关于印度西高止山脉特有且极度濒危的树种Nothopegia castaneifolia种子萌发的实验研究

《Discover Plants》：Experimental studies on seed germination of Nothopegia castaneifolia an endemic & critically endangered tree of the Western Ghats, India

　　摘要：Nothopegia castaneifolia (Roth) Ding Hou（漆树科）是一种极度濒危的树种，其分布范围极为狭窄，仅限于印度生物多样性热点地区——西高止山脉的半常绿和常绿森林中。由于其种子具有高度抗性，加之自然种群数量的减少，因此开展异地保护策略对于恢复其种群至关重要。本研究评估了多种播种前处理方法（包括H2SO4刻痕处理、500和1000 ppm浓度的GA3处理以及热水处理）对种子发芽率的提升效果。结果表明，H2SO4刻痕处理（3分钟，发芽率为80.0±2.3%）和GA3处理（500–1000 ppm，发芽率分别为75.0±2.0%和72.0±2.1%）最为有效，这一结论通过ANOVA和Tukey的HSD分析得到了验证。这些发现表明，H2SO4刻痕处理和GA3处理能够有效打破种子的休眠状态并促进发芽，从而支持Nothopegia castaneifolia的异地保护工作。

1. 引言
Nothopegia属植物属于漆树科（Anacardiaceae），在全球范围内共有10个被认可的物种[11]。在印度，已记录有8个物种和2个变种[5]，其中仅N. castaneifolia (Roth) Ding Hou分布于马哈拉施特拉邦[14]。先前被列为独立物种的Nothopegia racemosa Dalzell现在被认为与N. castaneifolia属于同一物种[11, 13, 9]。该物种被评估为极度濒危[8, 18]，其分布主要局限于西高止山脉，也在东高止山脉的部分地区有发现（见图4）。在当地，这种植物被称为“Amberi”，在马拉地语中意为“类似芒果的外观”。该物种具有重要的生态和民族植物学价值，其野生可食用果实传统上被用于腌制或直接食用，对当地饮食和文化具有重要意义[17]。尽管已有研究表明其他Nothopegia属物种为印度特有物种并给出了具体的数量估计[12]，但关于N. castaneifolia的详细生态数据仍然缺乏，这凸显了保护的紧迫性。

2. 材料与方法
2.1 实验地点
本研究于2024-2025年在印度植物调查局西区中心的实验园进行，位于北纬18°32′10.09″、东经73°53′6.27″。该地区属于西高止山脉，气候湿润（湿度30-40%）。实验时间从3月持续到7月（见图1），平均气温在19.1至34.5°C之间。实验样本BSI 211228和BSI 211229保存在印度植物调查局的标本馆中。

2.2 处理方法
2024年3月，从辛杜杜尔格县Sawantwadi区和Kolhapur县的Radhanagari地区采集了成熟的N. castaneifolia果实（见图2a-c）。种子采集期为3月至5月，采集后手动去核以观察其形态和种脐位置。实验采用完全随机设计（CRD），每种处理使用100粒种子，每个处理重复4次，每次重复25粒种子（共100粒种子）。发芽盘内分别填充土壤、沙子和椰壳纤维以观察发芽反应。为确保充足的空气流通和良好的排水性，在填充培养基前在盘子上打孔。处理完成后，将种子以1厘米的深度植入盘中，然后分别覆盖一层薄土、沙子和椰壳纤维。每隔一天浇水一次，所有处理的灌溉频率和水量保持一致，使用自来水进行灌溉。具体的种子处理方法如下：

2.3 播种前处理（表1）
表1列出了各种处理方法：
- T1：未经处理的种子（对照组），直接播种。
- T2：自来水浸泡24小时后再播种。
- T3：自来水浸泡48小时后再播种。
- T4：热水处理5分钟后再浸泡24小时后再播种。
- T5：热水处理5分钟后浸泡24小时后再播种。
- T6：浓硫酸（H2SO4）处理3分钟后再播种。
- T7：浓硫酸（H2SO4）处理5分钟后再浸泡5-10分钟并用流水冲洗后再播种。
- T8：浓硫酸（H2SO4）处理7分钟后再播种。
- T9：赤霉素（GA3）500 ppm处理24小时后再播种。
- T10：赤霉素（GA3）1000 ppm处理24小时后再播种。
- T11：硝酸钾（KNO3）1%溶液处理24小时后再播种。

