帕洛圣托（Bursera graveolens）精油纳米乳液：对牛乳腺炎相关菌株的毒理学、镇痛及抗菌作用

《Antonie van Leeuwenhoek》：Palo Santo (Bursera graveolens) essential oil nanoemulsion: toxicological, antinociceptive and antimicrobial potential against bovine mastitis–associated strains

　　摘要
牛乳腺炎是乳品生产中的主要挑战之一，导致显著的经济损失，并凸显了需要替代不加选择地使用抗生素的必要性。Palo Santo（Bursera graveolens）精油（BEO）具有公认的生物特性，这些特性可以通过纳米工程递送系统得到增强。本研究旨在对B. graveolens的BEO进行化学表征，开发含有该精油的纳米乳液（BEO-NE），并评估其对与牛乳腺炎相关的病原体的毒理学、镇痛和抗菌活性。通过气相色谱-质谱（GC–MS）确定了BEO的化学组成，发现D-柠檬烯（38.70%）是主要成分。BEO-NE以鳄梨油作为油相，海藻酸钠作为稳定剂进行配制。通过体内实验评估了其毒理学和镇痛效果，包括急性毒性、乙酸诱导的扭动反应和甲醛测试。通过最小抑制浓度和杀菌浓度测试评估了其对葡萄球菌属（Staphylococcus spp.）、牛棒状杆菌（Corynebacterium bovis）、超伊氏链球菌（Streptococcus uberis）和Prototheca bovis的抗菌活性。BEO-NE对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）表现出增强的抗菌活性，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）分离株，而对C. bovis和S. uberis的效力较低，表明存在病原体依赖的选择性。该制剂显示出良好的安全性，没有肝毒性的证据或行为改变。BEO还在甲醛测试的神经发生阶段表现出显著的镇痛活性（p < 0.05）。总之，BEO-NE代表了一种有前景的控制金黄色葡萄球菌（牛乳腺炎的主要致病菌）的策略，结合了选择性的抗菌和镇痛效果。

引言
牛乳腺炎被认为是影响乳品工业的最重要疾病之一，导致巨大的生产和经济损失。牛奶产量的显著减少往往导致奶牛提前淘汰，由此造成的经济损失估计约为总畜群收入的10%（Corrêa等人，2024年）。在亚临床病例中，这些损失更为明显，因为早期变化不易检测到，从而增加了与兽医服务、抗菌治疗和抗炎药物相关的支出（Paramasivam等人，2023年）。这种情况多年来不断恶化（Zhang等人，2022年），凸显了开发更有效和更安全的牛乳腺炎预防和治疗策略的迫切需求。

乳腺炎的控制传统上主要依赖于抗菌药物的使用（Tommasoni等人，2023年），但由于抗菌药物耐药性的增加，这种方法的效果逐渐减弱。在这一背景下（Eleodoro和Fagnani，2023年），报告称葡萄球菌属是巴西亚临床乳腺炎病例中最常分离出的病原体，在分析样本中的平均患病率为49%，并且对常用抗菌药物（特别是青霉素）具有高度耐药性。凝固酶阴性葡萄球菌属分离株表现出高水平的多重耐药性，大约32%的菌株对八类或更多类的抗生素同时具有耐药性（Brito和Costa，2024年）。广泛使用的抗菌药物，如青霉素和氨苄西林，也报告了高耐药率，以及乳牛群中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株的出现（Khanal等人，2022年；de Oliveira等人，2022年）。乳腺炎相关微生物（尤其是葡萄球菌属）的生物膜形成能力进一步加剧了这一情况，这种机制促进了感染的持续存在并降低了传统治疗的效果（Vieira等人，2024年）。据估计，批准用于乳房内使用的抗菌治疗的临床成功率在20%到50%之间，这加强了需要补充和预防策略的必要性（Li等人，2023年）。

