姜（Zingiber officinale）中由挥发性有机化合物（VOCs）引发的代谢和生化重编程，以增强其对Pythium myriotylum的抵抗力

《Discover Plants》：Volatile organic compound-induced metabolic and biochemical reprogramming in Zingiber officinale for resistance to Pythium myriotylum

　　摘要：由Pythium myriotylum（P. myriotylum）引起的根茎腐烂是生姜种植中的一个重要限制因素，因此需要开发可持续的防御策略。本研究评估了单萜类化合物香叶醇（Geraniol）、丁子香酚（Eugenol）和芳樟醇（Linalool）作为诱导生姜抗性的启动剂的能力。通过使用生化和代谢组学方法对防御反应进行综合评估，发现香叶醇是最有效的候选物质，显著降低了受感染植物的疾病严重程度。生化分析表明，经过香叶醇处理的受感染植物在防御相关化合物和酶活性方面表现出显著增强。香叶醇处理的植物中，酚类、黄酮类、花青素和木质素的含量升高，苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）的活性也有所增加。代谢组学分析显示次级代谢发生了显著变化，突出了启动剂处理植物中关键防御相关代谢物的积累。研究结果强烈表明，香叶醇有效地启动了生姜的防御系统，在面对P. myriotylum侵害时，能够更快、更强烈地诱导出先天性和诱导性防御机制。香叶醇处理被证明是一种有前景的、环保的策略，可用于管理由P. myriotylum引起的根茎腐烂。

1 引言
生姜（Zingiber officinale Roscoe）是一种具有经济重要性的香料作物，在全球范围内因其广泛的烹饪、药用和工业应用而受到重视[64]。然而，生姜的持续生产一直受到土壤传播病原体的挑战，这常常导致严重的经济损失和产量下降，在印度甚至可达到90%[103]。其中，Pythium myriotylum被认为是导致根茎软腐病的主要致病因子[46]。这种毁灭性疾病不仅导致严重的产量损失，还会造成大量的采前和采后损耗，对全球生姜生产者构成持续威胁[61]。传统的疾病管理策略主要依赖化学杀菌剂。此外，当前策略结合了适当的土壤排水和轮作等农艺措施以及Trichoderma物种和Pseudomonas fluorescens等生物控制剂，为传统的土壤太阳能消毒和化学灌洗提供了更可持续的替代方案[3, 8]。尽管这些方法可以立即解决问题，但它们也带来了一系列问题，包括作物中的残留毒性风险、病原体群体对抗菌剂的抗性发展以及不可避免的环境污染[28]。这些缺点凸显了需要更加可持续和环保的作物保护方法。鉴于这些日益严重的挑战，诱导抗性等替代和可持续的疾病管理方法在植物病理学和农业研究中受到了广泛关注[108]。其中，诱导系统抗性（ISR）和系统获得性抗性（SAR）代表了复杂的植物内在防御机制。这些机制并非始终处于活跃状态，而是在暴露于特定生物或化学诱导剂后“激活”或增强[107]。诱导抗性中的一个关键概念是“启动”（priming），它描述了由先前通常无害的刺激引起的防御能力增强状态。这种“启动”状态使植物能够更快、更强烈地应对后续的病原体攻击，从而有效准备其免疫系统，而不会过早消耗过多能量[5]。本研究调查了挥发性单萜类化合物香叶醇、丁子香酚和芳樟醇作为对抗Pythium软腐病的潜在启动剂的有效性。这些化合物是各种精油中的天然成分，因其多样的生物活性而引起了科学界的兴趣[66]。例如，香叶醇已被广泛记录具有抗菌和杀虫特性[13]。此外，这些单萜类化合物在植物间通讯和植物-病原体相互作用中发挥着越来越重要的作用，表明它们可以作为信号分子[16]。虽然最近的研究表明香叶醇可能在多种作物中触发防御反应[11, 37, 79, 91]，但这些特定单萜类化合物作为诱导生姜对Pythium抗性的启动剂的相对效果至今仍缺乏充分研究。这一知识空白为寻找新的、环保的诱导剂以抵御软腐病病原体提供了重要机会。深入了解支持诱导抗性的分子和细胞机制对于开发真正有效和持久的作物保护策略（特别是针对生姜）至关重要[38]。植物的防御反应非常复杂，涉及复杂的生化途径，如茉莉酸途径和苯丙烷类途径，这些途径共同合成多种保护性次级代谢物[Simardeep [40]]。这些途径导致多种保护性化合物的有序积累，包括植保素、酚类和黄酮类，它们具有直接的抗菌特性或作为信号分子[67, 80]。同时，防御反应还包括通过木质化和果胶沉积等过程快速强化物理屏障[63]，从而最终阻碍病原体的进展。在这些结构强化基础上，复杂的植物代谢网络在协调全面的防御反应中发挥了关键作用。为了全面捕捉植物在这些防御反应期间的代谢状态动态变化，代谢组学提供了宝贵的工具[95]。基于气相色谱-质谱（GC-MS）的代谢组学能够识别和量化多种代谢物，提供植物在启动和病原体挑战下代谢调整的全面快照[21]。因此，本研究的主要目的是严格评估香叶醇、丁子香酚和芳樟醇在启动Z. officinale对由P. myriotylum引起的根茎腐烂的抗性方面的有效性。为此，我们采用了一种综合的方法，结合了关键防御标志物的详细生化分析和先进的基于GC-MS的代谢组学分析，以全面绘制植物的代谢变化图谱。这种整体方法不仅旨在识别最有效的单萜类启动剂，还深入探讨了这些化合物激活和调节生姜防御系统的复杂分子和细胞机制。本研究的结果可能为开发新的、可持续的、环保的策略以保护生姜作物铺平道路。

