足细胞裂隙隔膜：抗肾蛋白酶原抗体的作用靶点

《Current Opinion in Nephrology and Hypertension》：The podocyte slit-diaphragm: target of anti-nephrin antibodies

　　**摘要**

**目的**：本综述的撰写是由于关于足细胞裂隙隔膜组成和结构的新发现，以及在患有获得性肾小球足细胞疾病（包括儿童期类固醇敏感型肾病综合征、微小病变肾病和某些原发性局灶性和节段性肾小球硬化症（FSGS）的患者中检测到抗nephrin抗体）。这些新发现促使我们进行这项研究。

**最新发现**：包括多表位亲和纯化、高分辨率蛋白质组学和冷冻电子断层扫描在内的新技术表明，裂隙隔膜是一种由nephrin和neph1同二聚体以及几种具有信号传导特性的共组装蛋白质构成的多层网状结构。临床研究和实验模型的结果支持这样一个观点：与nephrin的细胞外域结合的致病性抗体会破坏裂隙隔膜的完整性，并向足细胞骨架传递信号，从而导致足突消失和蛋白尿。

**总结**：这些发现提出了几个需要通过实验来解答的问题，例如抗体靶向的nephrin表位、它们如何改变裂隙隔膜和足细胞结构以及如何诱导nephrin的内吞作用。此外，还需要一种可靠且广泛可用的抗nephrin抗体检测方法，这对诊断、预后和治疗具有重要意义。

**通俗语言总结**：最近的研究揭示了足细胞裂隙隔膜这一肾脏功能关键结构的新细节，并在某些肾脏疾病中发现了抗nephrin抗体。先进技术显示，裂隙隔膜是一种复杂的层状结构，涉及nephrin和neph1蛋白。研究表明，针对nephrin的抗体可以破坏这一结构，导致肾脏损伤和蛋白尿。这些发现促使我们进一步研究这些抗体如何影响肾脏结构，并强调了开发可靠抗nephrin抗体检测方法的必要性，这可能有助于改善相关肾脏疾病的诊断和治疗。

**常见问题解答**

**引言**：鉴于最近对获得性足细胞病变患者（特别是儿童期类固醇敏感型肾病综合征、微小病变肾病（MCD）和某些原发性FSGS）中抗nephrin抗体的关注，以及nephrin是足细胞裂隙隔膜（SD）的关键组成部分这一事实，我们认为对SD本身进行综述是及时的。这是因为关于连接相邻足细胞足突之间过滤裂隙的隔膜组成和结构的新信息表明，它不仅仅是一个简单的巨分子渗透屏障。nephrin本身或其相互作用伙伴向足细胞骨架的信号转导可能影响足突的支撑结构，进而对肾小球基底膜（GBM）施加压缩力并维持其选择性通透性[1]。足突的局灶性或弥漫性消失及其支撑力的丧失是蛋白尿性肾小球疾病的普遍形态学特征，这可能是从SD传递的信号的结果。注定成为足细胞的细胞最初在肾小球发育过程中的S形体中出现，作为简单的立方上皮细胞，其细胞质表面具有与zonula occludens-1（ZO-1）相连的顶端紧密连接[2,3]。随着细胞的成熟，紧密连接向基底迁移并最终消失，被跨越相邻足突之间过滤裂隙的SD所取代，SD在SD附着处保留ZO-1[2,3]。