牛奶是全球广泛消费的食物，占全球人口80%以上的饮食成分，相当于大约60亿人（Algharib等人，2024年）。在这种情况下，牛奶的卫生质量从公共卫生和食品安全的角度来看起着核心作用。然而，乳品养殖中抗菌药物的密集使用，特别是为了控制牛乳腺炎，与牛奶中药物残留物的存在和耐药微生物的选择有关，从而产生了卫生、经济和环境影响（Zhang等人，2022年）。因此，在乳品生产系统中预防牛乳腺炎起着根本性作用。采用适当的管理措施，结合减少乳腺 gland暴露于感染因子的机会，是疾病控制的主要策略之一（Tommasoni等人，2023年）。乳腺炎预防与挤奶时间、设备卫生、畜群健康管理、挤奶工的手部卫生以及挤奶前后乳头消毒等因素密切相关（Sharun等人，2021年）。

鉴于抗菌药物密集使用的局限性和预防措施的重要性，天然化合物作为控制牛乳腺炎的替代策略受到了越来越多的关注。在这些化合物中，精油因其抗菌、抗炎和镇痛特性而脱颖而出，并已广泛研究其对乳腺炎相关微生物的作用（Caneschi等人，2023年）。然而，它们的直接应用存在挥发性、不稳定性和在水介质中溶解度低等限制，这些因素可能影响其效力和安全性（Nie等人，2023年）。为了克服这些限制，提出了如纳米乳液等可控递送系统作为优化精油使用的方法。这些系统提高了生物活性化合物的稳定性、生物利用度和安全性，同时增强了其生物活性，从而实现了更有效的兽医应用（Polat Yemi?等人，2022年）。

在治疗潜力方面，Bursera graveolens精油（Palo Santo精油）尤为突出。这种原产于墨西哥和秘鲁的树木含有公认具有药理意义的植物化学成分，传统上用于民间医学，文献中描述了其抗菌和镇痛特性（Laurintino等人，2023年；Espinoza等人，2021年）。然而，将其抗菌活性与乳腺炎相关病原体、毒理学安全性以及技术在递送系统中的应用相结合的研究仍然很少。因此，本研究旨在评估Bursera精油的抗菌、镇痛、抗炎和毒理学活性，无论是其自由形式还是配制成纳米乳液的形式，以期其作为控制临床和亚临床牛乳腺炎的治疗替代品的应用潜力。从每个平板中选取一个菌落，将其悬浮在10毫升磷酸盐缓冲盐水中，直至浊度达到0.5 McFarland标准（1.5×10^8 CFU/mL），具体操作遵循临床和实验室标准协会（CLSI）的指南（Perez等人，2020年）。

**抗菌敏感性测试（纸片扩散法）**
抗菌活性通过纸片扩散法进行评估（Orszulik，2022年）。使用直径为6.35毫米、重量为80克的无菌滤纸圆片，分别浸渍BEO（15微克）和BEO-NE（15微克）处理液。作为阳性对照，根据临床和实验室标准协会（CLSI）的指南，使用不同类别的抗菌剂，并按标准化浓度添加：β-内酰胺类抗生素AMC（阿莫西林/克拉维酸，30微克）和AMP（氨苄西林，30微克）、氨基糖苷类抗生素GEN（庆大霉素，30微克）、苯酚类抗生素CL（氯霉素，30微克）、氟喹诺酮类抗生素CIP（环丙沙星，30微克）以及四环素类抗生素TET（四环素，30微克）。

平板在35±1°C的条件下培养18±2小时。培养结束后，在反射光下从平板底部测量抑制圈直径。根据测量结果，将微生物分类为敏感（S）、中介（I）或耐药（R）。

抗生素的抗菌敏感性解释遵循CLSI指南（Humphries等人，2021年）。对于BEO和BEO-NE处理组，结果评估依据的是先前关于天然产物和精油的研究标准（Arbab等人，2022年）。

