在温室和野外种植的十种桉树精油的特征分析

《Discover Plants》：Characterization of essential oils of ten eucalyptus species grown in the greenhouse and in the field

　　摘要
桉树属植物提取的精油在健康、农业及其他多个行业中具有广泛的应用。本研究旨在确定从十种桉树（属于桃金娘科Eucalyptus和Corymbia属）叶片中提取的精油中的主要成分。这些叶片分别来自田间栽培的成年植株和温室培育的幼苗，研究这些生长条件是否会影响精油的特征。精油通过水蒸馏法提取，其成分通过气相色谱-质谱（GC-MS）技术进行分析。结果显示，不同物种及田间和温室条件下提取的精油成分存在显著差异。研究结果与现有文献相符，进一步证实了桉树精油的多样性。所研究物种间的成分差异较大，这一现象在以往研究中也有体现。然而，该分析未考虑遗传物质、植株年龄等可能影响成分数量和多样性的其他因素。在田间种植的植株中，最丰富的活性化合物是桉叶醇（eucalyptol）和α-蒎烯（α-pinene）；而在温室种植的植株中，球果醇（globulol）含量较高。此外，球果醇和芳香萜烯（aromadendrene）在温室条件下更为常见，而α-蒎烯和桉叶醇则在田间条件下更普遍。桉树精油在健康、农业等多个领域具有广泛应用。

1 引言
对天然产品的兴趣在多个领域持续增长，推动了新药、农业投入品、化妆品等新产品的开发[1]。这一需求源于人们希望用更安全的替代品取代传统原材料，以保护人类健康和环境，同时应对日益严重的微生物抗药性问题以及缺乏有效防治措施的害虫和疾病问题。此外，天然产品为有机市场提供了有前景的解决方案，因为有机农业在病虫害管理方面受到诸多限制[2]。鉴于这些因素及其他挑战，近年来精油市场经历了显著增长，这得益于科学研究的扩展和实证发现的积累[3]。全球范围内，桉树精油的贸易量排名第三，仅次于橙油（Citrus sinensis L. Osbeck）和薄荷油（Mentha arvensis L.）[4]。桉树精油广泛应用于制药、口腔护理、驱虫剂、化妆品和个人护理、农用化学品和生物农药、食品工业以及家居和工业产品等多个领域[4]。桉树原产于澳大利亚，属于桃金娘科（Myrtaceae），该科包含超过700种桉树和Corymbia属植物[5]。Corymbia属曾被归类为桉树属的物种[6, 7]。

精油是脂溶性挥发性化合物，通过次生代谢产生，主要由萜类化合物构成[8]。这些化合物在生态系统中起着关键作用，如吸引传粉者和有益昆虫，以及抵御食草动物和病原体[9, 10]。桉树精油的主要成分是挥发性萜类（单萜和倍半萜）及芳香化合物[11]。Smith等人[12]报告称，在晚渐新世时期的琥珀中发现了单萜类化合物（包括莰烯、异莰烯、p-莰烯、芬酮、芬醇、樟脑、异松油醇和松油醇），表明这些防御相关化合物的生物合成机制在新生代时期就已经在植物界确立。精油的生物合成和储存部位因物种而异，可能发生在花朵、叶片、茎、根或果实中，精油储存在专门的分泌结构中[13]。在桉树中，精油主要在叶片中合成和储存[14]。分泌腔作为桃金娘科的特征，在不同物种间的分布和大小存在差异[15, 16]。遗传背景和环境条件显著影响芳香植物的代谢途径[17, 18]，进而影响精油的产量和成分组成。生物和非生物压力、气候变量、土壤肥力、农艺措施、植株年龄和物候阶段都是影响精油成分的关键因素[13, 19, 20, 21]。尽管已有大量研究探讨了桉树精油的成分，但只有少数物种得到了全面分析[3]。因此，本研究的目的是确定在田间（成熟植株）和温室（幼苗）条件下提取的十种桉树叶片精油中的主要成分，并评估遗传背景和生长环境对精油成分的影响。据我们所知，这是首次对来自两种不同生长条件的如此多物种进行此类研究的报道。