2 材料与方法
2.1 植物材料及处理
从印度喀拉拉邦特里苏尔（Kerala）Mannuthy的喀拉拉农业大学（KAU）授权机构购买了健康的‘Athira’（Zingiber officinale Roscoe）生姜品种的根茎（10.53° N, 76.24° E）。这些根茎在科钦科技大学（Cochin University of Science and Technology）生物技术系的荫棚设施中，在自然条件下进行发芽和培养。为了确保环境一致性，植物在自然光照周期（大约12/12小时光照/黑暗）下生长，平均环境温度为28 ± 3°C，相对湿度在70%到85%之间，反映了该地区的典型热带气候。本研究使用了一种高致病性的自体培养的P. myriotylum菌株，在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上维持。香叶醇、丁子香酚和芳樟醇（分析级，纯度>98%）从日本东京化学工业（TCI）有限公司购买，并根据预先优化的研究分别制备成150、200和200 μM的溶液。我们采用叶面喷洒的方式，使用标准喷壶对生姜植物的地上部分进行香叶醇处理，以确保均匀喷洒。选定的生姜植物被系统地分为不同的处理组，以研究挥发性有机化合物（VOCs）处理及其随后感染P. myriotylum的效果。实验设计包括未处理的对照组和分别用香叶醇、丁子香酚或芳樟醇处理的组。具体来说，各组包括：
- 未处理组（C），仅用清水处理的健康植物；
- P. myriotylum感染组（P），其中C组接种了P. myriotylum孢子悬浮液；
- 香叶醇处理组（G），用香叶醇处理的植物；
- 香叶醇处理+ P. myriotylum感染组（G + P），即在处理后48小时接种P. myriotylum；
- 丁子香酚处理组（E），用丁子香酚处理的植物；
- 丁子香酚处理+ P. myriotylum感染组（E + P），即在处理后48小时接种P. myriotylum；
- 芳樟醇处理组（L），用芳樟醇处理的植物；
- 芳樟醇处理+ P. myriotylum感染组（L + P），即在处理后48小时接种P. myriotylum。每个处理组包含六个生物学重复样本，每个重复样本每盆有一株植物，以确保统计有效性和考虑生物变异。这种综合设置使得能够评估VOCs的直接效果及其在增强对P. myriotylum抗性中的作用。生姜植物在茎基部区域用P. myriotylum进行接种[27]。从在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上培养的48小时-old P. myriotylum菌株的活跃生长边缘切下直径为10毫米的菌丝盘，然后无菌地应用于每株植物的茎基部区域。为了保持高湿度并促进感染，接种区域被覆盖了无菌湿棉布。对照植物用无菌的PDA菌丝盘进行模拟接种。在接种后第5天和第7天采集叶子和茎基部区域的样本进行后续分析。疾病严重程度根据症状进展使用视觉量表进行评估。疾病严重程度分为0-3级：0表示绿色、健康的植物；1表示叶鞘基部变色和下部叶片变黄；2表示叶片完全变黄或死亡但仍存活的植物；3表示所有枝条都死亡[84]。评分在接种后定期进行，以跟踪疾病进展。

3 生理参数
通过在相应时间点从每个处理组采集样本，评估了启动处理和感染后的植物生理参数。通过包括生化和代谢组学分析在内的全面评估，在接种病原体后的第5天和第7天量化了防御启动和随后感染的生理反应。叶片样本中的总类胡萝卜素含量按照先前的方法进行评估[36]。溶剂提取是通过使用标准研钵和杵将大约500毫克叶片样本与4毫升80%丙酮（SRL, Maharashtra, India）混合来进行的。离心后上清液的吸光度值使用Spark多功能微孔板读数器（TECAN, Zurich, Switzerland）进行测量，并根据既定公式计算最终值[86]。
Chl a (μg/g FW) = (12.25*A663) - (2.79*A647)
Chl b (μg/g FW) = (21.5*A648) - (5.1*A663)
总类胡萝卜素 (μg/g FW) = ((1000*A470-1.82*Chl a) - (85.02*Chl b))/198
为了量化其他与压力相关的生物标志物，分析了生姜叶片样本中的总黄酮类、花青素、总酚类、可溶性木质素和丙二醛（MDA）含量。总黄酮类含量通过铝氯化物（AlCl3）比色法测定，测量420 nm处的吸光度，并根据校准曲线表示为槲皮素当量[4]。同样，花青素含量是在将100毫克研磨组织与2毫升含2% HCl的乙醇混合后测定的，吸光度在530 nm和657 nm处读取[96]。总酚类含量使用Folin-Ciocalteu方法测定，其中甲醇提取物与Folin-Ciocalteu试剂和碳酸钠反应，吸光度在765 nm处测量，对照标准曲线[6]。木质素含量是按照既定协议测定的，该协议包括一个酸催化反应，以生成一种有色的、可溶的木质素-硫代甘油酸复合物。木质素的浓度是根据340纳米处的吸光度值，通过木质素标准校准曲线计算得出的[78]。最后，通过将果皮在三氯乙酸（TCA）中均质化，然后与硫代巴比妥酸（TBA）反应，并在532纳米、600纳米和450纳米处测量吸光度，来光谱法测定表明脂质过氧化的丙二醛（MDA）含量。最终的MDA含量是使用基于这些吸光度读数和反应体积的特定公式计算得出的[31]。作为苯丙素途径中的关键酶，苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）的活性也被测量，以阐明有助于植物生理反应的生化防御机制。PAL活性是通过准备一个反应混合物来确定的，该混合物包含酶溶液、20毫摩尔/升的苯丙氨酸和50毫摩尔/升的硼酸盐缓冲液（pH 8.8）以及添加剂。反应在37摄氏度下孵育60分钟，随后通过加入6摩尔/升的HCl终止。然后在290纳米处测量所得到的吸光度来量化活性（Yanzheng Sun等人，2023年）。详细的程序信息，包括试剂制备、校准曲线和计算公式，提供在补充材料中。