**裂隙隔膜的结构和组成**：自通过透射电子显微镜首次识别出SD以来，其结构和组成就一直是研究的重点。1955年，Yamada将小鼠的SD描述为“一种约30 ?（3 nm）厚的精致丝状膜”[4]。1974年，Rodewald和Karnovsky基于冷冻断裂组织的透射电子显微照片将其描述为连续的拉链状结构[5]。他们确定横桥的尺寸和间距定义了一组直径为70–84 ?（7.0–8.4 nm）的均匀圆柱形通道。这些发现提出了SD作为阻止巨分子从血浆进入尿液空间的最终屏障的概念[6]。Rodewald提出的拉链状模型在发现nephrin是SD的组成部分后得到了验证[7]。实际上，人们认为这种带有孔洞的拉链状结构是由相邻足突中的nephrin分子与其较短的同源物neph1和neph2之间的相互作用形成的，这一模型似乎得到了电子断层扫描的证实[7]。然而，后续研究表明SD比简单的nephrin桥更复杂，包含其他成分，如P-钙粘蛋白（P-cadherin）、FAT1以及锚定蛋白（如podocin和CD2相关蛋白CD2-AP）、信号分子和与肌动蛋白骨架的连接[8]。值得注意的是，早期使用新鲜冷冻未固定组织和深度蚀刻复制方法的研究质疑了拉链状结构是组织固定伪影的可能性[8]。这引出了多表位亲和纯化（meAP）、高分辨率蛋白质组学和冷冻电子断层扫描的时代。最近一项使用针对nephrin、neph1和podocin的抗体的研究明确了构成SD的相互作用蛋白[9]。该研究揭示了一个由三种目标蛋白以及几种已知和未知的跨膜和细胞质SD成分组成的高分子量蛋白质网络，这些成分主要参与信号传导和细胞连接的形成[9]。选择性产后敲除nephrin、neph1和podocin的小鼠实验揭示了白蛋白通透性的动态变化以及对蛋白质相互作用组不同成分的影响[9]。此外，通过在果蝇肾细胞中进行敲低实验，确定了几种新鉴定蛋白质的功能重要性，包括具有酶活性、受体触发信号传导和支架功能的成分[10–12]。这些蛋白质化学研究的临床真实性从已知与遗传性肾病综合征相关的几种相互作用蛋白的鉴定中得到证实，包括dendrin、PTPRO和MAGI2[10–12]，以及酪氨酸激酶Fyn和跨膜受体ROBO2[13,14]。然而，其他一些蛋白质（如CD2-AP和TRPC6离子通道）虽然已知会导致遗传性肾病综合征或与核心SD复合体相互作用（如适配器蛋白NCK1、JAM-A（连接粘附分子A）和ZO-1）[15]，但并未被meAP方法捕获[15]。这表明可能还有其他SD成分尚未被发现。

**裂隙隔膜的结构类似于双层渔网**：与先前描述的拉链状结构不同，最近使用nephrin和neph1敲除小鼠的形态学研究表明，SD是一种灵活的多层蛋白质支架[16]。此外，对小鼠足细胞nephrin和neph1[17??]及其果蝇肾细胞同源物Sns和Kirre[18??]的详细冷冻电子成像研究显示，这些蛋白质的交叉排列类似于SD的渔网结构（图1和2）。计算出的渔网空间横向尺寸约为12.3 nm，与扫描电子显微镜图像中识别的“孔洞”（12.1 nm）相似[19]，但略大于拉链模型中的尺寸（7.0–8.4 nm）[5]。这种渔网状排列被认为为肾小球过滤提供了必要的稳定性和灵活性。此外，在果蝇中沉默Sns（nephrin同源物）的表达会导致渔网图案的异位错位，这可能代表了nephrin缺失的人类先天性肾病中的变化。Birtasu和Moser提出的渔网模型基于nephrin和neph1的含量比从啮齿动物肾小球中提取的其他SD成分高出100多倍，以及它们互补的不同电荷Ig域之间的静电相互作用[17]。然而，仍需确定其他SD成分（如Kocylowski等人[9]发现的成分以及那些缺失会导致遗传性肾病的成分）是如何整合到这种渔网状结构中的。

**裂隙隔膜作为损伤的目标**：如果nephrin是SD的关键组成部分，而SD对于维持肾小球的通透选择性至关重要，那么它是否是遗传性或获得性蛋白尿性肾脏疾病中抗nephrn抗体的靶标？如果是这样，这种作用机制是什么？

**图2**：基于冷冻电子断层扫描（cryo-ET），显示小鼠的裂隙隔膜（SD）是由交叉的nephrin-Neph1异二聚体组成的网络，形成了渔网图案。上层图：根据AlphaFold预测的nephrin（浅色）和neph1（深色）异二聚体的细胞外部分显示为带状和表面模型。两种蛋白质的Ig1域结合形成异二聚体的过程基于C. elegans SYG-2–SYG-1界面的晶体结构进行建模。异二聚体的示意图显示了各个Ig域和跨膜区域（TM）。下层图：九个nephrin-Neph1异二聚体（每种颜色不同以增强对比度）被拟合到断层扫描平均值（以透明阴影显示）。异二聚体之间的间距为12 nm，中间留下约7 × 7 nm2的开放空间。每个异二聚体跨越相邻足细胞的血浆膜之间的距离。通过异二聚体的交叉形成了渔网图案[17??]。

