红皮马铃薯对Globodera pallida病原型Pa2/3的抗性表型评估

《American Journal of Potato Research》：Phenotypic Evaluation of Resistance to Globodera pallida Pathotype Pa2/3 in Russet-Skinned Potato

　　摘要
Globodera pallida是一种检疫性马铃薯胞囊线虫（PCN），对爱达荷州的马铃薯产业造成了重大经济影响。由于主要的红皮马铃薯市场品种缺乏对G. pallida的抵抗力，且尚未发现单一的主要抗性基因，因此培育具有抗性的商业品种一直颇具挑战性。本研究在由抗PCN的‘Eden’和易感PCN的‘Western Russet’衍生出的四倍体红皮马铃薯群体中，表征了对爱达荷州G. pallida Pa2/3病原型的表型抗性。三年间共培育了227代后代，每年评估不同子群体，并与四个品种对照及四个PCN差异克隆进行对比。在温室条件下进行表型评估，以检测与胞囊和卵发育相关的特征。结果显示，表现出与‘Eden’相似抗性的后代比例分别为13.7%、23.4%和18.1%（分别基于胞囊数量、卵/胞囊比例及卵/克隆比例）。通过这种表型评估识别出具有抗性的后代，这些个体可能携带有利的等位基因，为育种计划和研究提供了宝贵的遗传资源。

引言
马铃薯胞囊线虫（PCN），包括Globodera pallida和Globodera rostochiensis，是全球重要的受监管马铃薯害虫。Globodera pallida（淡色胞囊线虫）和Globodera rostochiensis（金色线虫）分布于世界大多数马铃薯种植区（Brodie和Mai 1989；Chandel等人2020；Marshall 1993；Mburu等人2020；Minnis等人2002；Narabu等人2016；Silvestre等人2021；Sun等人2007）。马铃薯（Solanum tuberosum）在全球粮食系统中扮演着关键角色，对粮食安全具有重要贡献（Devaux等人2020）。在严重感染PCN的田地里，马铃薯产量可能损失高达80%（Brodie和Mai 1989；Moens等人2018；Contina等人2019）。作为主要的马铃薯生产和消费国，美国（FAOSTAT，2021）正面临纽约地区的G. rostochiensis侵染和爱达荷州的G. pallida侵染问题。尽管PCN在美国并未广泛分布，但仍受到美国农业部动植物卫生检验局（USDA-APHIS）及各州相关机构的监管（Dandurand等人2019）。自2006年在爱达荷州发现G. pallida以来（Hafez等人2007），USDA-APHIS实施了植物检疫法规以控制和根除该线虫，保护美国马铃薯产业。鉴于PCN对美国马铃薯生产构成严重威胁，寻找有效的根除方法至关重要。在爱达荷州，马铃薯生产主要集中在加工用途，尤其是适合制作薯条的长形红皮马铃薯。这类品种在美国西部占主导地位（Whitworth等人2018），但缺乏对G. pallida的抗性，这给控制这种线虫带来了巨大挑战。因此，培育具有强抗性的马铃薯品种是美国马铃薯产业的当务之急。从易感红皮品种与不同市场类别的抗PCN品种杂交中选择具有抗性的后代具有挑战性，因为需要多个基因共同作用才能形成抗性。与通过抗性品种有效控制G. rostochiensis的情况不同（Kreike等人1996；Rouppe van der Voort等人1998），目前尚缺乏对G. pallida病原型具有稳定抗性的品种。因此，培育持久抗性的马铃薯品种仍是育种者的关键研究课题。

具有PCN抗性的马铃薯品种已引入了来自Solanum vernei（Gpa1和Gpa5）、S. tuberosum spp. andigena（H1和Gpa2）以及S. spegazzinii（Gpa）等物种的抗性基因。这些基因提供针对特定病原型的抗性，并在细胞或分子层面发挥作用（Sudha等人2019；Gartner等人2021）。虽然H1基因对G. rostochiensis有效，通常会引发细胞过度反应导致寄生线虫周围细胞快速死亡并阻止取食部位形成（Bakker等人2004），但Gpa基因介导的对G. pallida的抗性往往更为复杂，可能是多种抗性基因共同作用的结果（Rouppe van der Voort等人1998）。这些基因可能影响寄生线虫与马铃薯根系相互作用的多个阶段，如破坏胞间连丝或改变宿主细胞反应。通常需要多个此类基因的协同作用才能形成强抗性（Sudha等人2019；Gartner等人2021）。全球马铃薯种植区最常见的G. pallida病原型是Pa2/3（Chandel等人2020；Dandurand等人2019；Marshall 1993；Mwangi等人2021；Mburu等人2020；Minnis等人2002；Narabu等人2016；Silvestre等人2021）。在美国，形态学和分子方法已确认存在G. pallida Pa2/3病原型（Skantar等人2007）。目前尚无单一抗性基因能够完全抵抗美国的G. pallida Pa2/3种群（Dalton等人2013）。

