒 Mtb 的效力降低，但它们比母体序列的促炎性和细胞毒性显著降低。值得注意的是，这两种分子都包含一个保守的 γ-核心基序，由两个由发夹环连接的反平行β-折叠组成，这已被确定为防御素抗菌活性的关键结构决定因素。

cathelicidins 代表了先天免疫防御中另一类主要的 HDPs。这些两亲性α-螺旋序列通过破坏其外膜和招募免疫细胞来消灭病原体，对 Mtb 表现出显著的活性。例如，人类 cathelicidin LL-37 通过维生素 D 依赖性途径诱导自噬来消除细胞内 Mtb。有趣的是，与人类和小鼠（只有一种 cathelicidin 基因 (LL-37) 不同，水牛有七种不同的序列。这种扩展的武器库可能反映了对沼泽和洪泛区栖息地中频繁环境暴露于分枝杆菌的进化适应。因此，水牛 (Bubalus bubalis) 代表了 AMyP 发现的一个有前景的生物储存库。Palacios 等人报告了 WBCATH（B. bubalis cathelicidin 4 的 14 个残基 C 末端片段）的强大体外和体内抗结核活性。后续的计算机模拟表明，该肽的活性是由于其在分枝杆菌膜内自组装成八聚体孔样结构。

具有显著抗分枝杆菌活性的其他富含半胱氨酸的 HDPs 包括 granulysin 及其猪同系物 NK-lysin。这些肽采用 saposin 折叠，由五个两亲性螺旋通过二硫键稳定组成。在适当的生理刺激下，这种结构发生构象重排，暴露出能够疏水性膜接合的内部螺旋-环-螺旋基序。由于全长 saposin 肽较大（~9 kDa），合成成本高，并且与非靶向免疫毒性相关，研究主要集中在螺旋-环-螺旋衍生片段上。两个这样的片段，Gran 1（来自 granulysin）和 NKLF2（来自 NK-lysin），对几种分枝杆菌物种表现出微摩尔抑制活性。尽管效力相似，但这些肽通过不同的作用机制起作用：Gran 1 破坏膜完整性，而 NKLF2 预计会抑制关键的代谢蛋白靶点，如 DNA 旋转酶、阿拉伯糖基转移酶 C (Emb C)、核糖体蛋白 S1 (RPS1) 和酰基载体蛋白 (acyl carrier protein, ACP)。对 NKLF2 变体进行了进一步的计算机优化，以优化抗分枝杆菌效力、药代动力学、免疫原性和靶点结合亲和力，产生了两种改进的候选物 NKLF2-M16C 和 NKLF2-M16I，这些候选物仍有待实验验证。

虽然这些哺乳动物来源的 HDPs 代表了高度进化和协调的免疫系统的成果，但更古老的分类群，如两栖动物和无脊椎动物，它们具有有限或缺乏适应性免疫反应，反而严重依赖先天防御来对抗分枝杆菌病原体。例如，青蛙从其皮肤的特殊腺体中分泌出多种多样的抗菌肽，其中几种被证明具有选择性的抗分枝杆菌活性。Abraham 等人从印度蛙 Clinotarsus curtipes 中分离出 B1CTcu5，一种 brevinin-1 变体，它通过膜破坏选择性地消除 Mtb H37Rv，同时对耻垢分枝杆菌 (Mycolicibacterium smegmatis) 几乎没有活性。构效关系 (structure-activity relationship, SAR) 研究表明，包括 C 端二硫键桥接环（也称为 Rana box）在内的全长序列对于保留杀菌活性至关重要。由于这种结构基序也导致强烈的溶血活性，在临床转化前需要额外的 SAR 研究来进一步优化该序列。

