通过标记辅助选择对Yr基因进行堆叠，以提高小麦品种WH711和PBW343的抗条锈病能力

《Discover Plants》：Pyramiding Yr genes via marker-assisted selection to improve stripe rust resistance in wheat cultivars WH711 and PBW343

　　摘要：为了培育抗黄锈病的高产小麦基因型，采用了标记辅助选择（MAS）技术。作为供体的硬红春小麦品系Lassik携带三个抗性基因：高温成株抗性基因（Yr36）、成株抗性基因（Yr18）和全生育期抗性基因（Yr17）。这些基因通过MABC（ Marker-Assisted Backcrossing）技术被引入到高产但易感黄锈病的小麦品种WH711和PBW343中。在BC2F7和BC2F8代中，分别使用特定标记（WKS1/ASA、csLv34和URIC-LN2）对这三个基因进行正向选择。背景选择则利用了100和101个简单序列重复（SSR）标记，针对WH711 × Lassik和PBW343 × Lassik杂交后代进行。WH711 × Lassik杂交产生了9个BC2F8代后代，而PBW343 × Lassik杂交产生了5个具有理想Yr基因的后代，其与受体亲本的遗传相似度分别达到了96.48%和97.50%。这些品系在自然感染条件下表现出显著的抗黄锈病能力，并因其在形态上的高度相似性以及正向选择中Yr基因的阳性结果而被选为田间试验对象。本研究证明了标记辅助回交（MABC）能够成功地将持久的抗黄锈病基因引入到广泛种植的小麦品种中。

1 引言
谷物是全球人类和动物食物供应的基础。小麦是全球主要种植的谷物作物之一，年产量约为2.19亿公顷，产量达到7.609亿吨[10]。它提供了人类所需食物热量的五分之一，以及55%的碳水化合物[28]。然而，小麦生产经常受到锈病、霉菌病、叶枯病和黑穗病等严重病害的周期性影响，导致巨大的作物损失。在这些锈病中，黄锈病（条锈病）是全球最为严重的病害[31]。条锈病，通常称为黄锈病（Yr）或印度地区的“Pilliya”，由Puccinia striiformis f. sp. tritici（Pst）真菌引起，该真菌在中国、印度、美国、澳大利亚和中东等主要小麦生产区具有高度破坏性[6, 41, 42, 43]。全球约88%的小麦品种易受黄锈病影响[46]。在印度，条锈病在北部凉爽地区和南部的尼尔吉里山区更为常见。P. striiformis是一种专性生物寄生菌，需要一个初级宿主（小麦、大麦及其他一些草本植物）来完成其无性生殖阶段（夏孢子期），以及一个交替宿主（Berberis spp.）来完成有性生殖阶段[16]。由于黄锈病感染会消耗宿主的水分和养分，导致籽粒萎缩、每穗籽粒数量减少、籽粒重量下降，并在叶片上形成特征性的坏死条纹或长斑，从而使植株生长受阻[7, 9, 12, 43]。对于叶锈病或条锈病，这可能导致高达60%的产量损失；而对于茎锈病，则可能导致高达100%的产量损失[5, 42, 47]。鉴于这些情况，黄锈病似乎正在扩散并对粮食安全构成持续威胁。最经济高效且环保的管理方法是利用遗传抗性[4, 44]。随着新病原菌株的出现，人们发现具有特定抗性基因的品种寿命较短。通过堆叠多个抗锈病基因可以实现持久有效的抗性，这通常基于能够减缓病原体在成株期感染和定植的加性相互作用，从而产生近乎免疫的状态，相当于高度抗性[49]。在利用标记辅助选择（MAS）将抗性基因引入小麦育种计划时，与黄锈病抗性（Yr）基因紧密相关的分子标记极为有用[13, 30, 32, 36, 45]。例如，Yr36/WKS1基因在较高温度下提供一定程度的抗条锈病能力[10]。此外，Yr18/Lr34/Pm38/Sr57基因簇能够提供对多种真菌病害的部分且持久的抗性[19]。在2A染色体上，Yr17/Sr38/Lr37基因簇还与茎锈病抗性基因Sr38和叶锈病抗性基因Lr37密切相关[2]。这些基因为幼苗和成熟植株提供长期的非特异性抗性[2]。