**nephrin基因的发现**：NPHS1基因于1998年在芬兰患有常染色体隐性先天性肾病（CNS）的新生儿中被首次发现[20]。两种NPHS1变异占芬兰病例的90%以上，但在非芬兰家庭中也发现了其他几种变异[21]。大多数变异是每个家庭特有的，包括错义突变、无义突变、剪接位点突变以及小片段缺失和插入[21]。Fin-major是更常见的变异，占芬兰CNS患者的78%，它是外显子2中两个碱基对的移码缺失，导致提前终止密码子，编码的蛋白质只有90个氨基酸。因此，成熟的蛋白质在肾小球中不表达。在最近关于抗nephrn抗体致病潜力的研究中，患有CNS且具有纯合Fin-major基因型的婴儿特别值得关注，尤其是在肾移植后[22,23]。这是因为他们可能会发展成移植后肾病综合征，某些情况下这与抗nephrn抗体有关，可能是由于移植物中新的全长nephrin分子引起的同种抗体[22,23]。在2014年对已发表病例的回顾中，Holmberg和Jalanko得出结论，约30%的Fin-major/Fin-major患者会出现复发，其中70%的患者具有可测量的抗nephrn抗体[24]。此外，血浆置换结合环磷酰胺和抗CD20抗体对这些病例有效[24]。尽管Fin-major突变在芬兰以外较为罕见，但这些观察结果提供了循环抗nephrn抗体可能具有致病性的潜在证据。更直接的证据表明抗nephrn抗体能够引起蛋白尿来自实验研究，其中大鼠被注射了mAb 5–1–6，这是一种与SD的细胞外域结合的小鼠单克隆抗体[25–27]。mAb 5–1–6注射后，大鼠立即出现严重蛋白尿，因为小鼠免疫球蛋白G（IgG）与nephrin结合，随后nephrin部分重新分布到细胞质囊泡中，同时SD中的nephrin免疫反应性下降[25,28]。几天后，随着mAb 5–1–6的清除或降解，足细胞中的nephrin和ZO-1免疫反应性恢复，蛋白尿也随之减轻[25,28]。这些抗nephrin单克隆抗体（anti-nephrin mAb）效应的机制最近由新潟的研究人员通过进一步的研究得以确定[29??]。这些研究揭示了一系列复杂的信号传导过程：当mAb 5–1–6（以下简称anti-nephrin mAb）与nephrin结合时，这些信号从nephrin传递到足细胞。这一过程包括nephrin及其SD配体ephrin-B1的磷酸化[30]，这种磷酸化通过TRPC6介导的Ca2+内流实现，进而导致ephrin-B1从nephrin及其细胞内结合伴侣Par6上解离，而Par6是一种在控制细胞极性中起关键作用的蛋白质[29??]。Par6的释放激活了cdc42，这是一种小型的Rho家族GTP酶，负责调节细胞极性和肌动蛋白细胞骨架的动态。这些事件可能解释了足细胞形态的变化以及屏障功能的改变。有趣的是，cdc42活性的升高还激活了Stat3，从而促使紧密连接分子claudin1的表达，这可能与某些蛋白尿疾病中滤过裂隙恢复为紧密连接的现象相对应[30]。作者还指出，与MCD类似，当大鼠被注射最小肾炎剂量anti-nephrin mAb后5天出现异常蛋白尿时，标准免疫荧光方法无法检测到这种抗体。Zhang等人描述的由anti-nephrin抗体引发的细胞事件与Verma和Jones等人的研究结果不同，因为他们的研究是基于nephrin外域的结合，这种结合激活了Src家族酪氨酸激酶Fyn，导致nephrin和neph1的磷酸化、Nck的募集以及肌动蛋白的聚合。此外，在转基因小鼠中选择性删除Nck会导致足突形成缺陷和蛋白尿[31]。尽管anti-nephrin mAb和nephrin外域结合引发的细胞信号通路有所不同，但它们并不是互相排斥的。nephrin与其SD配体的结合可能对维持肌动蛋白细胞骨架和足细胞结构至关重要，而anti-nephrin则激活了一种更具破坏性的信号级联反应，最终导致足突的消失及其支撑作用的丧失。在用nephrin免疫的小鼠中观察到了类似的结果，这些小鼠出现了抗nephrin相关的足细胞病变[32]。这些小鼠出现了蛋白尿和组织学上的MCD特征。蛋白质组学分析显示nephrin在“参与肌动蛋白组装的位点”发生磷酸化。作者推测这是SD发出的信号，导致足突的消失。因此，来自人类遗传性肾病和实验模型的大量证据表明，anti-nephrin抗体可以通过改变SD和肾小球滤过屏障的完整性来引起足细胞损伤和蛋白尿。在MCD、原发性FSGS和肾移植后复发性FSGS病例中发现的人类抗nephrin自身抗体表明，这种现象并不局限于上述特殊情况，而可能是一种普遍的病理机制，具有潜在的诊断和治疗意义。