**肉汤微稀释敏感性测试**
通过肉汤微稀释法测定最小抑制浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），具体操作在无菌的96孔微量滴定板中进行，遵循研究小组先前建立的方案（Damasceno等人，2026年）。将接种物稀释至每孔最终浓度为5×10^5 CFU/mL。BEO和BEO-NE事先溶解在二甲基亚砜（DMSO，0.1%）和脑心浸出液中，然后在0.195至200微克的浓度范围内进行测试。平板在37°C下培养24小时，保持最终DMSO浓度≤5%（体积比），该浓度作为阴性对照。通过向每个孔中加入30微升0.02%的雷沙丁红溶液（Sigma-Aldrich）来评估微生物存活情况（Sarker等人，2007年）。

**最小杀菌浓度（MBC）的测定**
将无可见生长的孔中的10微升样本转接至添加了5%脱纤维绵羊血的血液琼脂培养基上。MBC定义为未观察到细菌生长的最低浓度。MBC值高于MIC表明具有抑菌作用，而MIC和MBC值相等则表明具有杀菌作用（Leandro等人，2016年）。

### 体内实验
所有涉及动物的实验均经过机构动物护理和使用委员会（CEUA-IPEN，协议编号74/24）的审查和批准，符合国家和国际动物实验指南。共从巴西圣保罗的核能与能源研究所（IPEN）的动物设施中获取了78只雄性BALB/c小鼠。实验在温度（23±2°C）和湿度（50±10%）受控的环境中进行，光照/黑暗周期为12小时，小鼠可自由摄取食物和水。

**精油及其纳米乳液的毒理学评估**
通过开放场测试评估BEO和BEO-NE的毒理学安全性，包括观察运动活动和一般临床症状。雄性BALB/c小鼠随机分配到实验组（n=6），包括阴性对照组以及分别接受最高剂量BEO（50 mg/kg）和BEO-NE（15 mg/kg）处理的组。

开放场测试使用一个尺寸为45×45×20厘米的塑料场地，场地地面划分为九个相等的正方形（15×15厘米）。通过计算处理前后6分钟内小鼠用四肢穿越正方形的次数来评估其自发运动活动，以此作为行为指标。测试后4小时内监测小鼠是否出现急性毒性症状，如运动变化、行为异常（烦躁、嗜睡或攻击性）、呼吸模式、流涎、流泪、周围组织发绀、毛发竖立以及死亡情况。相同的小鼠还用于根据OECD指南425（OECD，2022年）评估急性毒性潜力。在整个实验期间监测体重变化（Almeida Junior等人，2021年），以作为系统毒性的指标。此外，每天观察小鼠14天，记录迟发性临床症状和死亡情况。

在实验第15天进行安乐死前，通过腹腔注射低剂量硫喷妥钠使小鼠麻醉至失去意识，以减少应激和疼痛。随后通过心穿刺采集血液样本，测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性，作为潜在肝损伤的生化标志物（Junior等人，2020年）。随后通过腹腔注射硫喷妥钠（0.84克）对小鼠实施安乐死。进行尸检，检查胃肠道的宏观变化，以评估测试配方可能引起的刺激或腐蚀作用。

**镇痛和抗炎活性评估**
使用福尔马林测试和乙酸诱导的腹部扭动测试评估BEO和BEO-NE的镇痛和抗炎潜力（Almeida Junior，2019年）。雄性BALB/c小鼠随机分配到实验组（n=6），包括：阴性对照组；一组接受标准镇痛药物（吗啡，2.5 mg/kg，腹腔注射），在测试前30分钟给药；一组接受标准抗炎药物（吲哚美辛，10 mg/kg，经口灌胃），在测试前60分钟给药；以及分别接受BEO（25和50 mg/kg，经口灌胃）和BEO-NE（15 mg/kg，经口灌胃）处理的组，在测试前60分钟给药。

在福尔马林测试中，处理后1小时将2.5%的福尔马林20微升注射到小鼠右后爪的背侧。立即将小鼠放入单独的观察室，使用数字秒表记录小鼠在注射后5分钟内（第一阶段——神经源性疼痛）以及注射后15至30分钟（第二阶段——炎症性疼痛）舔舐、咬伤或摇晃注射爪子的总时间。