传统的育种方法耗时且劳动强度高，且受环境影响较大。因此，为了缩短育种时间并培育出持久的抗性，可以利用与锈病抗性紧密相关的分子遗传标记[1, 20]。使用MAS进行小麦育种的最流行方法是标记辅助回交（MABC），该方法仅需两代回交（BC）即可恢复97%或更多的重复亲本基因组（RPG）[23]。PBW343和WH711是印度北部地区广泛种植的高产小麦品种。尽管这些品种很受欢迎，但它们极易感染黄锈病（Yr）。Lassik是一种在加利福尼亚商业种植的硬红春小麦品种，它是Anza品种的回交衍生品，携带三个抗锈病基因Yr36/Gpc-B1、Yr17/Sr38/Lr37和Yr18/Lr34/Pm38/Sr57基因簇，可用于通过MAS提高黄锈病抗性和籽粒蛋白质含量。因此，本研究旨在通过MABC将Lassik中的有效Yr36、Yr18和Yr17基因引入WH711和PBW343中。

2 材料与方法
2.1 植物材料
本研究使用的植物材料包括受体亲本WH711（2002年在Hisar的CCSHAU开发）和PBW343（1996年在Ludhiana的PAU开发）。WH711和PBW343是印度西北平原地区（NWPZ）农民广泛种植的高产、高肥力灌溉品种，但由于新黄锈病病原体的出现而变得易感。供体亲本Lassik是一种硬红春小麦品系，源自Anza，携带三个抗条锈病基因（Yr36/Gpc-B1、Yr18-Lr34-Pm38、Yr17-Lr37-Sr38）[27]。

2.2 品系筛选与群体构建
用于研究的植物材料包括受体亲本WH711（2002年在Hisar的CCSHAU开发）和PBW343（1996年在Ludhiana的PAU开发）。WH711和PBW343是印度西北平原地区（NWPZ）农民广泛种植的高产、高肥力灌溉品种，但由于新黄锈病病原体的出现而变得易感。供体亲本Lassik是一种硬红春小麦品系，源自Anza，携带三个抗条锈病基因（Yr36/Gpc-B1、Yr18-Lr34-Pm38、Yr17-Lr37-Sr38）。

2.3 分子标记
所有世代的亲本品系和植株均使用与Yr36相关的WKS1标记、与Yr36/Gpc-B1相关的ASA标记、与Yr18-Lr34-Pm38相关的csLv34标记以及与Yr17-Lr37-Sr38相关的URIC-LN2 CAPS标记进行筛选，以确认这三个抗条锈病基因的存在（表1）。PCR扩增反应在25 μl反应体积中进行，包含100–120 ng的基因组DNA、200 μM的每种dNTP（G-Biosciences）、0.2 μM的每种正向和反向引物、2.5 mM的MgCl2和1.0 U的Taq DNA聚合酶，使用Benchtop热循环仪进行。为了通过GelDoc系统观察扩增产物，将其在1.0–2.5%的琼脂糖凝胶上分离。在PCR扩增后，向PCR产物中加入5 U的Dpn II限制性内切酶和URIC-LN2引物进行消化。限制性内切酶消化混合物在37°C下孵育1–3小时。样品在8%溴化乙锭染色的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并在紫外光下观察结果。

2.4 标记辅助回交育种
采用标记辅助回交（MABC）技术将黄锈病抗性基因转移至受体亲本。在Tomar之前的研究中[37]，WH711和PBW343受体品系与供体品系Lassik杂交，产生了两个F1代。F1代植株分别与各自的受体亲本（WH711和PBW343）回交，生成BC1F1群体。在BC1F1群体中对Yr36、Yr18和Yr17进行MAS选择，选出三个基因阳性植株。这三个基因阳性植株再与重复亲本WH711和PBW343回交，生成两个BC2F1代。选出的BC2F1植株在Himachal Pradesh的Lahaul-Spiti和Tamil Nadu的Wellington的非季节性苗圃中自交，分别培育出BC2F5、BC2F6、BC2F7和BC2F8群体。在BC2F7和BC2F8代中进行了表型选择（选择与重复亲本农艺特征相似的植株）、正向选择、病害评估以及使用多态性SSR进行背景选择（评估RPG的恢复情况），以确定在小麦生长季节最接近重复亲本的植株。