4 GC-MS分析
采用气相色谱-质谱（GC-MS）方法来鉴定挥发性代谢物，从而全面评估植物对不同启动剂反应的代谢变化。分析在科钦科学技术大学应用化学系进行。通过将叶片样品在100毫克/毫升的甲醇中均质化来提取有机化合物。所得到的匀浆液在4000 xg下离心5分钟，以分离出含有提取代谢物的上清液。GC-MS分析使用的是配备HP-5MS毛细管柱的Agilent 7890 A仪器（美国加利福尼亚）。通过将获得的质量谱与国家标准与技术研究院（NIST）的全面数据库进行比较来鉴定化合物[98]。然后使用R统计环境（v4.4.2）中的ggVennDiagram（v1.5.2）包生成Venn图，对结果数据进行制表、排序和可视化（C.-H. Gao等人，[25]）。

5 实验设计和统计分析
实验采用随机完全区组设计，并重复进行以确保重复性。相应的结果表示为平均值±标准差（SD）。使用R统计编程语言（v4.4.1）和stats包（v4.4.1）进行方差分析（ANOVA）和Tukey的诚实显著差异（HSD）测试。所有分析的p值截断为0.05。

6 结果和讨论
6.1 植物材料和处理
本研究使用了健康的Athira姜根茎，这是南印度常见的栽培姜品种（图1）。毒力强的P. myriotylum分离株有效地产生了特征性的疾病症状，为研究提供了一个稳健可靠的病原系统。经过处理的植物和未处理的植物之间存在明显的差异，疾病指数有所不同。

图1
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用于研究的姜植物。图像显示了用于启动、致病性和GCMS分析的3个月大的健康姜（KAU Athira品种）植物。这些植物在CUSAT生物技术系的温室设施中维护。

7 挥发性有机化合物（VOCs）的启动显著减轻了疾病严重程度
在0–3的视觉评估尺度上，不同处理组之间的疾病严重程度有明显差异，这与之前关于植物-病原体相互作用的研究结果一致。未经处理的植物接种P. myriotylum后表现出严重的疾病进展，其特征是逐渐出现的黄化、萎蔫和显著的植株倒塌（得分为2–3），这是姜软腐病的关键症状。这一观察结果证实了P. myriotylum分离株的致病性，并为疾病发展建立了基线，与易感植物品种中观察到的典型疾病曲线一致[84]。
重要的是，在接种前用香叶醇、丁子香酚或芳樟醇处理的植物一致显示出显著减少的疾病症状和较低的严重程度得分，比未经处理的感染对照组更低。对照组的平均疾病进展曲线下面积（AUDPC）（P）（11.5）高于VOC处理组（E + P：约2.0，L + P：约0.5，G + P：约0.1）（图2a）。这一结果强烈表明了诱导的抗性效应，这与之前的研究发现一致，即挥发性有机化合物已被证明可以启动植物对各种病原体的防御[32, 53, 53]。
在VOCs中，G + P植物显示出最显著的疾病严重程度降低，表明其具有更强的防御效果（图2e）。G + P植物看起来明显更健康，与未经处理的组（P）相比几乎没有疾病症状（图2b）。香叶醇的这种最佳表现与最近的研究结果一致，这些研究强调了其在植物防御反应中的强大诱导作用，这些研究在水稻和柑橘中有所报道[44, 99]。L + P植物也表现出相当大的疾病抑制效果，虽然不如G + P植物有效。L + P植物（图2c）比E + P植物表现出更好的健康状况（图2d）。观察到的芳樟醇在抑制疾病方面的效果证实了先前的研究结果，这些研究报道了其抗菌特性及其在各种植物系统（如拟南芥-假单胞菌、浆果-链格孢病原体系统）中诱导防御反应的能力[20, 110]，表明与香叶醇相比，芳樟醇在激活信号通路或代谢通路方面的作用较弱。丁子香酚的启动虽然仍提供了一些保护，但在三种VOC中效果最不明显（图2d）。这种排名表明VOCs在诱导抗性方面的有效性是分层次的，即香叶醇 > 芳樟醇 > 丁子香酚。这一层次结构得到了AUDPC值的明确支持，香叶醇的AUDPC最低，其次是芳樟醇，然后是丁子香酚（图2a）。这些结果与研究表明不同VOC在触发植物防御机制方面的有效性程度不同相呼应，这通常取决于它们的化学结构和特定的植物-病原体相互作用[82]。
这一强有力的证据表明，VOC启动赋予了姜对P. myriotylum感染的抗性，可能是通过激活减轻疾病发展的防御机制。挥发性有机化合物处理后疾病严重程度的降低与之前的研究结果一致，这些研究强调了这些化合物在各种植物-病原体相互作用中的诱导能力[9]。未感染对照植物（P）中没有出现症状进一步验证了实验设置的有效性，确认感染组中的疾病进展完全是由P. myriotylum感染引起的。处理过的植物和未处理的感染植物之间的显著差异强调了VOCs作为姜栽培中疾病管理可持续策略的潜力。