‘Eden’（Solanum tuberosum）是一种中晚熟品种，由苏格兰作物研究所（SCRI）开发并于1992年发布（ECPD，2011）。‘Eden’结出长形至椭圆形的块茎，表皮呈白色至黄色。它对G. rostochiensis Ro1具有高抗性，对G. pallida Pa1和Pa2具有中等到高抗性。其主要优点包括高干物质含量、淡黄色煎炸色泽和粉质烹饪口感（ECPD，2011）。为了培育抗G. pallida Pa2/3病原型的红皮马铃薯，首先将抗PCN的‘Eden’与易感PCN的‘Western Russet’进行杂交。‘Eden’携带GpaIVSadg抗性位点（Asano等人2021），使其成为向红皮马铃薯种质中引入抗性的理想来源。由此产生的四倍体马铃薯群体后代在块茎形状和大小上存在差异，部分克隆产生了理想的长形块茎和红皮。本研究通过分析抗G. pallida Pa2/3病原型的四倍体后代的相关表型特征，旨在确定影响PCN抗性的关键因素，为培育抗G. pallida的红皮马铃薯品种提供依据。

材料与方法
**植物材料**
A10915四倍体马铃薯群体是由USDA-ARS育种家R. Novy在爱达荷州阿伯丁开发的，该品种为来自苏格兰的椭圆形块茎品种‘Eden’（抗G. pallida Pa2/3和G. rostochiensis Ro1/Ro4）与易感PCN的‘Western Russet’（抗G. pallida Pa2/3和G. rostochiensis）杂交而成（Dandurand等人2019）。这些克隆同时具备对G. pallida和G. rostochiensis以及Globera ellingtonae的抗性（Dandurand等人2019）。

**种子培养**
在无菌条件下，将马铃薯种子在20–22°C、16小时光照周期下进行组织培养，培育出幼苗。这些组织培养苗被用于APHIS认可的PCN研究设施（爱达荷州莫斯科市）进行生物测定筛选。部分幼苗被送往USDA-ARS位于阿伯丁的设施进行温室迷你块茎生产，以支持田间农艺选择。在245个马铃薯克隆中，有18个未被纳入实验。总共分析了227个马铃薯克隆。

**对照品种**
在G. pallida生物测定中使用了四个马铃薯品种和四个具有不同抗性水平的PCN差异克隆作为对照。易感PCN的对照品种为‘Russet Burbank’、‘Desiree’和‘Western Russet’，抗PCN的对照品种为‘Eden’。选择‘Russet Burbank’作为对照是因为它在太平洋西北地区广泛种植；而用于对照的PCN差异克隆为‘P55/7’、‘D47/11’、‘65.346/19’和‘62.33.3’（Whitworth等人2018）。

**G. pallida接种剂制备**
本研究使用的G. pallida接种剂为爱达荷州Shelley地区感染的Pa2/3病原型菌株（Hafez等人2007）。在APHIS认可的PCN研究设施中，该菌株在18±2°C、16:8光照周期的温室条件下于易感马铃薯品种‘Desiree’上培养。16周后，使用洗脱法从土壤中提取胞囊，干燥后储存于4°C以待使用（Dandurand等人2017；Hickman和Dandurand 2023；USDA-APHIS 2009）。

**抗性评估**
A10915四倍体马铃薯群体的表型评估由爱达荷州莫斯科大学的Dandurand马铃薯胞囊线虫项目团队完成，评估了与胞囊和卵发育相关的表型特征。评估工作分别于2015年、2016年和2018年进行，每年评估不同子群体，2015年、2016年和2018年分别评估了77、97和53个A10915克隆，采用随机完全区组设计（RCBD）。对照组包括四个马铃薯品种和四个差异克隆。2016年和2018年每个子群体使用10次重复，2015年使用6次重复。需要注意的是，2015年每个后代的每个胞囊数据仅进行了一次重复测量，这是对该特定特征的初步评估，以便为后续样本提供参考。

**培养条件**
组织培养苗种植在直径10厘米的赤陶陶土盆中，盆内填充约500克灭菌后的2:1沙壤土/沙子混合物。土壤在使用前在121°C下高压灭菌90分钟。植株在18±2°C、60%相对湿度和16:8光照周期的温室条件下生长，每天浇水保持湿度均匀。种植时施用Osmocote缓释肥料（The Scotts公司，俄亥俄州玛丽斯维尔），每周施用Jack’s Classic 20-20-20复合氮磷钾水溶性肥料（JR Peters INC., 宾夕法尼亚州阿伦镇）。