2.5 DNA提取
使用Murray和Thompson改进的CTAB方法从4–5周大的植株中提取亲本品系和回交后代（BC2F7 & BC2F8）的基因组DNA。然后使用0.8%琼脂糖凝胶电泳对DNA进行定量。

2.6 标记辅助正向与背景选择
在BC2F7和BC2F8代的九个有潜力的品系和五个品系上，使用与三个Yr基因相关的8个引物进行正向选择（表1）。使用575个SSR标记对亲本品系（WH711、PBW343和Lassik）进行背景选择。然后使用114个多态性SSR标记评估在正向选择中呈阳性的回交后代中重复亲本基因组的恢复情况（表S1）。所有引物序列均来自GrainGenes 2.0数据库：一个针对Triticeae和Avena的数据库[11]，以及Roder等人[29]（Somers等人[48]）。研究中使用的所有引物均由Eurofins Genomics India Pvt. Ltd.（班加罗尔，印度）和Imperial Life Sciences Pvt. Ltd.合成。

2.7 标记辅助回交育种
利用标记辅助回交（MABC）将黄锈病抗性基因转移到受体亲本中。在Tomar之前的研究中[37]，WH711和PBW343受体品系与供体品系Lassik杂交，生成两个F1代。F1代植株分别与各自的受体亲本（WH711和PBW343）回交，生成BC1F1群体。在BC1F1群体中对Yr36、Yr18和Yr17进行MAS选择，选出三个基因阳性植株。这三个基因阳性植株再与重复亲本WH711和PBW343回交，生成两个BC2F1代。选出的BC2F1植株在Himachal Pradesh的Lahaul-Spiti和Tamil Nadu的Wellington的非季节性苗圃中自交，分别培育出BC2F5、BC2F6、BC2F7和BC2F8群体。在BC2F7和BC2F8代中进行了表型选择（选择与重复亲本农艺特征相似的植株）、正向选择、病害评估以及使用多态性SSR进行背景选择，以确定在小麦生长季节最接近重复亲本的植株。使用以下公式，确定了回交代中RPG恢复的程度：$$${\text{RPG}}\,\left( \% \right) = 2\left( {\text{R}} \right) + \left( {\text{H}} \right)\,{\text{2N}} \times 100$$ 其中R表示具有重复亲本等位基因的标记位点数量；H表示仍为杂合子的标记位点数量；N表示用于背景分析的多态性标记总数。2.7 评估MABC品系的农艺表现：在CCS HAU的分子生物学、生物技术和生物信息学系以及遗传学和植物育种系的小麦研究农场中，将BC2F7和BC2F8代杂交后代的单个植株在温室中播种，并评估其株高、每株分蘖数、穗长、穗重、每穗粒数、每穗小穗数、每小穗粒数、籽粒颜色、千粒重、每株产量和收获指数。2.8 在人工接种Puccinia striiformis f. sp. tritici的情况下对MABC品系的条锈病抗性进行田间评估：在印度Hisar的CCS HAU研究田（纬度29°10′N，经度75°46′E，海拔215.2米）中，通过在Pst的幼苗/分蘖期通过喷洒方式人工接种包括46S119、110S119、110S84和78S84（106/ml）在内的病原体混合物，对所有MABC品系进行了条锈病抗性的评估。为了自然分散条锈病菌，还在试验田周围种植了敏感品种，如Kharchia、Agra Local、WH143、Lal Bahadur和Bajara Yellow。同时使用改良的Cobb评分标准记录病害严重程度（DS）和感染类型（ITs）[26]。IT-1为高度抗性植株，仅有少量坏死斑点且无孢子形成；IT-2为中等抗性植株，有少量坏死斑点和微量孢子形成；IT-3为中等易感植株，有坏死斑块和中等孢子形成；IT-4为高度易感植株，有黄化条纹和大量孢子形成。无可见症状的免疫植株被指定为IT-0。病害严重程度分类如下：R（抗性）表示无孢子堆和小的坏死区域；MR（中等抗性）表示有小孢子堆、轻微黄化或坏死；MS（中等易感）表示有中等大小的孢子堆和少量黄化；S（易感）表示有大孢子堆和大量孢子形成，并且经常形成无明显条纹的病斑（Stalkman 1962）。