图2
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VOCs对植物疾病进展的影响。a表示不同处理的平均疾病进展曲线下面积（AUDPC）（平均值±标准差，n=3）。b、c、d和e分别显示了在不同条件下的植物视觉表现。（b）显示了未处理的对照组表现出严重的疾病症状，而（c）、（d）和（e）分别显示了用芳樟醇、丁子香酚和香叶醇处理的植物，表明与对照组相比疾病进展减少。

8 生理参数
在接种后第5天和第7天分析各种生理参数，提供了更深入的植物反应见解，清楚地支持了观察到的疾病抑制层次结构，如下所述。

8.1 作为VOC启动后防御反应标志物的类胡萝卜素含量增强
类胡萝卜素在植物防御和健康中起着关键作用，作为重要的光合色素和抗氧化剂。植物类胡萝卜素含量的升高通常表明生理健康状况的改善和防御能力的增强。在第5天，P. myriotylum感染叶片样本中的类胡萝卜素含量在所有处理组中都有轻微增加，与未感染的对照组相比，表明了正常的应激诱导防御反应（图3a）。类胡萝卜素含量的增加反映了病原体对植物光合机制及其整体生理状态的直接影响，表明类胡萝卜素在植物防御反应中的作用[87]。然而，G + P植物的类胡萝卜素水平显著高于其他感染组，甚至超过了它们未经处理的感染对应物。这一观察结果再次强调了香叶醇增强植物防御机制的能力，可能是通过增强抗氧化能力或减少氧化损伤[83]。同样，L + P植物的类胡萝卜素水平也高于E + P植物，表明启动剂之间的保护效果存在差异。
这一趋势在第7天发生了显著变化，并变得更加明显。所有组的感染植物继续表现出比未感染对照组更低的类胡萝卜素含量，进一步强调了感染造成的持续压力（图4a）。然而，用香叶醇处理的感染植物在所有感染组中始终保持着最高的类胡萝卜素水平，显著超过了C、E + P和L + P植物。这表明香叶醇具有更强的能力来减轻氧化应激并在感染期间保护光合装置，可能是通过调节活性氧（ROS）清除途径[19]。L + P植物在第7天的类胡萝卜素保留也优于E + P植物，进一步强化了之前观察到的保护层次结构。这些发现共同表明，特别是香叶醇，具有在病原体压力下保护重要光合色素的潜力，从而增强了植物的抵抗力。

图3
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感染后第5天的样本生理参数。条形图表示：a 类胡萝卜素含量，b 总黄酮类，c 总花青素，d 总酚类，e 可溶性木质素和f 丙二醛含量。不同的小写字母表示根据Tukey的诚实显著差异（HSD）测试（p < 0.05）处理之间的显著差异（平均值±标准差，n = 6）。

8.2 与压力相关的生物标志物
其他与压力相关的生物标志物的量化提供了直接证据，证明了观察到的生理和抗性表型背后的生化变化，进一步证实了VOCs的有效性层次结构。

8.3 VOC启动调节了总黄酮类含量以增强抗氧化防御
评估了黄酮类含量，以评估植物的抗氧化反应及其减轻P. myriotylum感染引起的氧化应激的能力。黄酮类在植物防御中起着关键作用，作为抗氧化剂来减轻氧化应激，并对病原体表现出直接的抗菌活性[72]。本研究的数据揭示了由所应用的启动处理调节的动态反应。在第5天，所有处理组都显示出快速的防御反应（图3b）。P. myriotylum感染导致P和E + P植物的总黄酮类含量显著增加，与各自的未感染对照组相比。相比之下，用香叶醇和芳樟醇处理的植物在感染和未感染样本之间没有显著差异，两组的黄酮类水平都在大约14–15微克/克鲜重。到了第7天，情况发生了显著变化，突显了病原体和启动剂的持续影响（图4b）。在P和E + P组中，病原体的影响似乎压倒了植物的初始防御。P植物的总黄酮类含量急剧下降到大约9微克/克鲜重，显著低于C组的最高水平，C组的黄酮类含量约为20微克/克鲜重。E + P植物的黄酮类含量也比对照组有所下降。相比之下，用香叶醇和芳樟醇处理的植物表现出强大且持续的防御反应。它们的感染样本中的黄酮类水平保持较高，分别与未感染对应物相当，约为13和14微克/克鲜重。这表明用香叶醇和芳樟醇处理使植物能够维持这些关键抗氧化化合物的生产，从而在更长时间内抵抗病原体的有害影响[81]。这种持续的黄酮类生产可能通过减轻病原体引起的氧化应激和潜在的直接抗菌活性，有助于增强植物的长期抵抗力[47, 69, 106]。因此，这些结果证明了这些启动剂在增强植物防御机制方面的优越效果。