2 材料与方法
2.1 植物材料
从两个地点收集了十种桉树的新鲜叶片，代表不同的植株年龄（表1）。其中一个地点位于巴西皮拉西卡巴（Piracicaba-SP）的温室中（南纬22°42′12″，西经47°37′59″，海拔538米），属于湿润亚热带气候（K?ppen分类法中的Cfa向Cwa过渡类型），年平均温度为22°C，最高温度为35°C，最低温度为4°C，年降水量为1275毫米。这些物种的种子来自Sementes Cai?ara公司的克隆园（https://sementescaicara.com/）。种子在蛭石中发芽后移栽到300毫升的塑料盆中，当植株长出四片叶子时，再移植到含有有机土壤、粘土和粗砂（比例2:1:1）的10升塑料盆中。植株在温室中采用滴灌方式生长，并每周施用200毫升的营养液[22]。

表1 用于精油提取的桉树物种、采集地点及植株年龄

另一个采集地点位于巴西伊塔廷加（Itatinga-SP）的森林科学实验站（南纬23°10′，西经48°40′，海拔850米），属于Cwa气候（K?ppen分类法），年平均温度为20°C，最高温度为32°C，最低温度为3°C，年降水量为1350毫米。有关这些物种的信息（包括鉴定结果和存档的标本）详见补充资料（文件Suppl-species information）。植株年龄数据来源于伊塔廷加实验站的记录。该地区的土壤类型为贫瘠的红黄色红壤（Dystrophic Red-Yellow Latosol），质地为沙质。根据美国农业部土壤分类标准，这种土壤属于Oxisols类的Typic Haplorthox类型。

2.2 精油提取
从田间采集了十株植物的叶片，从温室采集了五株植物的叶片，然后将它们合并进行处理。从伊塔廷加实验站采集的新鲜叶片样本用剪刀快速剪成小块后置于液氮中冷冻；温室中的叶片样本同样先冷冻后冻干，再用研钵和研杵研磨。提取前，所有样本均保存在-80°C条件下。精油通过Clevenger型装置进行水蒸馏提取，每次提取使用50克新鲜叶片或25克冻干叶片，加入300毫升水。提取到的精油储存在小玻璃瓶中，置于-80°C的冷冻柜中待分析。精油产量的计算公式如下：
$$ {\text{Yield }}\left( \% \right) = \left( {\frac{{{\text{mass of essential oil obtained}}\left( {\text{g}} \right)}}{{{\text{mass of plant material}}\left( {\text{g}} \right)}}} \right) \times {100. $$

2.3 GC-MS分析
使用Shimadzu GCMS-QP2010 Plus仪器进行气相色谱-质谱（GC-MS）分析，以确定精油的化学成分。样品制备方法是将2微升精油溶解在200微升二氯甲烷中。色谱条件如下：分析柱Rtx-5MS（30米×0.32毫米，0.25微米）；载气为氦气，流速为3.0毫升/分钟；进样量为2.0微升；注射器分流比为1:5（E. globulus为1:10，E. saligna为1:100）；注射器温度为250°C；电子撞击（EI）模式，能量为70电子伏特；离子源温度为250°C；传输线温度也为250°C。 oven温度从60°C逐渐升高至220°C，升温速率为3°C/分钟。质谱检测器采用扫描模式（m/z范围40–600 Da），电子撞击电离方式。所有样品均进行重复进样。精油成分的鉴定通过将质谱数据与NIST标准库进行比对、与相同实验条件下注入的n-烷烃（C?–C??）的线性保留指数进行比较，以及参考科学文献中的数据来进行。包含n-烷烃（C?–C??）标准和精油分析结果的图表见补充材料文件Figs. 1S – 11S。