**接种过程**
接种前，将胞囊用0.3%次氯酸钠消毒5分钟，然后用无菌去离子水冲洗五次。胞囊放入6平方厘米的无菌尼龙网袋（McMAster Carr，伊利诺伊州埃尔姆赫斯特）中，网孔大小为250微米，边缘用手工封口机密封，以便第二阶段幼虫（J2）通过网孔迁移，同时保留胞囊便于计数（Dandurand等人2019；Dandurand和Knudsen 2016；Hickman和Dandurand 2023）。每个盆的接种密度约为每克土壤5个胞囊，即每个袋265个胞囊。胞囊袋放置在移植植物的根区。接种16周后，将植株从土壤表面切断，小心取出土壤和根系样本，丢弃胞囊袋，样品干燥两周后使用胞囊提取器提取胞囊（USDA-APHIS 2009）。提取的胞囊用丙酮漂洗以去除杂质（Brodie等人1976）。提取的胞囊用解剖显微镜（Leica M80，Leica Microsystems，德国韦茨拉尔）进行计数。在96孔板（VWR?组织培养板，Radnor，PA）中，将每个培养孔中的5个囊肿置于100微升无菌去离子水中压碎，并在显微镜下（Leica DMi1，Leica Microsystems，Wetzlar，德国）计数卵（Dandurand和Knudsen 2016；Hickman和Dandurand 2023）。实验结束时，计算了八个表型特征的数据：每株植物的囊肿数量、每株植物每个囊肿的卵数量（卵/囊肿）、每个克隆的卵数量（卵/克隆）、囊肿的繁殖因子（Rf囊肿）、每个克隆的卵的繁殖因子（Rf卵/克隆）、囊肿的相对敏感性（RS-%囊肿）、每个囊肿的卵的相对敏感性（RS-%卵/囊肿）以及每个克隆的卵的相对敏感性（RS-%卵/克隆）。Rf值表示线虫在特定环境中繁殖和增加种群大小的能力。为了获得Rf值，使用以下公式将最终的线虫种群密度（Pf）除以初始种群密度（Pi）：Rf = Pf/Pi。对于囊肿数量和每个克隆的卵数量特征，也计算了Rf值（EPPO 2006）。抗性还使用相对敏感性评分（RS评分）进行评估，这是欧盟引入的一种标准化抗性评分的方法（EPPO 2006）。每个马铃薯克隆的囊肿密度都标准化为‘Russet Burbank’的囊肿密度，以获得相对于这种易感品种的敏感性值。在这项研究中，EPPO（2006）系统被修改为三个类别：1至3表示易感，4至6表示部分抗性，7至9表示抗性。相对敏感性（RS-%）是使用囊肿数量、每个囊肿的卵数量和每个克隆的卵数量计算的。用于获得RS-%的公式是：RS-% = (测试样本的Pf / 易感标准品种的Pf) × 100%（EPPO 2006）。所有特征都在每个克隆上进行了多次重复测量，并计算了这些特征的平均值以用于统计分析。需要注意的是，本研究中使用的每个囊肿的卵的相对敏感性这一术语与雌性寄生虫的繁殖力密切相关。繁殖力指的是雌性线虫的繁殖潜力。

在统计分析之前，原始表型数据经过清理处理，以去除缺失值并确保数据质量。初步的统计测试显示，原始表型特征（囊肿、卵/囊肿和卵/克隆）的分布呈右偏态，不符合正态分布。为了重新满足线性混合效应模型中准确估计方差成分和假设检验所需的正态性和残差同方差性假设，所有特征的数据都进行了对数转换。这些转换有效地使分布接近正态分布并且更加对称，减少了异常值的影响。然后使用对数转换后的表型数据进行后续分析。为了探索A10915马铃薯种群中抗性特征之间的关系，进行了成对线性回归分析。这种分析有助于可视化和量化这些特征之间的线性关联。为了评估A10915四倍体马铃薯种群在三年内的表型表现并估计可归因于遗传因素的方差成分，对每个评估的特征使用了线性混合效应模型（LMM）。所拟合的模型为：
$$y_{ijk}=\mu\;+\;individual_i\;+\;experiment_j\;+\;experiment_rrep_{jk}+\;error_{ijk}$$
在上述方程（1）中，yijk是实验j和重复k中基因型i的对数转换后的表型值，μ是该特征的总体平均值，individual_i是基因型I的随机遗传效应，experimentj是代表每年具体效应的实验j的固定效应，experimentjk是与基因型i的重复k相关的随机效应，取决于特征，errorijk是实验j和重复k中基因型i的残差误差。LMM（方程1）使用R包“lme4qtl v.0.2.2”（Ziyatdinov等人2018）进行拟合，该包扩展了“lme4 v.1.1–33”（Bates等人2015）的功能，包括用于建模随机遗传效应的亲缘关系矩阵。拟合模型后，通过视觉检查标准诊断图来检验残差的正态性和方差的同方差性假设。为了确定最佳拟合模型，使用对数似然比测试和赤池信息量准则（AIC）比较了简化模型和完整模型。从拟合的LMM（方程1）中获得了每个特征的个体、实验内的重复和残差误差的方差成分。

为了确定每个表型特征的广义遗传力（H2），以确定可归因于遗传因素的表型方差的比例或总量。广义遗传力反映了所有遗传贡献，包括加性、显性和上位效应，这些效应通过这种建模方法中的基因组关系矩阵捕获（Schmidt等人2019）。它是通过估计的遗传方差（σg2）与总表型方差（σp2）的比率来计算的：
$$\:{H}^{2}=\frac{{\sigma\:}_{g}^{2}}{{\sigma\:}_{p}^{2}}$$
在上述方程（2）中，σg2是遗传方差，σp2是表型方差。这些方差成分是直接使用“lme4 v.1.1–33”（Bates等人2015）从LMM中估计得出的。此外，还计算了对数转换后的表型特征之间的成对皮尔逊相关系数，以评估它们之间的线性关联程度和方向。统计分析使用R（版本4.2.0；R统计计算基金会）进行，图表使用ggplot2包（Wickham 2016）生成。XLSTAT软件（版本2021.3.1；Addinsoft）用于生成囊肿分布的平均值。