在乙酸诱导的腹部扭动测试中，处理后60分钟通过腹腔注射0.6%的乙酸（0.1 mL/10克体重）。观察20分钟后，记录小鼠的腹部扭动次数，这种扭动表现为腹部收缩后后肢伸展（Almeida Junior，2019年）。

**统计分析**
使用GraphPad Prism软件（版本8.0.1）进行统计分析。处理前后数据的比较采用Student’s t检验。其余分析采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey多重比较检验。使用ROUT检验检测异常值，发现异常值时予以排除。当p<0.05时认为差异具有统计学意义。

### Bursera graveolens精油的化学成分分析
色谱分析（图2）确定了BEO的主要成分（表1），其中D-柠檬烯是主要成分（保留时间RT 8.91分钟；占比38.70%），其次是α-萜品醇（RT 15.21分钟；占比17.31%）。其他化合物的相对丰度较低，包括氧化单萜和倍半萜，显示出化学多样性。次要成分占总样本的0.84%，另有1.42%的化合物无法鉴定。

### 挥发性成分的定性分析
通过气相色谱-质谱联用技术对Bursera graveolens精油的挥发性成分进行了定性分析（表1）。

### 纳米乳液的制备和物理化学特性
BEO-NE在初始时间点的Zavg值为198.6±16.41纳米（图3A），在5±2°C储存90天后仍基本保持不变（201.6±14.33纳米），表明其在评估期间具有良好的物理化学稳定性。多分散指数（PDI）（图3B）也保持稳定，储存前为0.31±0.02，储存后为0.32±0.02，说明滴粒尺寸分布均匀。

### 含Bursera graveolens精油的藻酸钠纳米乳液的物理化学特性
储存前（D0）和储存90天后（D90，5±2°C冷藏条件下）的藻酸钠纳米乳液的物理化学特性包括平均流体动力学直径（Zavg）（A）、多分散指数（PDI）（B）、透射率（%）（C）和扩散系数（D）（D）。数据以平均值±标准差表示。透射率值（图3C）随时间略有下降，从81.50±0.50%降至80.23±1.69%，未发现物理不稳定或相分离现象。扩散系数（D）（图3D）在储存后也有明显降低（从2.567±0.351 ?^2 ps^-1降至2.400±0.200 ?^2 ps^-1），这与滴粒流体动力学直径的轻微增加相吻合。

### 体外抗菌活性
通过纸片扩散法评估的抗菌活性（表2）显示，测试微生物对常规抗菌剂具有高度耐药性，尤其是C. bovis、P. bovis、S. marcescens和S. aureus菌株。BEO对大多数抗生素类别（包括β-内酰胺类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类和四环素类）均表现出显著耐药性。

使用苯唑西林（数据未显示）对S. aureus进行表型鉴定，证实该菌株属于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）类型。相比之下，BEO对大多数测试微生物具有抗菌活性，包括多重耐药菌株。BEO-NE的抗菌活性与BEO相当或更强，甚至对某些耐药菌株也有效。

### MIC和MBC的测定
MIC和MBC的测定（表3）显示BEO具有显著的抗菌活性，尤其是对革兰氏阳性菌。S. epidermidis、S. uberis和C. bovis的MIC和MBC值≤3.125 mg/mL。而S. sciuri、S. agalactiae和革兰氏阴性菌E. coli对精油的敏感性较低，其MIC和MBC值超过200 mg/mL。

### 体内实验结果
**BEO-NE的抗菌活性显著增强**
与纯精油相比，BEO-NE的抗菌活性显著提高，大多数测试微生物的MIC和MBC值均降低。尤其是对S. aureus（包括MRSA菌株）、S. sciuri、S. epidermidis、S. agalactiae和S. marcescens的抗菌效果更明显，表明该配方能提高精油的生物利用度和抗菌效果。BEO-NE对P. bovis的抗菌活性也较高。然而，在测试条件下，E. coli、S. uberis和C. bovis对纳米乳液仍具有耐药性。