图1
GC-MS分析中鉴定出的化合物的PC1与PC2得分（A）和负荷（B）图。缩写说明：生长条件：Fi=田间条件，GH=温室条件；物种：Camal=E. camaldulensis，Dunni=E. dunni，Exser=E. exserta，Glob=E. globulus，Grand=E. grandis，Henryi=E. henryi，Pell=E. pellita，Resin=E. resinífera，Sali=E. saligna，Urop=E. urophylla；鉴定出的化合物：C1：(–)-cis-Sabinol，C2：(–)-delta-Cadinol，C3：(–)-Spathulenol，C4：(+)-Aromadendrene，C5：1,1,7-Trimethyl-4-methylenedecahydro-1H-cyclopropa(e)azulene，C6：4-Methylenecyclohexylmethanol，C7：4-terpinenyl acetate，C8：Acetate de 4-terpinenil，C9：Agarospirol，C10：Alloaromadendrene，C11：Biciclogermacreno，C12：Bulnesol，C13：?-Cadinene，C14：Canphene，C15：Caryophyllene，C16：Caryophyllene oxide，C17：?-Cedren-9-α-ol，C18：Cubenol，C19：Cyclopentene,4-ethenyl-1,5,5-trimethyl，C20：Cymene，C21：delta-Cadinene，C22：D-Limonene，C23：Elemol，C24：Epiglobulol，C25：Eucalyptol，C26：Eudesm-7(11)-em-4-ol，C27：?-Eudesmol，C28：Geranyl acetate，C29：Globulol，C30：Guaiol，C31：Humulano-1,6-dien-3-ol，C32：?-Humulene，C33：Isoborneol，C34：Ledol，C35：L-Pinocarveol，C36：?-Myrcene，C37：Myrtenal，C38：Myrtenol，C39：o-Cymene，C40：?-Pinene，C41：Pinocarvone，C42：t-Cadinol，C43：Terpinen-4-ol，C44：Terpineol，C45：Terpinyl acetate，C46：Terpinyl formato，C47：Tetrahydroactinidiolide，C48：t-Muurolol，C49：Trans-Longipinocarveol，C50：trans-Pinocarveol，C51：Viridiflorene，C52：Viridiflorol，C53：α-Eudesmol，C54：α-Fhenchyl methyl ether，C55：α-Muurolene，C56：α-Phellandrene，C57：α-Pinene，C58：α-Terpineol，C59：Α-terpineol acetate，C60：α-Tujeno，C61：γ -Gurjuneno，C62：γ-Eudesmol，C63：γ-Muurolene，C64：γ-Muurolene

2.4 数据分析
使用Minitab 17软件（Minitab Inc.，中国上海）进行主成分分析（PCA），以确定最能解释数据集变异性的变量（化合物和生长条件）。仅使用已鉴定的化合物进行该分析，相关结果见补充资料PCA Table 21S。

3 结果与讨论
3.1 桉树精油的产量
田间采集的样品精油产量范围为0.16%（E. henryi）至1.08%（E. exserta）（按鲜重计算）。温室种植的样品精油产量基于冻干干物质计算，范围为0.04%（E. camaldulensis）至0.67%（E. dunnii）（表2）。总体而言，尽管田间采集的样品在提取前未经过干燥处理，但大多数物种的精油产量仍高于温室种植的样品。假设平均叶片含水量为50-60%，那么从田间样本中提取的精油产量（以干重为基础计算）大约会翻倍。然而，C. henryi是一个例外，其温室样本的精油产量是田间样本的两倍多。表2显示了十种桉树的精油产量。

精油产量可能会有显著差异。Healey等人[21]从E. saligna中提取的精油产量为0.38%，而Saulle等人[23]得到的产量为1.03%；在本研究中，田间样本的产量为0.22%。Salem等人[20]也注意到精油产量的变化，他们从E. globulus的不同生长阶段提取了精油，发现结果有所不同：结果最高的产量出现在果实形成期（0.32%），而开花期和营养生长期分别为0.14%和0.11%。Tine等人[24]对塞内加尔六个不同地点的E. camaldulensis进行了研究，发现精油产量范围从0.33%到4.35%不等。正如之前所述，这些差异可能是由于遗传材料、气候条件、树木和叶片年龄、采集时间和季节、精油提取方法、储存条件以及用于提取的植物部位的不同所致[13, 19, 21]。后者受到分泌腔数量和大小的影响[23]。Lee等人[25]发现桉树中腺体的数量、大小和密度与精油含量的变化有关。