3 结果 3.1 筛选黄锈病抗性基因型：通过分析重复亲本WH711和PBW343与供体亲本Lassik之间的多态性，使用575个SSR标记发现WH711和Lassik之间共有100个（17.39%）多态性SSR位点，而PBW343和Lassik之间共有101个（17.6%）SSR引物产生多态性等位基因（表S2 a,b）。WH711和Lassik每条染色体的多态性SSR标记数量从2个（染色体4A、6B、6D）到9个（染色体2D）不等。SSR标记的多态性百分比从6.9%（染色体4A）到34.6%（染色体2D）不等。PBW343和Lassik每条染色体的多态性SSR标记数量从2个（染色体4A、6B和6D）到11个（染色体2D）不等。染色体4A的多态性比例为7.7%，而染色体2D的多态性比例为42.7%（图S1）。使用多态性SSR引物评估了WH711 × Lassik和PBW343 × Lassik杂交后代中重复亲本基因组的恢复情况（图S2）。为了寻找Yr36、Yr18和Yr17基因的存在，选择了BC2F7代的14个品系——9个WH711 × Lassik品系和5个PBW343 × Lassik品系，以及亲本WH711、PBW343和Lassik进行前期选择。使用两个标记来确定Yr36基因的存在：一个是Lassik中已存在的Gpc-B1的等位基因特异性ASA标记，另一个是Yr36的基因特异性WKS1标记。在0.3 cM处，Yr36和Gpc-B1等位基因紧密相关，通常一起遗传。所有来自WH711 × Lassik杂交的9个品系和来自PBW343 × Lassik杂交的5个品系，以及供体亲本Lassik，使用WKS1标记扩增出了特定于Yr36基因的128 bp条带，表明所有品系中都存在Yr36基因。与Gpc-B1/Yr36相关的ASA标记在9个品系和两个杂交的5个品系中扩增出了1.6 kb产物，以及供体亲本Lassik，确认了所有回交后代中都存在Gpc-B1/Yr36基因。与Yr18相关的Cssfr1、Cssfr2和Cssfr5标记未能扩增出任何产物，而与Yr18基因相关的CsLv34标记用于前期选择。7个品系扩增出了特定于Yr18基因的150 bp产物（WL-7-1、WL-7-2、WL-7-3、WL-7-5、WL-7-7和WL-7-8），两个品系（WL-7-4、WL-7-9）在BC2F7植物中扩增出了230 bp产物。同样，对于PBW343 × Lassik杂交，使用csLV34引物筛选时，三个品系（PL-7-2、PL-7-3和PL-7-4）扩增出了150 bp产物，表明存在Yr18基因，而两个品系（PL-7-1和PL-7-5）在BC2F7植物中扩增出了230 bp产物，表明这两个品系中不存在Yr18基因。使用URIC/LN2标记对回交后代中的Yr17基因进行了前期选择。URIC/LN2在亲本基因型中扩增出了285 bp和275 bp条带，随后用限制性内切酶DpnII消化后，分别得到了285 bp（+）、166 bp（-）和109 bp（-）的产物大小，清晰地区分了携带Yr基因的植株。在WH711 × Lassik杂交的9个品系中，6个品系（WL-7-1、WL-7-2、WL-7-6、WL-7-7、WL-7-8和WL-7-9）产生了285 bp（+）产物，确认了Yr17基因的存在；3个品系（WL-7-3、WL-7-4和WL-7-5）扩增出了166 bp（-）和109 bp（-）的消化产物，表明不存在Yr17基因。两个PBW343 × Lassik杂交的品系（PL-7-3和PL-7-5）扩增出了285 bp（+）产物，确认了Yr17基因的存在；另外3个品系（PL-7-1、PL-7-2和PL-7-5）扩增出了166 bp（-）和109 bp（-）的消化产物，表明不存在Yr17基因。这些BC2F7植物自交后获得了BC2F8种子。在BC2F8代再次进行了前期选择，以确认Yr基因的纯合性（图1和S6–S10）。