图4
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感染后第7天的样本生理参数。条形图表示：a 类胡萝卜素含量，b 总黄酮类，c 总花青素，d 总酚类，e 可溶性木质素和f 丙二醛含量。不同的小写字母表示根据Tukey的诚实显著差异（HSD）检验（p < 0.05）处理之间存在显著差异（平均值 ± 标准差，n = 6）。8.4 引发花青素积累的启动作用减轻了压力：花青素在植物防御中起着重要作用，它们在响应环境和生物胁迫时积累，并作为强效抗氧化剂来减轻细胞损伤[39]。花青素及其分解产物具有直接的抗菌特性，有助于植物抵御某些病原体，如Erwinia amylovora、Pseudomonas syringae等[Lucas-Bautista等人，[57]；Sánchez-Hernández，[77]]。在我们的研究中，第5天时，P. myriotylum感染并没有显著改变大多数组别的总花青素含量，仅有轻微变化（图3c）。有趣的是，第7天时，在所有经过启动处理的植物中观察到总花青素含量显著增加，表明存在氧化应激反应（图4c）。相反，P植物中的花青素含量显著减少，这表明病原体对疾病进展有负面影响。在各种处理组中，G + P植物的总花青素含量最高，显著高于P、E + P和L + P感染组。L + P感染植物的花青素含量也高于E + P植物。这种在香叶醇启动处理下的显著花青素积累表明其抗氧化防御能力增强或应激反应更加强健。G + P和L + P植物中花青素的持续积累可能通过减轻氧化应激来提高疾病耐受性，这一发现与先前关于植物防御启动的研究结果一致，这些研究表明花青素可作为活性氧（ROS）的强效清除剂，从而保护细胞成分免受损伤并增强应激耐受性[34, 48, 54]。这些启动剂维持高花青素水平的能力表明防御机制得到了成功激活，从而提供了对病原体的长期保护。8.5 引发酚类化合物积累的启动作用以实现广谱防御：酚类化合物在植物防御中起着关键作用，它们作为结构屏障、信号分子和抗菌化合物，保护植物免受病原体和食草动物的侵害[94]。有多项研究表明，酚类化合物在调节木质素和木栓质形成以及在病原体入侵期间诱导抗氧化活性方面起着重要作用。P. myriotylum感染后，P组中的总酚类化合物含量显著增加，这一差异在第5天就已经很明显（图3d）。同样，G + P植物的总酚类化合物含量也显著高于未感染对照组和其他感染组。L + P植物的酚类化合物含量也有所增加，尽管不如香叶醇显著。到第7天时，所有经过启动处理的感染植物的总酚类化合物含量仍显著高于对照组（图4d）。G + P植物继续表现出最高的总酚类化合物含量，显著超过所有其他组别，包括未经过启动处理的感染对照组。L + P植物的酚类化合物含量也高于E + P植物。香叶醇引起的这种明显的花青素积累表明其增强了抗氧化防御能力或更强的应激反应。G + P和L + P植物中花青素的持续积累可能通过减轻氧化应激来提高疾病耐受性，这一发现与先前关于植物防御启动的研究结果一致，这些研究表明花青素可以作为活性氧的强效清除剂，从而保护细胞成分免受损伤并增强应激耐受性[1, 81, 85]。8.6 启动处理后可溶性木质素的积累以实现结构防御：木质素在植物防御中起着关键作用，它在细胞壁中形成坚硬的物理屏障，提供对病原体入侵和扩散的机械防护[93]。为了阐明病原体接种后启动处理生姜植物中木质素积累的动态，对样本中的木质素进行了定量分析，第5天时，感染植物的可溶性木质素含量普遍高于对照组（图3e）。G + P植物显示出明显的可溶性木质素增加，表明早期和强烈的细胞壁强化反应。L + P植物也有所增加，而E + P植物的效果较弱。到第7天（图4e），感染植物的可溶性木质素继续增加，G + P植物显示出最高和最显著的可溶性木质素含量，表明其具有强大的木质化作用，以抵御病原体的扩散。L + P植物保持较高的可溶性木质素水平，高于E + P植物。香叶醇引起的这种持续的酚类化合物诱导表明其能够激活苯丙素途径以实现广谱防御。升高的酚类化合物水平表明其具有更强的清除感染过程中产生的活性氧的能力，这些活性氧可能导致显著的细胞损伤[14, 30, 76]。这一观察结果与先前在其他作物上进行的研究一致，这些研究表明酚类化合物作为植物防御中的关键次生代谢物，具有抗菌作用，并有助于形成如木质素这样的物理屏障，从而将强烈的和持续的酚类反应与植物抗病性的提高联系起来[1, 85]。8.7 启动处理降低了丙二醛（MDA）含量以减轻细胞损伤：丙二醛（MDA）在植物防御中作为氧化应激和细胞损伤的关键生物标志物，其积累表明了植物在应对病原体挑战时脂质过氧化的程度[23]。第5天时，P. myriotylum感染显著增加了P组中的MDA含量（表明脂质过氧化和氧化应激）（图3f）。在本研究中观察到，所有经过启动处理的感染组，特别是G + P植物，其MDA水平显著低于P植物。L + P植物的MDA含量也低于E + P植物。这一趋势在第7天时更加明显（图4f）。虽然P组中的MDA水平仍然较高，但G + P植物在所有感染处理中始终表现出最低的MDA含量，表明其更有效地减轻了氧化损伤。L + P植物保持较低的MDA水平，低于E + P植物。