需要强调的是，本研究中使用了不同的遗传材料和不同年龄的植物。温室种植的植物来自Sementes Cai?ara克隆园提供的种子（https://sementescaicara.com/），而Itatinga实验站的植物则来自该站自身的种子（E. saligna）、位于巴西圣保罗州的Anhembi实验站（E. camaldulensis、E. dunnii、E. grandis、E. pellita、E. resinifera和E. urophylla）、葡萄牙（E. globulus）以及澳大利亚（E. henryi）。E. exserta的种子来源无法明确。此外，田间和温室种植植物的生长环境也有所不同，田间的环境变化更为明显。所有这些因素都会影响精油的定量和定性特性。

3.2 精油成分

不同物种之间的精油成分存在显著差异，即使是同一物种的不同植株，在不同栽培地点也有差异。在本研究中，检测到的峰数因桉树种类、采集地点和植物年龄而异。为了识别目的，只考虑了面积等于或大于1%的峰，尽管所有检测到的化合物的完整列表在补充材料文件中提供。这种识别是通过交叉参考现有信息实现的，但在某些情况下，可能需要使用红外光谱或核磁共振等更精确的技术来进行更准确的化合物鉴定[26]。

在分析的二十种精油中（每种物种两种精油），各成分的峰面积范围为68.51%到100%。下表仅列出了三种主要成分及其保留时间（RT，单位分钟）、峰面积百分比、与NIST数据库的相似度百分比以及线性保留指数（LRI）。LRI与Kováts指数类似，但与Kováts指数不同的是，LRI是在程序控制的柱温条件下计算的，这提高了当材料中存在光谱非常相似的化合物时成分鉴定的可靠性[27]。

在田间采集的E. camaldulensis植株中检测到28个峰，其中分析了18个（占总面积的93.58%），并鉴定了16个（占总面积的82.36%）（见补充表1S）。在鉴定出的成分中，53.69%是单萜类（其中31.41%是烃类，22.28%是含氧化合物），28.67%是倍半萜类（其中4.11%是烃类，24.56%是含氧化合物）。α-蒎烯、β-蒎烯和globulol是主要成分，占总面积的40.31%（表3）。在温室采集的样本中，最丰富的萜类是桉叶醇、α-萜品醇和globulol（占总面积的38.57%）（表3）。在该样本中检测到65个峰，其中分析了19个（占总面积的87.68%），并鉴定了18个（占总面积的86.16%）。在鉴定出的成分中，50.55%是倍半萜类（其中10.04%是烃类，40.51%是含氧化合物），35.61%是单萜类（其中2.01%是烃类，33.60%是含氧化合物）（见补充表2S）。

这些初步结果已经证实，精油是复杂的混合物，含有不同数量的成分——其中一些成分的浓度相对较高，可能决定了精油的生物特性[9]。以E. camaldulensis为例，田间植株精油中的三种主要成分与温室植株中的完全不同。为了比较，表4汇总了其他研究人员在不同地点获得的E. camaldulensis精油中的三种主要成分，进一步证实了其精油成分的显著差异。

在田间采集的E. dunnii叶片样本中（表5），精油中的三种主要成分是桉叶醇（48.34%）、萜品醇（13.17%）和α-蒎烯（12.34%）。相比之下，在温室种植的植株样本中（表5），主要成分是globulol（21.81%）、萜品醇（10.70%）和viridiflorol（9.33%）。在田间采集的E. dunnii植株样本中检测到27个峰，其中分析了8个并进行了鉴定，占总峰面积的91.69%（见补充表3S）。在鉴定出的成分中，73.85%是单萜类（其中12.34%是烃类，61.51%是含氧化合物），17.84%是倍半萜类（其中4.12%是烃类，13.72%是含氧化合物）。

在温室种植的E. dunnii植株中检测到47个峰，其中分析了17个（占总峰面积的90.33%），并鉴定了16个（占总峰面积的88.69%）。在鉴定出的成分中，70.60%是倍半萜类（其中16.06%是烃类，54.54%是含氧化合物），18.09%是含氧单萜类（见补充表4S）。萜品醇是田间和温室样本中唯一的共同成分。表6汇总了有关该物种的文献数据。

在田间采集的E. exserta叶片样本中（表7），三种最丰富的活性成分是桉叶醇（40.80%）、α-蒎烯（24.29%）和（–)-cis-sabinol（6.78%）。而在温室采集的样本中（表7），主要成分是萜品醇（12.04%）、桉叶醇（10.52%）和（–)-cis-sabinol（8.69%）。在田间植株中检测到17个峰（见补充表5S），其中分析了9个（占总面积的95.59%），并鉴定了8个（占总面积的92.42%）。在鉴定出的成分中，92.42%是单萜类（其中32.21%是烃类，60.21%是含氧化合物）。