在田间条件下，9个品系中有7个（WL-7-1、WL-7-2、WL-7-3、WL-7-5、WL-7-6、WL-7-7和WL-7-8）对黄锈病的感染率为0%，两个品系（WL-7-4和WL-7-9）的感染率为40 S和30 S。亲本Lassik和WH711的病害严重程度分别为0和40 S。对于PBW343 × Lassik杂交，在田间条件下，5个品系中有4个（PL-7-2、PL-7-3、PL-7-4和PL-7-5）对黄锈病的感染率为0%，一个品系（PL-7-1）的病害严重率为50 S。亲本Lassik和PBW343的病害严重程度分别为0和60 S（图2）。BC2F8小麦品系对于两个杂交组合中的多个基因组合表现出类似的病害反应模式，如图2所示。对于每个位点上的重复亲本特异性等位基因，使用含有目标基因的植株中的多态性标记进行了背景选择。基于分布在21条染色体上的100个多态性SSR引物，WH711品系中Yr基因阳性BC2F7代中重复亲本基因组的恢复百分比在94.0%到96.1%之间。基于分布在21条染色体上的101个多态性SSR引物，PBW343 × Lassik杂交的Yr基因阳性BC2F7品系中重复亲本基因组的恢复百分比在93.6%到97.5%之间。为了提高WH711和PBW343基因组的恢复百分比，选择了对前期标记呈阳性且形态相似性和重复亲本基因组相似性高的植株进行回交，以产生BC2F8种子。在BC2F8代中，WH711品系的重复亲本恢复率为94.0%到96.1%，PBW343品系的重复亲本恢复率为93.6%到97.5%。图3进一步说明了Yr基因阳性BC2F8小麦品系中重复亲本基因组的贡献。基于Jaccard相似系数进行了聚类分析，以确定BC2F8小麦品系之间的遗传关系。受体亲本WH711和所有对黄锈病抗性基因呈阳性的BC2F8小麦品系属于一组，而供体亲本Lassik属于另一组（图4）。同样，受体亲本PBW343和所有对黄锈病抗性基因呈阳性的BC2F8小麦品系属于一组，供体亲本Lassik也属于另一组（图5）。3.2 改良品系的农艺表现：表2（表S3、S4）展示了选定的WH711和PBW343品系以及重复亲本和供体亲系的农艺表现。皮尔逊相关系数分析显示，产量性状（如穗长、穗重、每穗粒数、千粒重和产量）之间存在显著关系（图S3和S4）。改良品系的籽粒颜色与重复亲本WH711和PBW343相同（图S5）。三个品系的籽粒产量高于WH711。同样，三个品系的籽粒产量也高于重复亲本PBW343。表2 基于田间试验的BC2F8代九个有前景的（WH711 × Lassik）× WH711品系和五个（PBW343 × PBW343）× PBW343品系的各项产量和农艺性状的平均数据。温室实验中记录了两种杂交组合的产量及其组成部分的数据（表3、4、5、6、7和8）。在株高方面，WH711和PBW343分别为80.0 cm和81.2 cm，而BC2F7品系的株高范围为80.1至82.4 cm（WH711杂交）和79.4–81.8 cm（PBW343杂交）。WL-7-5和PL-7-2在各自组中是最高的植株。WH711 × Lassik的穗长范围为9.2至10.3 cm，PBW343 × Lassik的穗长范围为9.6至9.92 cm，其中WL-7-3和PL-7-3的值最高。穗重范围为1.98至2.75 g和1.89–2.21 g，WL-7-3和PL-7-3的穗重最重。每株分蘖数范围为2.0至2.6（WH711杂交）和2.8–3.6（PBW343杂交），其中WL-7-1、WL-7-7、WL-7-8和PL-7-3的值较高。每穗粒数范围为53.0至58.8和55.5–58.5，WL-7-3和PL-7-3的粒数最多。每穗小穗数范围为19.2至20.8和20.0–20.5，而每小穗粒数在WH711杂交中为3.0，在PBW343杂交中保持不变。所有BC2F7品系的籽粒颜色均为琥珀色。千粒重范围为34.9至41.2 g和37.42–41.32 g，其中WL-7-3和PL-7-3的千粒重最重。每株籽粒产量范围为3.2至4.9 g和4.48–4.81 g，WL-7-3和PL-7-3与重复亲本相当或超过其重复亲本。