另一种两栖动物来源的抗菌肽 chensinin-1 已从蛙种 Rana chensinensis 中分离出来，并被证明具有杀灭 Mtb H37Ra 的活性。虽然 chensinin-1 的抗分枝杆菌效力相对一般，但其富含色氨酸和精氨酸残基的截短衍生物 W3R6 及其蛋白水解稳定的对映体 D-W3R6 显示出显著增强的活性。在 D-W3R6 上添加短脂肪酰基链（特别是乙酰基和丁酰基）通过增强其分枝杆菌膜通透性进一步提高了其抗分枝杆菌功效。除了膜破坏外，W3R6 及其类似物可易位到细胞内结合分枝杆菌基因组 DNA，提供了一种双重作用机制，大大限制了耐药性发展的可能性。

最后，鲎 (Tachypleus tridentatus)，一种古老的海洋无脊椎动物，装备有专门的免疫细胞，称为血细胞，在感染时从细胞内颗粒中释放抗菌的 tachyplesin 肽。这些序列最近被证明对多种分枝杆菌物种表现出强效的抑制和抗生物膜活性，并通过包括膜去稳定化和抑制对细胞壁完整性重要的生物合成酶的机制起作用。

2.1.2. 毒液衍生肽

大自然对肽的部署不仅限于免疫防御，还包括攻击性捕食策略，其中 HDPs 在进化过程中被用作毒液。因此，在毒液混合物中发现了多种强效抗菌序列，如蜂毒肽 (melittin) 和蝎毒肽 (scorpine)，其中一部分对分枝杆菌有活性。例如，CyLoP-1（胞质定位肽-1）是一种源自南美响尾蛇 (Crotalus durissus) 的序列，对多种分枝杆菌物种具有低微摩尔抑制活性和抗生物膜作用。机理研究表明，CyLoP-1 通过膜去极化和产生活性氧发挥其抗分枝杆菌活性。构效分析进一步揭示，肽内的二硫键形成对其抗分枝杆菌效力和细胞摄取都至关重要。海洋捕食者，特别是锥螺，是毒液相关肽的另一个丰富来源。Conotoxins，如 l1_xm11a（来自 Conasprella ximenes）和 O1_cal29b（来自 Californiconus californicus），在体外测试时表现出低微摩尔的抗分枝杆菌活性，凸显了毒液衍生肽作为 AMyPs 的补充和未充分开发的储存库。

2.1.3. 隐藏肽

与 HDPs 和毒液的组成性活性不同，存在大量具有抗菌活性的序列，这些序列在蛋白质内处于休眠状态，直到被蛋白水解释放。这些序列被称为隐藏肽，在亲本蛋白的酶降解释放出生物活性肽片段之前保持功能沉默，这通常由炎症或组织损伤触发。这种机制允许单个宿主蛋白承担多种生物学角色，同时提供快速、局部可部署的抗菌反应。一个值得注意的例子是人类谷胱甘肽 S-转移酶 (glutathione s-transferase, GST) theta，这是一种通过谷胱甘肽结合负责解毒异生物质的酶，它包含几个隐藏的 AMyP 序列，这些序列在与人类中性粒细胞弹性蛋白酶孵育后被释放。最近，这些螺旋序列被进一步修饰以增强其阳离子和疏水性，极大地改善了它们与富含脂质的分枝杆菌膜的相互作用，并导致抗分枝杆菌功效显著增强。值得注意的是，掺入富含色氨酸的 C 末端进一步增加了效力，强调了芳香族残基在 AMyP 膜相互作用中的重要性。