在温室种植的E. exserta植株中检测到72个峰，其中分析了22个（占总峰面积的85.93%），并鉴定了18个（占总峰面积的74.96%）。在鉴定出的成分中，48.69%是单萜类（其中1.92%是烃类，46.77%是含氧化合物），26.27%是倍半萜类（其中8.70%是烃类，17.57%是含氧化合物）。关于在突尼斯采集的E. exserta植物的精油，仅有一篇参考文献[47]，其中三种主要成分是桉叶醇（69.3%）、spathulenol（12.0%）和d-piperitone（10.0%）。

在田间采集的E. globulus样本中检测到16个峰，其中分析了6个并进行了鉴定，占总面积的95.05%（见补充表7S）。在鉴定出的成分中，90.84%是单萜类（其中16.23%是烃类，74.61%是含氧化合物），4.21%是倍半萜类烃类。

在温室种植的E. globulus植株中检测到45个峰，其中分析了14个（占总面积的88.84%），并鉴定了13个（占总面积的87.21%）（见补充表8S）。在鉴定出的成分中，72.48%是单萜类（其中14.31%是烃类，58.17%是含氧化合物），14.83%是含氧单萜类。田间植株中的三种主要活性成分是桉叶醇（67.57%）、α-蒎烯（16.23%）和萜品醇（5.32%）；温室植株中的主要成分是globulol（24.84%）、viridiflorol（12.25%）和（+)-aromadendrene（8.81%）（表8）。

Salem等人[20]评估了不同生长阶段E. globulus精油的化学成分，发现营养生长期的主要成分是桉叶醇（13.2%），而在全开花和结果期，主要成分是p-桉叶烯，其含量分别为32.2%和37.8%。总体而言，在三个生长阶段中，单萜类烃类的含量增加（54.1–65.1–72.8%），而含氧单萜类和含氧倍半萜类的含量减少（34.0–29.9%–23.6%）；倍半萜类烃类的含量变化不大（0.26–0.10–0.13%）。研究还发现，从营养生长期采集的叶片中提取的精油对多种细菌菌株具有最强的抗菌活性。表9汇总了关于E. globulus精油主要成分的文献数据。

关于E. globulus和E. camaldulensis精油的研究更为丰富，因为这两种物种是最常用于生产药用精油的[4, 13]。

在田间采集的E. grandis叶片样本中（表10），三种主要成分是α-蒎烯（25.33%）、o-桉叶烯（12.97%）和桉叶醇（6.72%）。而在温室采集的样本中（表16），最丰富的成分是萜品醇（11.39%）、（+)-aromadendrene（10.82%）和isoborneol（9.08%）。

在田间采集的E. grandis叶片样本中检测到42个峰（见补充表9S），其中分析了18个（占总面积的90.89%），并鉴定了14个（占总面积的78.11%）。在鉴定出的成分中，73.25%是单萜类（其中41.79%是烃类，31.46%是含氧化合物），4.86%是含氧倍半萜类。在温室种植的E. grandis样本中（见补充表10S），检测到63个峰，其中分析了23个（占总面积的88.95%），并鉴定了17个（占总面积的68.51%）。在鉴定出的成分中，41.06%是单萜类（其中1.94%是烃类，39.12%是含氧化合物），27.45%是倍半萜类（其中19.66%是烃类，7.79%是含氧化合物）。表11汇总了关于不同地区种植的E. grandis精油的主要成分的文献数据。