生物产量范围为12.8至3.8 g和13.17–13.55 g，多个BC2F7品系的生物产量与亲本相当。收获指数范围为0.25至0.35和0.336–0.354，WL-7-3和PL-7-3的收获指数与重复亲本一致。表3 基于温室试验的BC2F8代九个有前景的（WH711 × Lassik）× WH711品系和五个有前景的（PBW343 × PBW343）× PBW343品系的各项产量和农艺性状的平均数据。表4 基于温室试验的BC2F7代（WH711 × Lassik）× WH711品系的各项农艺性状范围。表5 基于温室试验的BC2F7代（PBW343 × PBW343）× PBW343品系的各项农艺性状范围。表6 基于田间试验的BC2F7代九个有前景的（WH711 × Lassik）× WH711品系和五个有前景的（PBW343 × PBW343）× PBW343品系的各项产量和农艺性状范围。表7 基于田间试验的BC2F7代（WH711 × Lassik）× WH711品系的各项农艺性状范围。表8 基于田间试验的BC2F7代（PBW343 × PBW343）× PBW343品系的各项农艺性状范围。4 讨论 4.1 基于标记辅助选择获得持久抗性：通过标记辅助的背景分析可以确定祖先亲本的相对贡献。近年来，MABC策略的使用频率增加的原因在于目标基因或基因组的快速、有针对性的整合，以及通过减少回交次数来恢复较高比例的重复亲本基因组[15]。一种长期提高抗病性的策略是在单一基因型中积累多个数量型或质量型及数量型抗性等位基因[24, 50]。在先前对特定菌株不敏感的持久抗性基因Lr34/Yr18/Pm38中发现了非NBS-LRR区域。Chen[4]提出，叶尖坏死（LTN）现象和类似衰老的过程与Yr18介导的锈病抗性有关。该基因产物可能通过释放影响真菌生长的化学物质直接参与防御反应。HTAP基因编码一种含有激酶结构域的蛋白质，该结构域与START（类固醇生成急性调节蛋白相关脂质转移）结构域相连，预计START结构域能够在高温下结合真菌脂质并改变其构象。由于其他生物体中不存在这种激酶和START结构域的组合，因此这种组合是独特的[10]。根据Helguera等人的研究[14]，特定菌株的抗锈病基因Yr17/Lr37/Sr38是由Triticum ventricosum的2NS染色体转移到面包小麦2AS染色体短臂上引起的异源染色质整合。这使得小麦对多种真菌感染具有抗性。在使用MAS构建的1-3基因叠加基因型中，这些抗性基因的不同作用方式可能有助于提高抗性的持久性。Anza是一个在加利福尼亚种植的商业性硬红春小麦品种，它具有三个抗锈病基因：Yr36/Gpc-B1、Yr17/Sr38/Lr37转座以及Yr18/Lr34/Pm38/Sr57基因簇。它还对大麦黄矮病毒和Septoria tritici斑病具有较好的抗性，并且具有较高的谷物蛋白质含量。高产且广泛使用的印度品种WH711（Yr2）和PBW343（Yr9 + Yr27）携带抗Yr2、Yr9和Yr27的基因，但这些基因已被新的黄锈病菌株削弱，使得这些品种容易受到黄锈病的影响。为了恢复WH711和PBW343对黄锈病的抗性，将Yr36、Yr18和Yr17基因引入了它们的遗传背景中。此外，Yr18基因还与叶锈病抗性（Lr34）、白粉病抗性（Pm38）、秆锈病抗性（Sr57）和叶锈病抗性（Lr3）基因相关联。为了提供对多种感染的持久抗性，这些基因与抗黄锈病基因一起被叠加。Mallick等人[22]也尝试使用MAS来改进一个常见的但易感锈病的小麦品种HD2932，使其具备多种抗锈病基因（Lr19、Sr26和Yr10）。Mishra等人[23]利用基于DNA的标记Xucw108，通过MAS方法将供体PBW343 + Gpc-B1 + LR24的Gpc-B1 + LR24基因引入北印度的两个著名品种HUW234和HUW468中。经过两次与受体HUW234的回交、自交和进一步选择后，获得了116株BC2F2植株，其RPG（抗性比例）超过93%（范围为93.05%至95.11%）。