**G. pallida在对照马铃薯品种和差异克隆上的繁殖**
在一系列对照马铃薯品种和对G. pallida有已知反应的差异克隆上评估了G. pallida病原型Pa2/3的繁殖情况，以验证实验并表征它们的抗性反应。在抗性和易感马铃薯品种之间观察到了G. pallida囊肿和卵产量的显著差异。在三次实验中，易感对照品种（‘Desiree’、‘Russet Burbank’和‘Western Russet’）表现出较高的平均囊肿数量（范围从186到210个）（表1A）、较高的平均卵/囊肿数量（范围从101到146个）（表1B）和较高的平均卵/克隆数量（范围从18,100到21,900个）。相比之下，抗性品种‘Eden’和抗性差异克隆‘62.33.3’和‘D47/11’的繁殖量显著较低，平均囊肿数量在11.2到23.4个之间（表1A），平均卵/囊肿数量在78.8到112.6个之间（表1B），平均卵/克隆数量在1,163到3,069个之间。在单个易感植株上观察到的最大繁殖量是‘Desiree’品种的588个囊肿、500个卵/囊肿和237,610个卵/克隆。

**A10915四倍体马铃薯种群中的抗性特征**
使用线性混合效应模型（LMM）对A10915四倍体马铃薯种群中的八个评估特征进行了分析，以评估表型表现并估计可归因于遗传因素的方差成分。拟合的模型为：
$$y_{ijk}=\mu\;+\;individual_i\;+\;experiment_j\;+\;experiment_rrep_{jk}+\;error_{ijk}$$
在上述方程（1）中，yijk是基因型i在实验j和重复k中的观察到的对数转换后的表型值，μ是该特征的总体平均值，individual_i是基因型I的随机遗传效应，experimentj是代表每年具体效应的实验j的固定效应，experimentjk是与基因型i的重复k相关的随机效应，取决于特征，errorijk是基因型i在实验j和重复k中的残差误差。LMM（方程1）使用R包“lme4qtl v.0.2.2”（Ziyatdinov等人2018）进行拟合，该包扩展了“lme4 v.1.1–33”（Bates等人2015）的功能，包括用于建模随机遗传效应的亲缘关系矩阵。拟合模型后，通过视觉检查标准诊断图来检验残差的正态性和方差的同方差性假设。为了确定最佳拟合模型，使用对数似然比测试和赤池信息量准则（AIC）比较了简化模型和完整模型。从拟合的LMM（方程1）中获得了每个特征的个体、实验内的重复和残差误差的方差成分。

**广义遗传力（H2）的估计**
为了确定可归因于遗传因素的表型方差的比例或总量，估计了每个表型特征的广义遗传力（H2）。广义遗传力反映了所有遗传贡献，包括加性、显性和上位效应，这些效应通过这种建模方法中的基因组关系矩阵捕获（Schmidt等人2019）。它是通过估计的遗传方差（σg2）与总表型方差（σp2）的比率来计算的：
$$\:{H}^{2}=\frac{{\sigma\:}_{g}^{2}}{{\sigma\:}_{p}^{2}}$$
在上述方程（2）中，σg2是遗传方差，σp2是表型方差。这些方差成分是直接使用“lme4 v.1.1–33”（Bates等人2015）从LMM中估计得出的。此外，还计算了对数转换后的表型特征之间的成对皮尔逊相关系数，以评估它们之间的线性关联程度和方向。统计分析使用R（版本4.2.0；R统计计算基金会）进行，图表使用ggplot2包（Wickham 2016）生成。

**G. pallida在对照马铃薯品种和差异克隆上的繁殖**
在一系列对照马铃薯品种和对G. pallida有已知反应的差异克隆上评估了G. pallida病原型Pa2/3的繁殖情况，以验证实验并表征它们的抗性反应。在抗性和易感马铃薯品种之间观察到了G. pallida囊肿和卵产量的显著差异。在三次实验中，易感对照品种（‘Desiree’、‘Russet Burbank’和‘Western Russet’）表现出较高的平均囊肿数量（范围从186到210个）（表1A）、较高的平均卵/囊肿数量（范围从101到146个）（表1B）和较高的平均卵/克隆数量（范围从18,100到21,900个）。相比之下，抗性品种‘Eden’和抗性差异克隆‘62.33.3’和‘D47/11’的繁殖量显著较低，平均囊肿数量在11.2到23.4个之间（表1A），平均卵/囊肿数量在78.8到112.6个之间（表1B），平均卵/克隆数量在1,163到3,069个之间。在单个易感植株上观察到的最大繁殖量是‘Desiree’品种的588个囊肿、500个卵/囊肿和237,610个卵/克隆。