在南非种植的新鲜和干燥叶片中提取的E. grandis精油中，两种精油成分有所不同[65]。新鲜叶片油中的三种主要成分是α-蒎烯（29.6%）、p-桉叶烯（19.8%）、桉叶醇（12.8%）和α-萜品醇（6.4%）；干燥叶片油中的三种主要成分是桉叶醇（47.4%）、柠檬烯（13.3%）、α-蒎烯（7.5%）和spathulenol（7.1%）。这些结果清楚地表明，叶片干燥过程改变了精油的成分和浓度。在本研究中也观察到了类似的模式；然而，植物年龄和生长条件等其他因素也起到了作用。一些作者提出，干燥过程可能带来某些益处，例如减少微生物生长、抑制特定的生化反应，以及由于糖基化形式的分解、脱水和氧化反应，或者植物细胞破裂（其中储存了挥发性化合物）而增加挥发性化合物的浓度[65]。在野外采集的C. henryi叶片样本中（表12），三种最丰富的活性化合物是α-蒎烯（49.60%）、4-萜品烯乙酸酯（11.87%）和β-蒎叶烯（10.92%）。相比之下，在温室中采集的样本中（表12），主要化合物是bulnesol（22.26%）、guaiol（12.96%）和β-香叶烯（6.91%）。表20汇总了关于C. henryi物种的文献数据。

在野外采集的C. henryi叶片中，共检测到25个峰，其中11个被分析（占总面积的93.5%），10个被鉴定（占总面积的92.41%）。在鉴定出的成分中，78.12%是单萜类（64.55%为碳氢化合物，13.57%为含氧化合物），15.69%是含氧倍半萜类（见补充表11S）。在温室种植的植物叶片中，共检测到76个峰，其中19个被分析（占总面积的85.35%），17个被鉴定（占总面积的79.85%）。在鉴定出的成分中，74.15%是倍半萜类（17.87%为碳氢化合物，56.28%为含氧化合物），5.70%是含氧单萜类（见补充表12S）。

据我们所知，只有一份报告包含了关于C. henryi叶片油成分的信息。Reyes等人[66]鉴定出桉叶醇（41.8%）、elemol（13.1%）和α-桉叶素（10.5%）是这种在巴西种植的物种叶片精油中的主要成分。

在野外采集的E. pellita叶片样本中（表13），三种最丰富的活性化合物是α-蒎烯（47.23%）、桉叶醇（8.64%）和β-蒎烯（6.04%）。相比之下，在温室中采集的样本中（表13），主要化合物是(+)-芳香倍半萜烯（12.32%）、萜品醇（8.22%）和globulol（5.46%）。

野外采集的E. pellita叶片显示有34个峰（见补充表13S），其中13个被分析（占总面积的92.35%），11个被鉴定（占总面积的88.50%）。在鉴定出的成分中，84.12%是单萜类（59%为碳氢化合物，25.12%为含氧化合物），6.03%是倍半萜类（3.22%为碳氢化合物，2.81%为含氧化合物）。在温室种植的E. pellita叶片中，共检测到68个峰（见补充表14S），其中25个被分析（占总面积的84.46%），22个被鉴定（占总面积的81.11%）。在鉴定出的成分中，51.11%是倍半萜类（29.82%为碳氢化合物，21.29%为含氧化合物），30%是单萜类（1.85%为碳氢化合物，28.15%为含氧化合物）。表14汇总了关于E. pellita物种的文献数据。

在野外采集的E. resinifera叶片样本中（表15），三种主要成分是桉叶醇（52.15%）、α-蒎烯（18.96%）和萜品醇（6.50%）。在温室中采集的样本中（表15），最丰富的化合物是桉叶醇（30.27%）、L-蒎叶醇（10.69%）和α-蒎烯（6.85%）。

野外采集的E. resinifera精油共有24个峰（见补充表15S），其中9个被分析（占总面积的93.24%），8个被鉴定（占总面积的92.15%）。在鉴定出的成分中，87.02%是单萜类（18.96%为碳氢化合物，68.06%为含氧化合物），5.13%是倍半萜类（2.82%为碳氢化合物，2.31%为含氧化合物）。在温室中采集的E. resinifera样本中，共检测到61个峰，其中15个被分析并鉴定，占总面积的87.98%（见补充表16S）。在鉴定出的成分中，67.44%是单萜类（6.85%为碳氢化合物，60.59%为含氧化合物），20.54%是倍半萜类（10.20%为碳氢化合物，10.34%为含氧化合物）。表16汇总了关于不同地区种植的E. resinifera物种的文献数据。