在本研究中，分别使用WKS1/ASA和URIC/LN2标记对(WH711 × Lassik) × WH711和(PBW343 × Lassik) × PBW343杂交系的BC2F7和BC2F8代进行了Yr36、Yr18和Yr17抗性基因的显性选择。三个黄锈病抗性基因均存在于九个BC2F7品系中的五个品系中，其中两个品系同时含有Yr36和Yr18基因，一个品系仅含有Yr36基因。这些BC2F7植株经过自交后获得了BC2F8种子，并再次确认了抗性基因的纯合性。同样，对(PBW343 × Lassik) × PBW343杂交系的BC2F7代中的五个植株也进行了显性选择，其中一个品系同时含有三个Yr抗性基因，其中两个品系含有Yr36和Yr18基因，仅一个品系含有Yr36基因。这些BC2F7植株经过自交后产生了BC2F8种子，再次确认了抗性基因的纯合性，所有植株的结果与BC2F7代相似。与重复亲本WH711和PBW343相比，含有三个Yr基因组合的小麦品系在叶锈病接种压力下表现出较高的抗性。含有Yr18和Yr36的品系也表现出较高的抗性，而仅含有Yr36的品系则对黄锈病较为敏感。研究结果表明，基因组合比单一基因更有效地对抗病原体。三个基因叠加（2个APR基因和1个R基因）的高抗锈病性表明了累积基因的叠加和互补作用。在中国和其他国家，Yr18 APR基因和2-4个其他次要基因在过去80多年里对所有菌株都提供了有效的抗性[18, 21, 33]。在我们的研究中，含有Yr18 + Yr36基因组合的植株在田间试验中表现出抗性反应，这可能是由于两个APR基因的叠加效应。Chicaiza等人[8]观察到，在Yecora Rojo和UC1113基因型中，通过MAS将Y18和Yr36/Gpc-B1基因引入后，Y18 + Yr36组合表现出显著的叠加效应。Chen等人[3]研究了Lr34/Yr18对加拿大春小麦作图群体“CDC Teal”דCDC Go”中的四种锈病（叶锈病、黄锈病、叶斑病和秆锈病）和农艺性状的影响。已知Yr36基因具有部分抗性。2009年，Fu等人通过回交将WKS1/Yr36基因引入易感品种，展示了其抗性作用。当WKS1/Yr36的START结构域在高温和病原体接种压力下与Pst的脂质结合并改变其构象时，激酶结构域可能触发信号级联反应，导致程序性细胞死亡。然而，在我们的研究中，仅含有Yr36基因的品系表现出中等抗性，证明非特定菌株的基因无法单独提供抗性。同时含有Yr17和Yr36的品系也表现出中等抗黄锈病能力。温度、光照强度和遗传背景会影响Yr17的抗性。Yr17基因使Thatcher*8/VPM1具有低水平的抗性，导致孢子形成增加和坏死/黄化减少。尽管Yr17单独抗性较低，但与Yr36结合后抗性显著增强。据报道，Anza品种含有Yr17的抑制因子，使其容易受到毒性菌株的侵害。Lassik是Anza的回交衍生物[14]。Yr17 + Yr36基因组合表现出中等抗性的另一种解释可能是Anza中存在某种抑制Lr37/Yr17表达的基因。标记辅助背景选择（MABS）在小麦育种计划中已被证明能有效恢复重复亲本基因组（RPG）[35]。例如，在(WH711 × Lassik) × WH711和(PBW343 × Lassik) × PBW343杂交系中，使用100至101个多态性SSR标记进行MABS，成功在BC2F7和BC2F8植株中实现了93.6%至97.4%的RPG恢复率。同样，使用SSR标记Xucw108将Gpc-B1基因从供体Glu-pro引入小麦品种HUW468，并结合86个多态性标记进行背景选择，获得了谷物蛋白质含量（GPC）显著提高且RPG恢复率为90.7–95.4%的改良品系[39]。进一步证明其有效性的是，MABS还利用Glu133作为供体，提高了印度小麦品种HUW234的GPC和千粒重（TGW）。在这种情况下，分别使用Xucw108和Xgwm297进行GPC和TGW的显性选择，而使用86个多态性标记进行背景分析后，选中的植株RPG恢复率为89.5–93.0%[40]。在类似的研究中，使用136个多态性SSR标记对42个BC2F2植株进行背景分析后，DWR162背景中的67.5–94.7%得到了恢复[20]。这些一致的结果强调了MABS在小麦理想性状整合过程中恢复重复亲本基因组的效率。携带多个Yr基因的植株还表现出更好的农艺性状，如穗重、每穗小穗数、每穗粒数和每株粒数，优于任一亲本或易感植株。Lassik的籽粒呈红棕色，而WH711和PBW343的籽粒呈琥珀色。从这两种杂交系衍生的回交植株也表现出琥珀色籽粒，表明所有品系都恢复了重复亲本基因组。