**抗nephrin抗体在获得性足细胞病变中的作用**
描述儿童和成人MCD及原发性FSGS中抗nephrin抗体的重要论文已在其他地方进行了总结[34?,35?,36]，但这些论文的初步观察结果与上述讨论相关。在发现循环自身抗体的证据之前，由Helmut Rennke领导的波士顿肾脏病理学团队就已经观察到一部分MCD患者足细胞胞体上存在“细微的IgG点状染色”[33]。超分辨率结构照明显微镜（SR-SIM）显示这些肾活检标本中有两种不同的模式：IgG紧密附着在肾小球基底膜（GBM）上，呈细小的点状或曲线状分布（可能追踪实际的滤过裂隙隔膜）；或者位于更靠顶部的点状或囊泡状簇[33]。这些结构几乎完美地与nephrin共定位，但与其他三种足细胞蛋白不共定位。基于所有数据，作者推测这些点状结构代表了anti-nephrin的原位结合，这种结合可能破坏SD的完整性并导致nephrin及其结合的自身抗体的重新分布。这种重新分布可能是由于文献中描述的nephrin内吞作用，或是最近发现的自身免疫球蛋白诱发的细胞外囊泡形成过程[37?]，因为这些颗粒存在于MCD患者的尿液中，并含有nephrin和IgG。另一个相关点是，这些MCD病例中GBM和足细胞染色中的IgG主要是IgG1和IgG2（双价抗体），而不是其他非炎症性自身抗体相关疾病（如膜性肾病）中常见的IgG4（单价抗体）[33]。如果假设这种IgG确实是抗nephrin抗体，那么这一发现表明单个自身抗体可以连接两个nephrin分子，可能引发信号传导事件。在大鼠模型中，需要注射双价anti-nephrin mAb才能以非补体依赖的方式诱导蛋白尿，因为单臂Fab无法引发蛋白尿[38]。目前尚未在研究环境中标准化检测循环抗nephrin的方法，也未可用于临床应用。通常用于检测其他人类自身抗体的方法（如患者血清的免疫印迹、标准ELISA或基于细胞的技术）均未成功[39]。相反，Hengel等人使用一种改进的检测方法，在MCD患者（尤其是未经免疫抑制治疗的患者）以及9%的原发性FSGS病例中实现了高灵敏度的抗nephrin检测[32]。该方法首先使用患者血清免疫沉淀重组人nephrin，然后通过ELISA定量标记的nephrin分子。目前尚不清楚是否需要这些改进技术是因为抗nephrin的滴度低、paratope-epitope相互作用的亲和力弱，还是由于其他非传统的nephrin-IgG结合机制。其他因素，如用于生产重组nephrin的细胞系类型（人类与小鼠），也可能很重要，因为非人类物种引入的特定糖链修饰可能导致天然存在的抗糖链人类抗体的非特异性结合[39,40]。虽然anti-nephrin抗体可能是MCD和原发性FSGS中主要的抗滤过裂隙隔膜抗体，但也有证据表明存在针对Kirrel1（neph1）和podocin[41]以及neph3[40]的抗体，有时这些抗体与anti-nephrin抗体共同作用。由于这些分子也与SD中的nephrin相互作用，针对它们的自身抗体可能会与anti-nephrin抗体协同作用，导致快速发作的蛋白尿或单独引起类似反应。然而，在正常状态下，podocin并不具有能与循环抗体反应的细胞外表位，但其一个基因变异体（P118L）的C端会延伸到细胞外空间，因此在某些情况下这些抗体可能具有生物学效应。有人认为，在临床活跃期出现抗nephrin抗体可能只是足细胞损伤的附带现象，并非真正的原因。有人指出，抗nephrin抗体的出现与蛋白尿之间缺乏明确的时间顺序（抗nephrin先于蛋白尿），并且病情的快速缓解（无论是临床还是免疫学上的）都违背了IgG的正常半衰期，尤其是在选择性蛋白尿消退的情况下[42]。通常情况下，其他自身抗体（如抗PLA2R抗体）会在几周到几个月内逐渐减少并消失。但在MN中，临床蛋白尿出现之前需要免疫复合物的逐渐积累和补体的激活，但从生物学角度来看，低水平的抗nephrin抗体可能通过直接作用于nephrin和SD迅速引发蛋白尿，从而使得抗体和蛋白尿之间的关联更为直接。已有研究表明，将含有抗nephrin的肾移植片移植给患者后，可在移植后一小时就观察到组织学变化，包括IgG和nephrin的点状共定位以及nephrin的磷酸化变化[43]。将疾病被动转移给实验动物是验证自身抗体致病性的金标准。唯一已发表的人类抗nephrin被动转移模型是将一位71岁MCD患者的血浆置换液中的总IgG注射给兔子[44??]。与接受对照IgG处理的兔子相比，实验组兔子在注射后3天出现微量蛋白尿，并在5天时达到最大值。电子显微镜（EM）显示5天时足突部分消失，GBM上出现不连续的点状IgG染色，偶尔伴有细胞质内的点状染色。从5天肾小球中洗脱出的IgG可以检测到兔子自身的nephrin。虽然这些结果具有提示性，但并不能排除其他抗滤过裂隙抗体（可能是抗podocin或抗neph3抗体）的存在，同时也没有进行抗nephrin在IgG中的亲和力耗竭实验。抗nephrin含IgG的延迟效应（5天后）以及为什么在5天时所有可见的GBM上仍存在明显的染色，可能反映了这些抗体对兔子nephrin的不同作用。