这种持续的MDA降低表明脂质过氧化和膜损伤显著减少，表明这些植物在P. myriotylum感染期间保持了更好的细胞完整性。香叶醇引起的MDA持续降低强烈表明其增强了抗氧化防御系统，保护细胞膜免受病原体诱导的氧化应激，并直接与更强的疾病抵抗力相关。P和E + P植物中观察到的显著较高MDA水平表明其防御机制被病原体的攻击所压倒，导致显著的氧化应激和细胞膜完整性的破坏，这些都是疾病进展的明显迹象。低MDA含量提供了强有力的证据，表明这些启动剂提高了疾病耐受性，这与先前将MDA积累减少与增强抗病性相关联的研究结果一致[29, 41, 109]。与压力相关的生物标志物的生理和生化数据一致表明，最有效的防御反应特征是防御化合物的强烈和持续诱导以及氧化应激的显著减少，这在G + P和L + P植物中观察到。这些处理导致了关键防御分子（包括黄酮类、花青素、酚类化合物和可溶性木质素）的持续积累，共同构成了一个多方面和有韧性的防御系统[7, 37, 52]。虽然在第5天未经过处理的组别中也观察到了初始的防御反应，但后来几天这种趋势不再明显。到第7天时，P和E + P植物的防御机制下降，细胞损伤相应增加，表现为丙二醛含量的升高。这证明了香叶醇和芳樟醇启动处理的优越效果，使得在整个实验期间疾病耐受性得到持续提升。总体而言，这些发现表明这些启动剂通过激活和维持长期的防御系统来增强疾病耐受性，有效抵御了病原体的攻击。8.8 启动处理提高了苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）活性以增强防御反应：实验研究了不同挥发性有机化合物（VOCs）对感染植物中苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）活性的影响，PAL是植物防御反应中的关键酶。PAL是一种主要酶，催化L-苯丙氨酸转化为反式肉桂酸，启动产生木质素和酚类化合物等重要防御化合物的苯丙素途径[18]。在感染后的5天内，所有感染植物的PAL活性都显著增加，与未感染对照组相比（图5a）。然而，G + P植物的效果最为显著，其PAL活性最高。L + P也表现出显著的增加，但不如G + P明显。相比之下，丁香酚对PAL活性的启动效果很小，增加幅度较小。图5显示了启动处理和未启动处理样本的苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）活性：感染后5天和7天，突出了启动处理后防御酶活性的增强。不同的小写字母表示根据Tukey的诚实显著差异（HSD）检验（p < 0.05）处理之间存在显著差异（平均值 ± 标准差，n = 6）。这表明香叶醇在快速激活植物防御系统方面特别有效。感染后7天时，P和E + P组的PAL活性初始激增已经下降，表明它们的防御反应持续时间较短（图5b）。这一趋势与G + P植物形成鲜明对比，后者保持了与第5天相当的高PAL活性。同样，L + P植物在这个较晚的时间点也保持了高PAL活性。香叶醇和芳樟醇启动处理的植物持续的PAL活性提供了强有力的酶学证据，表明这些VOCs有效地启动了植物的防御机制，使其对病原体具有更持久和持久的反应，这是我们研究的关键发现之一。现有文献表明，PAL活性的增加是植物强大防御反应的关键指标，导致各种保护性酚类化合物和木质素的积累[2, 71, 73, 92]。8.9 代谢组学分析揭示了启动处理引起的防御化合物的变化：使用GC-MS对生姜根茎样本进行代谢组学分析，提供了植物化学变化的总体概况。这项综合分析的目的是表征生姜代谢组的动态变化，并识别受启动处理显著调节的关键代谢途径，如苯丙素途径。该研究旨在将特定代谢物的积累与生理防御的增强联系起来，从而为香叶醇诱导的抗性提供更坚实的生化基础。通过将质谱与NIST数据库进行比较，识别出各种有机化合物，揭示了VOC启动处理和P. myriotylum感染后的代谢变化。这些变化包括初级和次级代谢物的变化，为观察到的生理和生化反应提供了分子基础。热图显示了在第5天和感染/启动处理后第7天不同处理组中识别化合物的存在或不存在，为植物防御反应背后的动态代谢变化提供了关键见解（图6）。图6显示了植物样本中各种防御相关化合物的存在（颜色）或不存在（白色）。这些样本按处理分组：对照（C）、P. myriotylum感染（P）、香叶醇启动（G）、香叶醇启动+ P. myriotylum感染（G + P）、丁香酚启动（E）、丁香酚启动+ P. myriotylum感染（E + P）、芳樟醇启动（L）和芳樟醇启动+ P. myriotylum感染（L + P）。数据收集于接种后第5天和第7天。处理后第5天，对照组和P. myriotylum感染植物之间存在显著的代谢差异。病原体感染通常会导致几种化合物的诱导或积累增加，这些化合物在健康对照植物中不易检测到或含量较低。这些化合物可能代表了生姜植物对病原体挑战的初始基础防御反应。同时，单独使用香叶醇（G）、丁香酚（E）和芳樟醇（L）进行VOC启动处理即使在无病原体挑战的情况下也引起了不同的代谢谱型，表明特定防御机制的预激活或“启动”。第5天的G植物显示出胡莫烯和异芳樟脑酮等化合物的存在，这些化合物在未启动处理的对照植物中基本不存在，表明了早期的代谢变化。