**抗性水平**
繁殖因子（Rf）作为最终卵种群与初始卵种群的比例，清楚地区分了易感和抗性品种。易感品种‘Western Russet’、‘Russet Burbank’和‘Desiree’的Rf值显著较高（平均Rf：20.9–22.9）和卵/克隆（平均Rf：26.7–33.0），表明线虫繁殖显著。抗性品种‘Eden’和差异克隆‘D47/11’和‘62.33.3’的Rf值较低（平均Rf：囊肿为1.9–2.5，卵/克隆为0.6–1.6），显示出抗性和最小的线虫繁殖。中等抗性差异克隆‘65.346/19’和‘P55/7’的囊肿平均Rf值分别为8.9和5.9，卵/克隆的Rf值分别为6.4和7.1。根据相对敏感性（RS-%）值（以易感对照的百分比表示），如预期，马铃薯品种和差异克隆对G. pallida病原型Pa2/3的反应存在差异。抗性品种‘Eden’和差异克隆‘D47/11’和‘62.33.3’的RS-%值较低（平均：囊肿为5.6–11.5%，卵/囊肿为33.2–47.4%，卵/克隆为2.2–5.9%），而易感品种‘Western Russet’、‘Russet Burbank’和‘Desiree’的RS-%值较高。易感对照的RS-%平均值分别为囊肿91.8%到103.7%，卵/囊肿101.6%到104.6%，卵/克隆100.0%到114.7%。中等抗性差异克隆‘65.346/19’和‘P55/7’的RS-%值为中间水平，囊肿平均值为27.6%到47.3%，卵/囊肿为69.7%到83.1%，卵/克隆为24.8%到25.5%（表2）。如前所述，卵/囊肿的RS-%与雌性的繁殖力密切相关。易感品种‘Russet Burbank’的平均囊肿数量（203.0）高于‘Desiree’（186.4），且‘Russet Burbank’的标准差为75.5，而‘Desiree’的标准差为126.4。因此，‘Russet Burbank’被用作标准易感品种对照，从其恢复的囊肿平均值用于计算RS-%。Blok和Phillips（2012）也报告称，Idaho G. pallida种群在‘Russet Burbank’上的繁殖量高于‘Desiree’，基于囊肿数量。然而，并非所有表型实验都一致（L.M. Dandurand，个人交流）。

**基于RS评分的抗性分类**
基于RS评分（1–9等级）对囊肿、卵/囊肿和卵/克隆进行了分析，以分类马铃薯对照的抗性水平。根据标准的1–9抗性等级，其中较高的评分表示更高的抗性，易感品种（‘Western Russet’、‘Russet Burbank’和‘Desiree’）的RS评分始终最低（1–2等级，表示高敏感性），而抗性克隆（‘Eden’和差异克隆‘D47/11’和‘62.33.3’）的评分最高（6–8等级，表示抗性）。差异克隆‘P55/7’和‘65.346/19’在所有三个特征上表现出中等RS评分。

**A10915四倍体马铃薯种群中的抗性**
A10915四倍体马铃薯种群在对抗G. pallida病原型Pa2/3的抗性方面表现出显著的表型变异。繁殖分析显示，部分后代的抗性水平与抗性亲本‘Eden’相当或超过‘Eden’。大约13.7%（31个后代）的种群具有等于或优于抗性亲本‘Eden’的值。对于卵/囊肿和卵/克隆特征也观察到了类似的趋势。值得注意的是，A10915种群的23.4%（53个后代）和18.1%（41个后代）的卵/囊肿和卵/克隆的平均值分别低于‘Eden’。繁殖因子（Rf）和相对敏感性（RS-%）进一步表征了种群内的反应范围。A10915后代的囊肿和卵/克隆的Rf值有广泛的变化。30个后代（13.2%）的Rf囊肿值低于抗性品种‘Eden’（Rf囊肿为1.8）。37个后代（16.3%）的卵/克隆平均值与‘Eden’的Rf卵/克隆值相似。相对敏感性（RS-%）也在A10915种群的所有三个特征（囊肿、卵/囊肿和卵/克隆）中显示出变化。总体平均值为31.2%（RS-%囊肿）、75.6%（RS-%卵/囊肿）和28.9%（RS-%卵/克隆）。在总种群中，30个后代（13.2%）、53个后代（23.4%）和41个后代（18.1%）在囊肿、卵/囊肿和卵/克隆方面的RS-%低于抗性品种‘Eden’。