**其他物质的抗菌活性**
作为赋形剂和溶剂对照的藻酸钠（1%）、Tween 80溶液（5%）和鳄梨油对测试微生物均无抗菌活性，未观察到抑制圈或微生物生长减少。

### 毒理学评估
开放场测试后，接受BEO或BEO-NE处理的动物未出现急性毒性迹象。在最初的4小时观察期内，未发现运动活动、行为（烦躁、嗜睡或攻击性）、呼吸模式、流涎、流泪、周围组织发绀或毛发竖立等变化，也未记录到任何死亡或毒性症状。根据OECD指南425，各组间的体重变化无统计学显著差异（p=0.2334，图4A）。血清ALT和AST水平也未出现显著变化（图4B），表明无肝脏毒性，各组浓度稳定（p=0.2446）。

### 结论
Bursera graveolens精油（BEO）及其纳米乳液（BEO-NE）在Balb/c小鼠中的毒理学安全性良好，实验期间体重无显著变化（p=0.2334）。血清ALT和AST水平也未发生变化（p=0.2446），表明无肝脏毒性。数据按照经合组织协议425的要求，以“平均值±标准差”的形式呈现。与之前的观察结果一致，评估交叉次数的开放场地测试（图5）显示实验组之间没有显著差异（p=0.1890），所有评估条件下的平均值均接近100。对胃肠道进行死后宏观检查后，未发现接受BEO或BEO-NE处理的动物有任何形态学改变。未观察到与刺激或腐蚀效应相符的迹象，包括充血、水肿、溃疡、坏死区域、出血或胃肠道黏膜的明显结构变化。这些发现进一步支持了所评估配方的安全性，表明在所使用的实验条件下不存在局部胃肠道毒性。

图5：该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。

**Bursera graveolens精油（BEO）和含有精油的纳米乳液（BEO-NE）在Balb/c小鼠中的安全性和毒性数据，用于开放场地试验。展示了阴性对照组（NC）、以50 mg/kg剂量处理BEO的组以及以15 mg/kg剂量处理BEO-NE的组。在治疗前（B）和治疗后（A）评估了行为参数，并进行了统计分析，显著性水平为p<0.05。**

**镇痛和抗炎活性**
在福尔马林诱导的疼痛反应试验中，BEO和BEO-NE在测试的两个阶段都减少了疼痛行为。在第一阶段，即神经源性疼痛阶段（图6A），50 mg/kg剂量的BEO显著减少了舔舐时间。值得注意的是，即使在较低剂量下，BEO-NE（15 mg/kg）也表现出持续的镇痛效果，表明纳米乳化配方的效力更强。这些减少具有统计学意义（BEO，p=0.0028；BEO-NE，p=0.0464）。在第二阶段，即与炎症性疼痛相关的阶段（图6B），BEO和BEO-NE都减少了疼痛反应时间，表明其作用与调节炎症过程有关；然而，这种减少并未达到统计学显著性（p>0.05）。

**Bursera graveolens精油（BEO）和含有精油的纳米乳液（BEO-NE）在福尔马林试验中的镇痛和抗炎潜力评估，包括在表现出神经源性疼痛阶段（A）和炎症性疼痛阶段（B）的实验中，以及通过腹部扭动试验（C）评估的镇痛潜力。*与阴性对照组相比具有统计学差异。**

同样，在乙酸诱导的腹部扭动试验（图6C）中，接受BEO和BEO-NE处理的动物扭动次数平均减少，尽管这种减少没有统计学意义（p>0.05）。

**讨论**
纳米乳液的技术效率部分解释了在一些镇痛（Teixé-Roig等人，2022年）和抗菌（Polat Yemi?等人，2022年）试验中观察到的优越性能。众所周知，纳米工程递送系统可以提高萜烯的溶解度和生物利用度，同时保护生物活性化合物免受挥发和氧化降解，从而增加其在实验基质中的持久性（Kaspute等人，2025年）。基于纳米乳液的递送系统，如BEO-NE，在制药和兽医纳米技术中是成熟的策略（Polat Yemi?等人，2022年）。本配方中观察到的胶体稳定性，通过没有聚集现象得到证实，这与含有表面活性剂和疏水性天然化合物的系统的预期行为一致（Kogan和Garti，2006年；Nguyen等人，2024年）。