在随后使用P. myriotylum（G + P, E + P, L + P）进行挑战时，代谢景观发生了深刻变化。处理通常导致更高的多样性，并且隐含地，与P或G、E和L相比，防御相关化合物的浓度也更高。这种协同或叠加效应表明，预先处理使植物具备了更强大、更快速和更全面的防御反应能力。这些差异在第七天变得更加明显，突显了与有效预处理相关的长期代谢调整。鉴定出了一系列在植物防御中具有已知或假设作用的化合物，为了解其潜在机制提供了关键见解。萜类化合物是一大类受到预处理和感染显著影响的化合物，它们既可作为直接的防御物质，也可作为信号分子。单萜类化合物如(-)-Myrtenol和(+)-2-Carene显示出不同的积累模式。值得注意的是，(-)-Myrtenol因其抗菌特性而受到关注[112]，在Geraniol预处理的（G和G + P）植物中，在第七天被诱导并持续存在，表明其在增强系统免疫中的作用。倍半萜类化合物，包括各种Farnesene异构体、Alloaromadendrene、Aromadendrene、Caryophyllene、cis-β-Farnesene、Germacrene D、Humulene、Isocaryophyllene、Longifolene、trans-α-Bergamotene、Valencene、α-Bisabolene、α-Himachalene和β-Chamigrene，特别丰富且反应强烈。许多这些倍半萜类化合物因其作为直接抗菌剂、拒食剂以及吸引植食性天敌的挥发性信号分子的作用而得到充分记录[11, 26, 75, 114]。虽然P处理通常会诱导一些倍半萜类化合物，但G + P组在第五天和第七天始终显示出更广泛和更持久的这些化合物阵列，包括Alloaromadendrene、Caryophyllene、Germacrene_D和Humulene，与其他预处理或未预处理的感染组相比。例如，Germacrene D是一种在植食性动物攻击时常见的挥发性物质，在G + P组中在第七天被强烈且持续检测到，表明了强大的信号反应。同样，Caryophyllene和Humulene因其直接的抗菌和杀虫特性而在G + P组中始终存在，进一步增强了防御能力，表明了广谱保护机制。苯丙烷类和酚类化合物对植物防御至关重要，因为它们有助于结构完整性、抗氧化活性和直接的抗菌效果（Naoumkina等人，2010年），也显示出显著变化。肉桂酸衍生物（例如2,5-二甲基肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸）和多种3-苯基丙酸酯被一致鉴定出来。这些化合物是大量酚类化合物（包括黄酮类和木脂素）的关键前体，在抵御病原体和植食性动物方面发挥关键作用，并提供紫外线保护[45, 62, 89]。它们的存在在预处理和受挑战的植物中显著增加，特别是在Geraniol预处理的组中，表明苯丙烷类途径处于活跃和增强状态。观察到多种3-苯基丙酸酯（例如2-甲酰-4,6-二氯苯酯、2,3-二氯苯酯等）及相关化合物如2-氰基苯基β-苯基丙酸酯和4-硝基苯基-β-苯基丙酸酯。这些酯类可以作为拒食剂或对病原体和害虫表现出直接的毒性作用[53, 100, 101]。它们在预处理和受挑战的植物中的增加和持续存在表明苯丙烷类途径得到了强烈激活，有助于增强防御。G + P组始终显示出这些化合物的特别强存在，表明Geraniol预处理在上调这一关键代谢途径方面非常有效。简单的酚类化合物如氢醌和焦性没食子酸，这些常见的酚类化合物参与氧化防御反应，也表现出不同的模式[43, 59, 74]。此外，脂肪酸衍生物（例如3-羟基十二烷酸）的调节表明脂质代谢发生了变化，支持防御。相比之下，氨基酸如L-甲硫氨酸（乙烯的前体，一种关键的植物防御激素）的变化表明代谢向防御相关的次级代谢产物生产转变[56, 90, 105]。观察到的代谢变化提供了关于VOCs（特别是Geraniol）如何增强生姜植物对P. myriotylum感染的防御的潜在分子和生化机制的全面见解。在随后病原体感染时，萜类和苯丙烷类在预处理植物中的广泛和强烈上调强烈表明，像Geraniol这样的VOCs不仅仅诱导了基础防御状态，而是使植物为更快、更强和更持久的免疫反应做好了准备。这种预激活可能涉及特定防御基因的敏感化，使植物的免疫系统更加“警觉”，能够快速有效地响应病原体识别[5, 15]。在预处理和受挑战的组中各种倍半萜类（例如Farnesene、Germacrene D、Caryophyllene）的显著和广泛诱导明确指向Jasmonate（JA）信号途径的显著激活，这是抵御坏死性病原体如Pythium myriotylum和许多昆虫植食性动物的防御反应的核心调节因子[22, 35, 55, 102]。Geraniol预处理似乎使JA途径敏感化，导致感染时JA介导的防御化合物的产生更快更强，可能是通过增强对JA信号的感知或更有效的下游基因激活。虽然基于代谢物谱型的主要关注点倾向于JA介导的反应，但一些酚类化合物也可以参与水杨酸（SA）介导的防御反应，通常是对生物营养型病原体。JA和SA途径之间的精细调节对于有效的植物免疫至关重要[52]，预处理可能会调节这种复杂的平衡。