**A10915种群对抗G. pallida病原型Pa2/3的抗性水平**
当后代的RS评分在7到9之间时，A10915种群的抗性水平被归类为高；当后代的RS评分在4到6之间时，抗性被归类为部分抗性；当后代的RS评分在1到3之间时，抗性被归类为易感（表3）。在总A10915种群中，8个后代（A10915-10、A10915-18、A10915-97、A10915-98、A10915-102、A10915-110和A10915-111）被归类为抗性（RS评分从7到9），117个后代被归类为部分抗性（RS评分从4到6），102个后代被归类为易感（RS评分从1到3）（基于囊肿的RS评分，图1）。三个后代（A10915-97、A10915-98和A10915-110）的囊肿RS-%评分为8，而没有后代获得9的囊肿RS-%评分。使用RS-score对卵/囊肿进行评估后，发现有3个后代表现出抗性（A10915-84、A10915-94和A10915-103），38个后代表现出部分抗性，186个后代表现出易感性。其中一个后代（A10915-84）的RS-%卵/囊肿得分为9。另外，在使用RS-score对卵/克隆进行评估时，有61个后代表现出抗性，80个后代表现出部分抗性，86个后代表现出易感性。有16个后代（A10915-23、A10915-26、A10915-27、A10915-35、A10915-75、A10915-84、A10915-84、A10915-95、A10915-97、A10915-98、A10915-100、A10915-102、A10915-103、A10915-105、A10915-110、A10915-111）的RS-%卵/克隆得分为9。表3显示了A10915群体中根据抗性水平分类的后代数量。图1展示了A10915后代按相对易感性得分（RS-score）分组的平均囊肿分布情况：RS-score为7至9（抗性），4至6（部分抗性），1至3（易感性）。

A10915四倍体马铃薯群体的广义遗传力（H2）是通过线性混合效应模型（Linear Mixed-Effect Model）估算的，该方法在统计分析部分有详细描述（公式1）。该分析将总表型方差分解为可归因于遗传因素和环境因素的部分。广义遗传力估计值表明，遗传因素对线虫繁殖的观察到的变异有显著影响：平均囊肿的遗传力为0.55，平均卵/囊肿的遗传力为0.56，平均卵/克隆的遗传力为0.38。广义遗传力（H2）代表了总表型方差（σp2）中可归因于遗传方差（σg2）的比例。表4显示了通过LMM拟合得到的每种性状的方差组成部分。遗传方差成分反映了A10915群体中个体的总遗传变异。遗传力估计表明，在A10915后代中，平均囊肿的55%、平均卵/囊肿的56%以及平均卵/克隆的38%的变异是由遗传差异引起的。平均囊肿和平均卵/囊肿的相对中等至较高的遗传力估计值表明，在A10915群体中对这些性状进行选择应该能够在提高抗性方面取得显著进展。而平均卵/克隆的较低遗传力表明，与其他两种性状相比，这一性状受环境因素的影响更大。

为了理解表型性状（囊肿、卵/囊肿和卵/克隆）之间的关系，对A10915马铃薯群体的对数转换数据进行了皮尔逊相关性分析和线性回归分析。分析显示，囊肿与卵/囊肿之间存在中等程度的正相关（r=0.5，P<0.001）。卵/囊肿与囊肿的线性回归表明，大约30%的卵/囊肿变异（r2=0.3）可以通过囊肿发育的变异来解释。回归模型具有统计学意义（P<0.001），表明这两种线虫繁殖成分之间存在中等且线性的关系。另一方面，卵/克隆与囊肿之间也存在强烈的正相关（r=0.9，P<0.001）。以总卵/克隆为因变量、囊肿性状为自变量的线性回归分析表明，大约70%的卵/克隆变异（r2=0.7）可以通过囊肿发育的变异来解释。回归模型的统计显著性（截距和斜率系数的P<0.001）证实了这种强线性关系。总体而言，这些分析表明A10915马铃薯群体中G. pallida繁殖性状之间存在统计学上显著的正相关。这种强相关性突显了这两种性状与马铃薯宿主体内G. pallida发育之间的密切关联，并表明尽管卵/克隆包括囊肿和卵/囊肿的值，但在该群体中它更受囊肿的影响。

马铃薯囊线虫（PCN），即G. pallida和G. rostochiensis的管理对于可持续的马铃薯生产至关重要，特别是在像爱达荷州这样的地区，G. pallida对主要的红皮马铃薯产业构成了重大威胁（Dandurand等人，2019年）。由于熏蒸剂和非熏蒸剂杀线虫剂的效力有限且存在环境问题（Pulavarty等人，2021年），开发抗性马铃薯品种是控制并根除PCN的关键策略。在美国西部，市场上广泛种植的红皮品种缺乏对G. pallida的强抗性，这突显了育种工作的紧迫性（Whitworth等人，2018年）。全球范围内，具有G. pallida抗性的品种相对较少，例如英国的“Innovator”、“Vales Everest”和“Ambassador”（Price等人，2024年），中国的“Coperation-88”（Li等人，2011年）、“Nadine”（Faggian等人，2012年）、“Novano”（Wang等人，2023年）以及“Axion”（Bachmann-Pfabe等人，2019年）。此外，美国还存在其他Globodera物种，如G. rostochiensis和G. ellingtonae，因此需要开发对多种Globodera物种具有抗性的新育种材料。本研究旨在评估源自抗性品种“Eden”和易感品种“Western Russet”的四倍体红皮马铃薯群体对G. pallida Pa2/3病理型的表型抗性，以确定潜在的育种系并指导未来的遗传学研究。