5 结论
本研究成功为易感小麦品种WH711和PBW343提供了强效且持久的黄锈病抗性。我们通过一种称为标记辅助选择（MAS）的精确方法转移了三个关键抗性基因：Yr36、Yr18和Yr17。我们的策略采取了双管齐下的方法：首先，我们使用分子标记识别携带所需抗性基因的植株（显性选择）；然后，通过标记辅助背景选择（MABS）结合传统的表型选择，精细地恢复了优良亲本的原始遗传组成。这种综合方法非常有效，在BC2F8代中实现了高达96.1%和97.3%的重复亲本基因组恢复率。这种高水平的遗传背景恢复仅需两次回交，与仅依赖标记选择的研究结果相当。除了抗病性外，选定的小麦品系还表现出产量和其他重要的农艺特性。这项研究展示了将现代MAS技术与传统育种方法相结合的有效性，为培育出既抗多种真菌病害又能保持高农民生产力并最终保障社会粮食安全的小麦品种提供了可行的途径。

图1
a 显示了WH711 × Lassik和PBW343 × Lassik回交后代BC2F8群体中与黄锈病抗性基因（Yr36）相关的WKS1引物扩增结果的琼脂糖凝胶，预期产物大小为128 bp。
b 显示了WH711 × Lassik和PBW343 × Lassik回交后代BC2F8群体中与高谷物蛋白质含量基因（Gpc-B1）相关的ASA引物扩增结果的琼脂糖凝胶，预期产物大小为1.6 kb。
c 显示了WH711 × Lassik和PBW343 × Lassik回交后代BC2F8群体中与Yr18基因相关的csLv34引物扩增结果，预期产物大小分别为150 bp（+Yr18）和230 bp（-Yr18）。
d 显示了使用CAPS引物URIC – LN2扩增的PCR片段经Dpn II限制性内切酶消化的结果，其中未消化的PCR扩增产物（285-bp）表明存在Yr17基因，而消化的片段（166 bp和109 bp）表明缺乏Yr17基因。M: 100 bp 标记序列；M: 20 bp 标记序列；P1- Lassik（供体）；P2- WH711（受体）；P3- PBW343（受体）；1-9- (WH711 × Lassik) × WH711 衍生系；10-14- (PBW343 × Lassik) × PBW343 衍生系
图2：该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。
全尺寸图像：在田间条件下种植的 MABC 衍生 BC2F8 小麦品系（WH711 × Lassik 和 PBW343 × Lassik）的平均感染系数和疾病严重程度反应。
图3：该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。
全尺寸图像：展示了九株含有 Yr 基因（Yr17、Yr36 和 Yr18）的 BC2F8 植物中 2A、6B 和 7D 染色体上的供体亲本和重复亲本基因组。红色条形表示供体亲本（Lassik），蓝色条形表示重复亲本（WH711）。
图4：该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。
全尺寸图像：基于 100 个位点的 SSR 多样性数据，使用 NTSYS-pc（UPGMA）方法构建的树状图，显示了 BC2F8 植物（WH711 × Lassik）与亲本小麦基因型之间的遗传相似性。
图5：该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。
全尺寸图像：基于 102 个位点的 SSR 多样性数据，使用 NTSYS-pc（UPGMA）方法构建的树状图，显示了 BC2F8 植物（PBW343 × Lassik）与亲本小麦基因型之间的遗传相似性。