2.4 统计分析
使用Abdul Baki和Anderson提出的公式计算发芽率和幼苗活力指数[1]：
$$
{\text{发芽率}} = \left( {\text{发芽种子数}}/{\text{总播种种子数}} \right) \times 100\%
{\text{幼苗活力指数}} = {\text{幼苗平均长度}} \times {\text{发芽率}
$$
通过单因素ANOVA（p≤0.05）确定处理组间发芽率的显著差异，并进一步应用Tukey的HSD检验确定具体哪些处理之间存在差异。

3. 观察结果
3.1 发芽类型
N. castaneifolia采用地下发芽方式，即胚芽在幼苗发育过程中始终位于土壤表面以下，作为主要营养来源，直到真叶长出；与此同时，上胚轴伸长并产生第一片光合作用叶片。

3.2 发芽过程
- （a）吸水：种子吸收水分导致种皮膨胀，产生压力。
- （b）根系形成：种子的胚端产生根系，固定在土壤中，标志着发芽的开始。
- （c）根系发育：根系伸长并形成侧根，胚芽保持在地下，受到种皮保护，避免干燥或被天敌侵害。
- （d）上胚轴伸长：上胚轴活跃生长并向上延伸，下胚轴几乎不伸长。
- （e）子叶出土：子叶出土，形成第一片绿色、具有光合作用能力的真叶，标志着幼苗的自养阶段。
- （f）幼苗成熟：随着养分储备的消耗，幼苗的根系扩展，叶片增多。