在野外采集的E. saligna叶片样本中（表17），三种最丰富的活性化合物是o-蒎烯（86.24%）、桉叶醇（5.28%）和α-蒎烯（2.74%）。相比之下，在温室中采集的样本中（表17），主要成分是viridiflorol（14.87%）、globulol（13.12%）和(+)-芳香倍半萜烯（10.53%）[71]分析了E. saligna在不同生长阶段的油成分。在营养生长阶段，主要成分是p-蒎烯和γ-萜品烯；而在开花阶段，α-蒎烯和p-蒎烯是最具代表性的化合物。

表17S（见补充材料）展示了野外采集的E. saligna的数据。共检测到6个峰，全部被分析并鉴定，占总面积的100%。在鉴定出的成分中，95.86%是单萜类（88.98%为碳氢化合物，6.88%为含氧化合物），4.14%是倍半萜类（1.87%为碳氢化合物，2.27%为含氧化合物）。在温室种植的E. saligna叶片中，共检测到43个峰（见补充表18S），其中18个被分析（占总面积的91.97%），15个被鉴定（占总面积的75.44%）。在鉴定出的成分中，66.98%是倍半萜类（19.57%为碳氢化合物，47.41%为含氧化合物），8.46%是单萜类（1.05%为碳氢化合物，7.41%为含氧化合物）。表18汇总了不同地区种植的E. saligna物种的文献数据。

在野外采集的E. urophylla叶片样本中（表19），三种最丰富的化合物是桉叶醇（41.41%）、萜品烯乙酸酯（16.47%）和α-蒎烯（11.06%）；而在温室中采集的样本中（表19），主要化合物是萜品烯乙酸酯（13.27%）、(+)-芳香倍半萜烯（12.53%）和桉叶醇（8.66%）。

对野外采集的E. urophylla样本的分析显示共有17个峰，其中14个被分析并鉴定，占总面积的97.85%（见补充表19S）。在鉴定出的成分中，88.38%是单萜类（24.41%为碳氢化合物，63.97%为含氧化合物），9.47%是倍半萜类（2.53%为碳氢化合物，6.94%为含氧化合物）。在温室中采集的E. urophylla样本中，共检测到70个峰（见补充表20S），其中22个被分析（占总面积的85.61%），19个被鉴定（占总面积的81.15%）。在鉴定出的成分中，51.64%是倍半萜类（26.19%为碳氢化合物，25.45%为含氧化合物），29.51%是单萜类（1.08%为碳氢化合物，28.43%为含氧化合物）。表20汇总了关于不同地区种植的E. urophylla物种的文献数据。

为了更好地理解生长条件（野外和温室）和物种间的差异，使用鉴定出的化合物进行了主成分分析（完整数据集见补充PCA表21S）。PC1和PC2共同解释了43.7%的总方差（图1）。六个温室种植的物种——E. dunni、E. globulus、E. camaldulensis、E. saligna、E. pellita和E. urophylla——与野外种植的物种明显分离（图1A）。这种分离主要由化合物C4（(+)-芳香倍半萜烯）、C10（异芳香倍半萜烯）、C24（Epiglobulol）、C27（?-桉叶素）、C29（Globulol）、C34（Ledol）、C51（Viridiflorene）、C52（Viridiflorol）和C53（α-桉叶素）驱动（图1B），这些化合物主要存在于温室植物中，尤其是C4、C10、C24和C29（见补充PCA表21S）。

在温室中种植的E. henryi形成了一个独特的组，与其他所有物种和处理方式分离。这是由于这种物种在温室条件下仅含有化合物C9（Agarospirol）、C12（Bulnesol）、C13（?-香叶烯）、C23（Elemol）、C30（Guaiol）、C48（t-Muurolol）和C55（α-Muurolene）（见补充PCA表21S）。桉叶醇（C25）是在所有物种和两种生长条件下都检测到的唯一精油成分。萜品醇（C44）和α-蒎烯（C57）也存在于大多数物种和两种生长条件下（见补充PCA表21S）。

尽管本研究采用了经典的GC-MS方法来表征桉树叶片精油，但这是首次报告在两种不同环境条件下种植的十个物种的数据。根据获得的结果，可以观察到从不同物种提取的精油在化学成分上存在显著差异，即使在同一物种中，来自不同环境和不同年龄的精油也存在差异，这证实了文献中的报道。对于某些物种，野外种植和温室种植的植物之间的精油有明显差异。因此，精油中成分的数量和类型直接影响它们所促进的生物活性[13, 20, 78]。