临床前安全性得到了BEO和BEO-NE急性毒性评估的支持，以及肝生物标志物（ALT和AST）和体重增加的未发生改变的支持。文献中关于Bursera graveolens精油的毒理学数据有限（Laurintino等人，2023年），这突显了本研究的新颖性。相比之下，Wojtunik-Kulesza等人（2022年）报告了单萜类化合物（如D-柠檬烯和α-萜品醇）的中等剂量的良好安全性，这些化合物是BEO的主要成分。此处未观察到行为或肝脏改变，进一步支持了B. graveolens精油的生理兼容性，特别是当与微胶囊化策略结合使用时，这可能调节吸收动力学并减少局部刺激。

镇痛潜力主要在福尔马林试验的第一阶段（神经源性疼痛）得到证实，其效果与阿片类镇痛剂观察到的效果相当。这种反应表明其对瞬时受体电位通道有调节作用，导致疼痛信号减弱和周围炎症介质减少，正如Kaimoto等人（Kaimoto等人，2016年）使用D-柠檬烯（本研究的主要成分）所证明的那样。此外，α-萜品醇已被报道具有镇痛作用，并能减少促炎细胞因子的产生，这可能协同作用于观察到的镇痛效果（Soleimani等人，2019年）。

先前涉及BEO的研究也报告了细胞因子的调节作用，这可能是其在福尔马林诱导的疼痛模型中有效性的基础。尽管福尔马林试验的第一阶段通常与痛觉感受器的直接激活相关，但炎症介质如TNF-α、IL-17A、IL-23和IL-8可能参与早期疼痛信号传导和周围敏感化，从而影响神经源性疼痛成分（Wang等人，2022年）。

在福尔马林试验的炎症阶段和乙酸诱导的扭动试验中，BEO和BEO-NE均未表现出显著的镇痛活性。这一发现支持了BEO更倾向于与与第一阶段（神经源性疼痛）相关的中枢镇痛机制相互作用，而不是与第二阶段相关的周围炎症途径相互作用的假设。这一假设得到了先前涉及富含单萜类精油的研究的支持，这些研究报道了主要的中枢疼痛信号调节作用（Kaimoto等人，2016年；Guimar?es等人，2013年）。

抗菌研究发现，BEO和BEO-NE对与牛乳腺炎相关的病原体表现出复杂的活性谱。先前的研究表明，封装策略可以提高精油的抗菌效力（Polat Yemi?等人，2022年）。在本研究中，尽管BEO-NE仅含有30%的B. graveolens精油，但仍观察到对S. marcescens、S. sciuri和S. agalactiae的抗菌活性增强。这种增强可能归因于纳米乳液系统，它促进了生物活性化合物与细菌细胞壁之间的更紧密相互作用，从而增强了抗菌效果（Singh等人，2017年）。

BEO和BEO-NE都对金黄色葡萄球菌（包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）表现出显著的抗菌活性。这些结果强调了这些配方在控制牛乳腺炎主要病原体，特别是多重耐药微生物方面的转化潜力（Khanal等人，2022年）。观察到的效力进一步强调了基于天然产物的方法作为兽医健康和牲畜疾病管理战略选择的相关性（Li等人，2023年）。

与游离BEO相比，BEO-NE对C. bovis和S. uberis的抗菌活性降低，这可能归因于疏水性成分在纳米乳液油相中的分配行为（Asres等人，2025年）。当D-柠檬烯和其他萜类化合物溶解在纳米滴液中或被Tween 80胶束包裹时，可能会表现出缓释特性，导致孵育期间可用的生物活性化合物浓度降低，从而低于抗菌活性所需的MIC。对于封装的BEO也报告了类似的行为，其中抗菌效力高度依赖于目标细菌物种的结构特征（Sousa等人，2022年）。