乳铁蛋白 (Lactoferrin) 是牛奶和其他分泌物中发现的一种螯合铁的糖蛋白，代表了隐藏 AMyPs 的多产来源。其带正电的 N 末端片段，人类乳铁蛋白肽 (human lactoferricin, hLF)，主要通过胃中的部分水解产生，并在新生儿先天免疫中起重要作用。hLF 及其更短的衍生物如 hLF(1-11) 表现出广谱抗菌活性，包括对多种分枝杆菌物种的强效抑制。最近，Intorasoot 等人表明，hLF(1-11) 的合成 d-异构体相对于天然的 L-手性母体，提供了改善的体外稳定性和更有利的溶血谱，同时保持对 Mtb H37Rv 的同等效力。骆驼奶，特别是代表了乳铁蛋白衍生 AMyPs 的丰富来源。在最近的一项研究中，Kanawati 等人利用骆驼奶蛋白的计算机消化来预测几种抑制 Mtb 胸苷酸激酶的抗菌序列，胸苷酸激酶是催化 ATP 依赖性磷酸化以进行核苷酸生物合成的酶。虽然这些推定的序列尚未经过实验验证，但它们代表了潜在的治疗支架，因为 Mtb 缺乏这种关键生物功能的补偿途径，使得酶抑制对病原体是致命的。此外，其与人类类似物的低同源性支持这些理论 AMyP 序列的进一步开发。

血液血清和肺液中也含有隐藏的抗菌肽，有助于抵抗感染。血管生成素 (Angiogenin) 是一种由免疫细胞分泌的 123 个残基的蛋白质，用于促进血管生成，最近被确定为血清衍生的 AMyP，基于其对细胞外 Mtb 的强效抑制活性。额外的计算分析显示，隐藏在血管生成素内的 17 个残基的溶细胞序列是造成这种抑制的原因，该序列被进一步修饰以形成合成的 AMyP Angie1。该序列对 Mtb 和几种 ESKAPE 病原体显示出强效活性，同时被宿主巨噬细胞良好耐受。类似地，Beitzinger 等人通过筛选来自人类支气管肺泡灌洗液的肽库，在体外鉴定了一种隐藏的 AMyP。质谱证实该片段是从 Napsin A 蛋白水解获得的，Napsin A 是一种对呼吸表面活性物质产生重要的天冬氨酸蛋白酶。该序列在计算机中进一步优化以提高其水溶性，产生了 NapFab 肽，该肽在破坏 Mtb 细胞包膜方面表现出更大的功效。虽然对细胞外细菌有效，但由于蛋白水解稳定性差和细胞摄取效率低，Angie1 和 NapFab 对细胞内持久性杆菌的活性有限。因此，两项研究都采用了纳米颗粒递送载体，以有效地将 Angie1 和 NapFab 转运到受感染巨噬细胞的吞噬溶酶体中，以消除驻留的 Mtb 杆菌。

2.2. 细菌和真菌来源

生态拥挤的环境，如土壤和海洋生态系统，寄居着多种细菌和真菌物种，这些物种与环境分枝杆菌不断竞争。这种持续的生态压力催化了结构多样的肽的进化，这些肽旨在抑制和杀死分枝杆菌竞争者。在本节中，我们讨论了从这些环境中发现的最新 AMyPs 的机制和功效，并根据其核糖体依赖性或核糖体独立性的合成起源对其进行区分。

2.2.1. 核糖体肽

细菌素 (bacteriocins) 是核糖体合成的抗菌肽，由细菌产生，可细分为多个结构类别。其中，I 类细菌素，属于核糖体合成和翻译后修饰肽 (Ribosomally synthesized and Post-translationally Modified Peptides, RiPPs) 超家族，近年来已产生了几个令人兴奋的 AMyP 先导物。最初从规范氨基酸合成，RiPPs 经过广泛的翻译后修饰，包括大环化和交联，以采用最终的活性形式。其中，套索肽 (lasso peptides) 具有穿线的套索拓扑结构，赋予其卓越的稳定性，已成为特别有吸引力的支架。Triculamin 是这类肽中新近发现的成员，表现出显著的稳定性和对分枝杆菌的特异性强效抑制活性。对密切相关的肽 lariocidin 的机理研究表明，triculamin 通过抑制细菌核糖体发挥其活性。类似地，羊毛硫抗生素 (lanthipeptides) 以其特有的硫醚交联为特征，代表了另一类突出的 RiPPs。Solabio