**结论**
如何将MCD和原发性FSGS中抗nephrin抗体的存在与快速发作的蛋白尿以及新提出的SD网状结构联系起来？研究表明，nephrin与neph1之间的多个相互作用点允许个别分子被移除（可能是通过内吞作用），而不影响SD的整体完整性[17??]。然而，正如anti-nephrin mAb在大鼠中的研究所示[29??]（及其中的参考文献），即使仅针对较大结构中的少数分子，低水平的循环抗nephrin也足以破坏分子间的相互作用，通过其双价性质使分子交联并触发内吞作用或信号传导，从而导致SD结构的协同崩溃。有证据表明人类抗nephrn抗体靶向nephrin的第一个Ig结构域[41]，从而可能破坏连接滤过裂隙两侧的nephrin-Neph1节点。许多有趣的问题仍需通过实验来解答：抗nephrn抗体究竟针对哪些表位？我们能否通过亲和纯化或克隆人类抗nephrn抗体来更好地确定结合位点，在体外验证其破坏nephrin同源或异源二聚体的能力，并在模型系统中诱导nephrin信号传导和内吞作用？除了这些定义MCD和原发性FSGS病理机制的机遇外，该领域迫切需要一种优化的检测系统，以便临床检测抗nephrn抗体，这对诊断、预后、治疗选择以及肾移植和复发疾病的决策具有重要意义。

**致谢**
无。
**财务支持和赞助**
D.J.S. – 无相关资助来源。
L.H.B. – 无相关资助来源。
**利益冲突**
无利益冲突。