使用对照品种和已知PCN抗性谱型的差异克隆进行的初步评估验证了温室试验多年来的一致性和区分能力。易感对照品种（“Desiree”、“Russet Burbank”、“Western Russet”）的囊肿和卵/囊肿数量最高，而差异克隆“65.346/19”和“P55/7”对G. pallida Pa2/3群体表现出易感性（表1）。相比之下，品种“Eden”以及差异克隆“62.33.3”和“D47/11”被认为具有部分抗性。这些发现与先前的研究结果一致，即G. pallida Pa2/3病理型在P55/7上的繁殖能力较强（Blok和Phillips，2012年）。Whitworth等人（2018年）报告称，差异克隆“62.33.3”和“D47/11”对爱达荷州的G. pallida群体具有部分抗性。Garnet（2023年）在使用英国G. pallida群体进行的研究中报告，差异克隆“62.33.3”对G. pallida Pa2/3病理型具有部分抗性。然而，根据欧洲的分类标准，差异克隆“62.33.3”被描述为对G. pallida Pa1和Pa2病理型具有抗性，但对G. pallida Pa3病理型具有易感性（Kort等人，1977年）。此外，差异克隆“D47/11”在Kort等人（1977年）和Stone等人（1979年）的研究中被描述为对G. pallida Pa2和Pa3病理型具有抗性，但在我们的研究中其抗性低于预期。类似地，携带GpaIVSadg的差异克隆“12674ab1”也被描述为对G. pallida Pa2和Pa3群体具有抗性（Bryan等人，2002年；Stone等人，1979年），但在Whitworth等人（2018年）的研究中则被报告为对爱达荷州的G. pallida群体具有部分抗性。在本研究中，“12674ab1”克隆的平均囊肿数量（10.7）和平均卵/囊肿数量（93.7）与“Eden”相似，后者的平均值分别为23个囊肿和91个卵/囊肿（数据未在三年中均显示）。Blok和Phillis（2012年）报告称，爱达荷州的G. pallida群体毒力模式与欧洲许多田地中常见的G. pallida Pa2/3毒力组一致，这与我们的研究结果相符。虽然差异克隆的反应表明爱达荷州的G. pallida群体可能存在轻微变异，但这些差异似乎并不显著。尽管这些细微变异并未导致克隆之间的显著表型差异，但它们可能暗示了与疾病抗性动态相关的细微差异。此外，这强调了宿主遗传在决定G. pallida繁殖成功中的关键作用。

在A10915四倍体马铃薯群体中，观察到对G. pallida Pa2/3的抗性存在显著的表型变异。平均抗性值低于抗性品种“Eden”的后代可能是进一步育种工作的有希望候选者，旨在开发抗性马铃薯品种。整个A10915四倍体马铃薯群体表现出对G. pallida Pa2/3的中等抗性，这从其囊肿和卵/克隆的平均值可以看出。227个后代的群体规模足以提供足够的统计分辨率，用于表型评估和识别具有潜在抗性和理想块茎特性的后代（图4）。这些后代已被作为亲本用于USDA-ARS Aberdeen马铃薯育种计划（Richard Novy个人沟通）。

已知G. pallida的抗性是一种由多个基因控制的数量性状，不同于对G. rostochiensis有效的单一显性基因H1（Cotton等人，2014年）。与对G. rostochiensis具有抗性的品种相比，采用对G. pallida具有抗性的马铃薯品种的普及程度较低。人们对所部署抗性的长期有效性存在担忧，而G. pallida群体的复杂遗传结构是其中一个因素（Evans和Stone，1977年；Varypatakis等人，2019年）。广义遗传力估计支持这一点，表明表型变异的相当部分受遗传控制。囊肿（0.55）和卵/克隆（0.56）性状的遗传力适中，表明旨在减少囊肿数量和每株植物总体线虫繁殖潜力的选择应该是有效的。相比之下，卵/囊肿（0.38）性状的较低遗传力表明，在该群体中，雌性繁殖力的变异更多受到环境因素的影响。这表明遗传因素对囊肿性状的发展有显著影响，而卵性状的遗传力对于育种计划来说更具挑战性，至少从“Eden”继承的遗传因素来看是这样。这些结果在育种计划中很有价值，因为它表明选择某些性状可能对后代表型的表达产生多大影响。此外，育种工作可以专注于选择具有理想农艺特性和对G. pallida Pa2/3抗性的个体。然而，重要的是要考虑影响该性状变异的环境因素。例如，每株植物的雌性数量和G. pallida的繁殖力可能在不同的温度和湿度条件下有所不同（Jones等人，2017年；He等人，2022年）。育种工作应考虑马铃薯生长的各种环境条件。此外，线虫群体可能会随季节变化而波动。育种工作应考虑这些变化，以确保在不同生长季节中保持稳定的抗性。