此外，L-甲硫氨酸（乙烯的前体）的变化表明乙烯信号的作用，乙烯通常与JA在防御反应中协同作用[10, Cox, 113]。在生姜中观察到的防御酶的诱导和代谢变化与更广泛的发现一致，即VOC处理“预处理”了多种植物物种对各种病原体的防御。例如，应用单萜类如芳樟醇已被证明可以增强拟南芥对半生物营养型Pseudomonas syringae的抵抗力，通过增强防御反应途径[20, 66]。此外，在木本多年生植物和果树中，使用Geraniol或丁香酚已被报道可以触发强烈的氧化爆发和苯丙烷类衍生物的积累，有效限制了如Botrytis cinerea等坏死性真菌的传播[Shuning [11, 33, 79]。这些比较证据表明，尽管具体的代谢物谱型是宿主特异性的，但VOC诱导的抗性机制仍然是调节植物对土壤传播和叶部病原体免疫的高度保守策略。苯丙烷类途径的一致上调进一步表明了植物物理和化学屏障的增强。这一途径对于产生木质素单体至关重要，木质素单体可以增强细胞壁，形成对病原体渗透和传播的强大物理屏障[42, 65, 93, 104, 110]。此外，来自这一途径的许多酚类化合物具有直接的抗菌特性，抑制病原体生长，同时作为强大的抗氧化剂减轻防御反应本身引起的氧化应激[68]。这种全面的代谢重编程，其中资源有效地转向防御化合物的合成，突出了诱导系统抗性（ISR）和系统获得抗性（SAR）的关键方面，使植物能够迅速调动资源来对抗感染而不显著影响生长[97]。根据详细的GC-MS数据，Geraniol被证明是最有效的预处理化合物，可以增强生姜对P. myriotylum感染的防御。G + P组始终显示出比所有其他处理（包括E + P、L + P，特别是未预处理的感染对照组）更全面、更强和更持久的防御代谢物谱型。Geraniol的优越表现通过更广泛的谱型和通常更高的关键倍半萜类（例如Alloaromadendrene、Caryophyllene、Germacrene D、Humulene）和单萜类（例如Myrtenol）的丰度得到体现，这些化合物以其直接的抗菌活性或在植物防御中的信号分子作用而闻名。此外，苯丙烷类途径在G + P组中似乎更一致和有效地被诱导，导致更实质性的化学和物理屏障。从第五天到第七天，G + P组的持续防御代谢物谱型也表明了持久的预处理效果，提供了对病原体的长期保护。G + P组的整体代谢物模式表明各种防御途径（特别是JA介导的萜类合成和苯丙烷类途径）的更和谐和有效的整合，导致了协同的防御反应。这表明Geraniol的特定分子结构可能特别被生姜的防御感知机制识别，可能比丁香酚或芳樟醇更有效地结合到特定受体或调节关键信号转导途径，如JA途径。这种优越的识别和激活将导致防御基因的更强烈预激活，以及在病原体挑战时快速和高水平产生广泛的防御代谢物。因此，Geraniol是一种非常有前途的天然预处理剂，可以增强生姜对Pythium myriotylum的抵抗力。9 结论这项全面的研究强烈表明VOC预处理在增强生姜植物对Pythium myriotylum引起的软腐病防御方面的有效性。研究结果突出了测试的VOCs之间的明显效力层次，其中Geraniol（特别是在150 μM时）始终诱导出最强大的防御机制，其次是芳樟醇（200 μM）和丁香酚（200 μM）。这种优越的保护效果通过显著降低视觉疾病严重程度和更好地维持光合色素得到证明，同时各种应激相关生物标志物（包括总黄酮类、花青素、酚类和木质素含量）也显著上调。重要的是，使用这些VOCs进行预处理，特别是Geraniol，显著减轻了氧化应激，如感染植物中MDA水平的显著降低所示。关键防御酶PAL的激活进一步证实了这些生化变化，表明预处理状态使得在病原体挑战时能够更快和更强地响应。代谢组学分析证实了这些发现，揭示了预处理植物中独特的防御相关代谢变化。重要的是，最显著和有效的防御反应，特别是在早期生化激活和氧化应激缓解方面，在感染后的第五天而不是第七天一致观察到，表明预处理效果快速且有效。尽管获得了重要见解，但这项研究仍存在某些局限性。该研究仅关注了三种特定的VOC及其在受控条件下的预优化浓度，表明需要更广泛地探索化合物、剂量以及在涉及更复杂相互作用的多样化田间环境中的验证。未来的研究应优先通过转录组学和蛋白质组学分析来研究VOC诱导预处理的分子基础，以确定涉及的具体基因和蛋白质。探索这些VOC的实际应用方法和配方，包括剂量优化、组合、时机以及与其他可持续农业实践的潜在协同效应至关重要。此外，评估预处理对生姜生长、产量和质量的长期影响在各种环境压力下的影响也将是有益的。这项研究的发现对社会具有重大意义，特别是对于印度南部的农业部门。生姜是一种主要的经济作物，其栽培受到PSR的严重影响，导致农民遭受重大经济损失。证明Geraniol在150 μM时可以有效用作预处理剂来对抗生姜的PSR，提供了一种可持续和环保的替代方案或补充传统化学杀菌剂的方法。这种方法符合减少农业中化学投入、促进更安全的食物生产和最小化环境污染的需求。通过为农民提供天然和有效的疾病管理工具，这项研究有助于提高作物产量、增强食品安全和增加生姜种植者的经济稳定性。它展示了在应对不断变化的疾病压力和气候变化挑战时，促进更具韧性的农业系统的可持续策略。