对温度和降水对Eucalyptus salmonophloia、Eucalyptus torquata、Eucalyptus lesouefii和Eucalyptus astringens（这些物种在此研究中未涉及）的精油产量和成分（挥发性谱）的影响进行了评估，结果显示干旱条件增加了挥发性精油的提取产量[18]。此外，较高的温度和较少的降雨有利于某些化合物（如1,8-桉叶油醇和α-蒎烯）的积累，同时减少了其他化合物（如spathulenol和viridiflorol）的水平。因此，可以合理预期，在本研究中分析的物种的精油成分在温室和野外两种采样环境之间会有显著差异。在温室条件下，光照可用性较低，植物不会受到水分胁迫，因为它们每天都会被灌溉。相比之下，野外种植的植物经历更高的光照强度以及偶尔的寒冷和干燥期。位于巴西圣保罗州Itatinga市的森林科学实验站海拔约850米，属于Cwa气候类型（K?ppen分类），年平均温度为20°C，平均最高和最低温度分别为32°C和3°C，年降水量约为1350毫米。

本研究中分析的桉树在年龄上也存在差异，这可能影响了它们的精油成分。一项针对E. globulus的研究表明，精油成分随物候阶段而变化[20]。识别出两种不同的化学类型：一种以1,8-桉叶油醇（13.23%）为特征，属于营养生长阶段；另一种则以p-蒎烯为主，主要出现在开花（32.19%）和结果（37.82%）阶段。在结果期间，单萜类碳氢化合物占主导地位，其中p-蒎烯和α-蒎烯是主要成分。

尽管精油成分存在差异，但桉叶醇是大多数桉树物种中的主要成分，这一点在本研究和之前的报告中都有观察到[14, 70]。这种化合物为精油增添了价值，因为它是其主要生物活性成分之一，因此在药用精油中具有重要的商业价值。英国药典规定，药用级精油中的桉叶醇含量必须超过70%，并且几乎不含α-或β-蒎叶醇[79]。然而，也有研究报道了从桉叶醇含量较低的物种中提取的精油具有生物活性[13, 47, 80]。

表21总结了每种桉树物种在野外和温室条件下采集的精油中三种最丰富的成分，以便于评估这些活性化合物在物种间的分布。在两种生长条件下（野外和温室）评估的10个物种中，共有17种成分被发现是最丰富的。在野外生长的成年植物中观察到了最高的成分浓度，这可能与较高的光照强度有关，因为许多挥发性萜类化合物是在叶绿体中合成的[81]，而且已知成熟的叶子是植物中萜类化合物最丰富的来源[82]。在野外生长的植物中，最丰富的活性化合物是桉叶醇，存在于五种桉树（E. dunnii、E. exserta、E. globulus、E. resinifera 和 E. urophylla）中。其次是α-蒎烯，存在于三种桉树（E. grandis、E. henryi 和 E. pellita）中。而在温室中生长的植物中，globulol 在三种桉树（E. camaldulensis、E. dunnii 和 E. globulus）中占主导地位。此外，有些成分在两种生长条件下都存在，但在其中一种条件下更为普遍，例如在温室条件下globulol和芳香萜烯，在野外条件下则是α-蒎烯和桉叶醇。还有一些成分仅存在于单一物种和单一生长条件下，例如在温室中生长的E. henryi中的bulnesol、guaiol和β-卡丁烯。

结论：所研究物种之间的差异显著，这种模式与之前的研究结果一致（如前表所示）。然而，这种比较并未考虑到其他影响因素，如遗传物质、植物年龄以及可能影响成分数量和多样性的其他变量。此外，温室中生长的植物与野外生长的植物存在显著差异，这表明环境对桉树精油成分的影响非常重要。文献中关于影响精油成分的因素仍存在争议，这突显了植物生理、解剖结构与环境因素之间的复杂关系[83]。尽管人们认识到环境的影响，但次生代谢的变异模式可能是器官特异性的[84]和物种特异性的[85]，这表明特定的遗传变异会影响次生代谢产物的浓度。