理解这些性状之间的关系对于高效表型分析至关重要。囊肿与每个克隆的卵之间的强正相关（r=0.9，r2=0.7）表明，在该群体中，囊肿性状是决定植物上总线虫数量的主要因素。这种强关联可能反映了线虫建立取食地点的成功，这支持了囊肿和随后卵发育的过程。虽然每囊肿的卵数量是雌性繁殖力的直接指标，并有助于总卵数量，但其与囊肿性状的中等相关性（r=0.5，r2=0.3）和较低的遗传力表明，它可能受到其他因素或基因的影响。这可以通过囊肿和卵发育是两个不同生物过程的事实来解释。囊肿发育侧重于保护结构（囊肿）的形成和雌性繁殖周期的完成，而卵发育或雌性的繁殖力则侧重于单个雌性或囊肿内产生的卵的数量（Price等人，2021年）。在G. pallida的生命周期中，囊肿和卵的发育是一个复杂的过程，受到宿主-植物相互作用、遗传因素、环境条件以及G. pallida内部机制的共同影响（Gartner等人2021；Mwangi等人2021；Price等人2021）。尽管评估每个囊肿中的卵数量工作量较大，但它能提供关于G. pallida生命周期中一个独特方面的宝贵见解，这是仅通过囊肿特征无法完全捕捉到的，从而能够更全面地评估抗性（Price等人2021；Gartner等人2021）。了解来自爱达荷州的G. pallida Pa2/3菌株的行为对于马铃薯育种者和种植者来说非常重要，有助于采用适当的害虫管理方法。理解这一菌株的遗传组成和复杂性也是指导未来研究的关键。虽然对G. pallida的抗性是定量的，但未来的研究可以重点识别本研究中发现的抗性背后的具体遗传因素，特别是GpaIVSadg这一从‘Eden’遗传而来的主要位点的作用和效应。通过绘制这一位点与其他可能相关的小基因的图谱，可以开发出分子标记，以加速选择过程。本研究的结果突显了育种群体中不同后代之间的抗性特征多样性，并为未来旨在控制和根除G. pallida的马铃薯育种计划提供了有价值的信息。除了评估囊肿数量外，还评估卵的数量，可以更准确地反映线虫的生命周期及其与宿主植物的相互作用。这两种特征都揭示了植物阻碍线虫繁殖的能力，并可能提供更有效的抗性策略。此外，由于卵代表了线虫种群的繁殖潜力或攻击性，因此评估卵/囊肿的数量使研究人员能够评估每个克隆体中的总卵数。这些信息对于理解线虫种群的总体攻击性至关重要。综合评估这两种特征可以提供更全面的抗性图景。因此，在研究G. pallida的发育过程中同时关注囊肿和卵可以提供更深入的抗性分析，为培育抗性马铃薯品种和有效的线虫控制策略提供关键见解。然而，在评估卵/囊肿时，虽然能获得关于线虫繁殖潜力的宝贵信息，但也需要考虑其在育种计划中的实用性。与计数囊肿相比，分析卵/囊肿可能非常耗时，这可能会减慢识别有潜力马铃薯候选品种的初始选择过程。本研究中的一个观察结果是，使用卵/克隆体进行分类时，被归类为抗性的后代比例有所增加。这一增加表明A10915菌株的抗性可能是通过多种机制实现的：一种机制抑制线虫的初始定殖（减少囊肿数量），另一种机制限制达到成熟期的雌性的繁殖能力（减少每个囊肿中的卵数）。评估总卵数/克隆体可以捕捉到这些抗性机制的累积效应，并代表土壤中的接种体潜力。因此，出于效率和速度的考虑，育种计划可能会优先评估囊肿数量。然而，如果需要对特定育种系进行进一步确认或更深入地了解抗性，则可以在后期结合卵/囊肿分析，这是一个有价值的补充步骤。在红皮马铃薯群体中鉴定出对G. pallida Pa2/3具有抗性的后代，对于旨在为美国市场培育出具有商业可行性的抗性品种的马铃薯育种计划来说是一个宝贵的成果。这些选定的后代可以作为来自‘Eden’的抗性等位基因的来源，用于未来的杂交育种。由于G. pallida具有较高的遗传变异性（Canto和Scurrah 1977；Grenier等人2001, 2010；Plantard等人2008），并且仅靠一个天然抗性基因难以控制（Bryan等人2004；Caromel等人2005；Park等人2019），在这些红皮类型克隆体内堆叠多个抗性基因对于实现广泛且持久的抗性至关重要。未来的研究应重点验证这些选定后代在田间试验中的抗性，并利用如Asano等人（2021）开发的分子标记来识别来自‘Eden’的GpaIVSadg位点。尽管这个主要位点在本研究中表现出显著的抗性水平，但后代间观察到的抗性差异表明存在其他遗传因素。因此，进一步的基因组分析是必要的，以识别其他贡献的QTL，从而实现更精确的抗性基因堆叠，并促进育种计划中的标记辅助选择。总之，本研究描述了红皮马铃薯群体对G. pallida Pa2/3的表型抗性，成功识别出许多具有良好抗性水平的后代，包括较少被评估的每个囊肿中的卵数量。遗传力估计和性状相关性为育种计划中的选择策略提供了宝贵信息。这些抗性品系为培育抗G. pallida的红皮马铃薯品种做出了重要遗传贡献，这对美国马铃薯产业的长期可持续发展至关重要。