革兰氏阴性细菌通常对BEO的敏感性较低，因为它们的外膜富含脂多糖，这作为对疏水性化合物的选择性渗透屏障（Dos Santos等人，2025a）。这一结构特征特别限制了碳氢化合物单萜的活性，并与本研究中观察到的对大肠杆菌无抗菌活性一致。尽管有证据表明萜类碳氢化合物D-柠檬烯可以通过破坏细菌细胞膜和泄漏细胞内成分来发挥抗菌作用，但其单独的活性通常较弱，且高度依赖于高浓度、氧化转化或特定的配方策略（Gupta等人，2021年）。相比之下，报道精油对抗大肠杆菌抗菌活性的研究主要将这种效力归因于高水平的酚类单萜，如百里酚和香芹酚（Lara等人，2016年）。

BEO-NE对Serratia marcescens表现出抗菌活性，其MIC和MBC值低于大肠杆菌观察到的值。这一发现表明，外膜通透性的种间差异，结合纳米工程配方（da Silva等人，2023年；Brito等人，2024年），可能增强了生物活性化合物与细菌细胞之间的相互作用，从而扩大了BEO的抗菌谱。最近的研究强调了植物提取物和BEO对乳腺炎相关病原体的疗效的显著变异性，并突出了配方策略在决定抗菌效果中的关键作用（Souza等人，2024年）。

本研究评估的P. bovis分离株的抗生素敏感性谱显示出了广泛的耐药性。Morandi等人（2016年）的先前研究表明，该属对传统抗菌剂（特别是β-内酰胺类、氟喹诺酮类和磺胺/甲氧苄啶组合）具有高度耐药性，这与此处报告的结果一致。Rodríguez等人（2025年）描述了某些菌株对氨基糖苷类（如庆大霉素）的敏感性。酚类和单萜类化合物已被证明会破坏细胞壁和膜完整性，促进不受控制的离子流入，并破坏细胞能量代谢，这些机制可能有助于对抗P. bovis的活性（Grzesiak等人，2018年）。

单萜类被确定为BEO的主要成分（Laurintino等人，2023年）。这些结果与Sosa等人（2023年）的研究一致，他们确定D-柠檬烯是该精油特征性香气的主要植物化学物质，其次是α-萜品醇。这些发现共同强调了单萜类的生物学相关性，特别是它们的抗菌和镇痛特性（Bakkali等人，2008年）。

总体而言，这些结果强调了封装精油的生物技术价值，并符合当前开发替代天然抗菌剂以减轻细菌耐药性和改善动物健康的趋势（Movahedi等人，2024年）。需要进一步涉及牛乳腺炎体内模型（Vieira等人，2024年）、针对性机制研究以及在类似于生产系统的条件下进行的评估，以加深对观察到的效果的理解。这些方法将有助于配方改进、剂量优化，并巩固在牛乳腺炎控制中的实际应用，特别是针对多重耐药病原体（Caneschi等人，2023年；Nie等人，2023年）。重要的是，本研究并不提议取代抗生素，而是支持在综合治疗策略中结合使用基于精油的配方。

总之，Bursera graveolens精油表现出稳健的化学特性，以D-柠檬烯为主，并证明了其纳入基于纳米乳液的递送系统的可行性。尽管该系统在测试的细菌菌株之间的效力存在差异，但对金黄色葡萄球菌活性的显著增强支持了将纳米技术作为优化牛乳腺炎治疗策略的应用。确定的神经源性镇痛效果进一步补充了该配方的药理学特性。未来需要开展关于长期稳定性和牛乳腺腺体内安全性评估的研究，以将这种纳米乳液确立为传统抗生素治疗的可持续替代方案。