3.3 种子特性
N. castaneifolia种子呈球形，颜色为浅棕色，种皮厚且富含软骨质。

4. 结果与讨论
ANOVA和Tukey的HSD检验（表4、5）显示，处理方法对打破种子休眠状态有显著影响。H2SO4处理3分钟的种子发芽率最高（80.0±2.3%），是最有效的破壳方法。GA3处理500 ppm（T9）和1000 ppm（T10）的发芽率也分别为75.0±2.0%和72.0±2.1%，表明赤霉素有助于促进胚胎生长并克服生理障碍。KNO3（T11，62.0±2.0%）、H2SO4处理5分钟（T7）以及热水处理（T4、T5）的发芽率也较好，但效果低于3分钟酸处理或GA3处理。长时间浸泡（T2、T3）和未经处理的对照组（T1）的发芽率较低（40-52%），而长时间酸处理（H2SO4处理7分钟，T8）进一步降低了发芽率（32.0±1.9%），可能是由于种子受损所致。总体而言，发芽成功率受处理类型和持续时间的影响显著。短时间酸处理或GA3处理是提高发芽效果的最佳方法。这些方法为保护和恢复工作中的种子繁殖提供了明确的选择。表4 不同处理方法下的发芽率单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）完整表格表5 不同处理方法下的种子发芽率（平均值±标准误差）及Tukey’s HSD分组完整表格4.1 播种前处理对发芽的影响（图3a）共测试了十种播种前处理方法，以评估它们对种子发芽行为的影响，包括发芽启动时间、发芽率、平均发芽时间（MGT）和幼苗表现。未经处理的对照组（T1）显示发芽延迟，大约在播种后22天开始发芽，发芽率低至40%，平均发芽时间较长（MGT），表明由于存在休眠现象，发芽过程缓慢且不均匀（图1h, i）。浸泡处理（T2至T5）显示出中等程度的改善。用自来水浸泡24小时的种子（T2）在大约20天开始发芽（图3b），发芽率为52%，尽管MGT仍然较高。T3（自来水浸泡48小时）和T5也有轻微改善，发芽率均在50-52%左右，均匀性有所提高。用温水浸泡12小时（T4）使发芽率略微提高到54%，但并未显著缩短MGT。这些结果表明，吸水有助于打破休眠，但单独使用可能不足以实现快速或高发芽率。图3该图像的替代文本可能是通过AI生成的。完整图像a 图显示处理方法与发芽率的关系。b 图显示按处理方法划分的发芽启动天数。c 图显示处理方法与幼苗活力指数的关系最有效的处理方法是T6，即种子用浓硫酸（H2SO4）处理3分钟（图1a）。这种处理方法获得了最高的发芽率（80%），发芽仅用了10天，并且平均发芽时间最短，表明发芽快速且均匀。酸刻蚀有效地软化了对种子硬壳的阻碍，从而促进了水分吸收和胚的膨胀。然而，长时间暴露于酸中会导致种子损伤。在T7（5分钟H2SO4）中，虽然发芽也较早开始（约10天），但发芽率下降到55%，并且观察到一些种子损伤（图1c）。T8（7分钟H2SO4）由于过度处理，发芽率进一步下降到32%（图1b），降低了种子的活力。这表明虽然酸刻蚀有效，但时间控制至关重要，以避免胚受到伤害。生长调节剂处理也显示出了有希望的结果。用赤霉素（GA3）以250 ppm（T9）和500 ppm（T10）处理的种子在大约18天开始发芽，发芽率分别为75%和72%，平均发芽时间适中。这些处理方法产生了健康的幼苗，并增强了茎的生长和活力，表明激素对种子代谢和早期生长有积极影响。硝酸钾（T11）也促进了早期发芽（约15天），发芽率为62%，平均发芽时间较短。虽然不如T6、T9和T10有效，但T9和T10对提高幼苗质量有益（图4）。图4该图像的替代文本可能是通过AI生成的。完整图像Nothopegia castaneifolia（Roth）Ding Hou关于生长介质，椰糠和土壤被发现是最佳的播种介质（图1e, f）。它们提供了良好的通气性、均匀的保水性和适当的排水性，共同支持了幼苗的健康出土和根系发育。沙子在发芽初期也表现良好，因为其具有优良的排水性并降低了真菌生长的风险。然而，在叶片扩展阶段后，幼苗生长明显减缓（图1d）。这种下降可能是由于沙子的养分保持能力较低，无法在早期阶段之后提供足够的养分来支持幼苗的持续发育。当与最佳处理方法（T6）结合使用时，椰糠介质实现了最快和最均匀的发芽。总之，3分钟酸刻蚀（T6）是提高发芽率的最有效播种前处理方法，而椰糠和土壤是支持幼苗发育的理想生长介质。随后将幼苗转移到生长袋中（图1g）进行进一步生长和适应。5 讨论未经处理的种子对照组（T1）表明，播种前处理增强了发芽率和幼苗活力。未经处理的种子发芽率仅为40%，幼苗活力指数（SVI）较低。大多数处理方法显著改善了这些参数。T6处理效果最好，发芽率是对照组的两倍（80% vs 40%），幼苗长度是对照组的两倍（18厘米 vs 9厘米），SVI是对照组的四倍（1440 vs 360）（图3c）。这表明该处理成功打破了休眠并促进了幼苗生长，因此非常适合繁殖。同样，T9和T10也优于对照组，SVI提高了近三倍。T2、T3、T4、T5和T6处理显示出中等但持续的改善，表明有一定的效果。T8的处理效果最差，发芽率较低（32% vs 40%），活力指数也最低（256），这表明该处理可能损害了种子的活力或不适合该物种。这些发现证实了Abdul-Baki和Anderson [1] 的先前研究，强调了种子活力不仅是发芽的指标，也是幼苗表现的指标。同时改善这两个方面的处理方法对于异地保护和大规模种植特有树木至关重要，因为快速均匀的建立是必不可少的。根据Baskin和Baskin [3] 的研究，在Anacardiaceae科的种子中，休眠与内果皮解剖结构密切相关。大多数属具有非休眠（ND）或生理休眠（PD），以及物理休眠（PY）和组合休眠（PY + PD）。具有PD的种子通常会对赤霉素（GA3）的应用或温冷层积等处理作出反应，这些处理可以刺激胚的生长并克服生理障碍。具有PY的种子需要机械刻蚀来破坏不透水的内果皮，以便吸水。在PY + PD的情况下，需要结合刻蚀和冷层积才能实现发芽。然而，目前没有关于Nothopegia castaneifolia休眠的公开文献。从我们的实验来看，如用浓硫酸处理3分钟（T6）获得了最高的发芽率（80%）和最快的平均发芽时间，表明打破种皮屏障对发芽至关重要。这表明Nothopegia castaneifolia具有物理休眠（PY），并且没有已知的发芽研究或实验。6 结论Nothopegia castaneifolia是一种极度濒危的树木，仅分布于印度西高止山脉，其种群主要集中在马哈拉施特拉邦和卡纳塔克邦的Sahyadri山脉地区。其保护状况主要受其狭窄的地理分布和特定生境要求的影响，这些生境位于热带湿润落叶林和半常绿林中[8, 10]。最近的研究偶尔将其分布范围扩展到Marathwada地区，但这些种群仍然严重破碎，并受到人类活动和生境退化的威胁[6]。从生态学的角度来看，由于自然再生率低以及与更常见的近缘物种的分类混淆，该物种容易受到忽视，这常常导致它在区域森林管理计划中被忽略[2]。此外，其植物化学成分的新发现，特别是其作为水果植物、抗菌剂的传统用途以及生物活性次生代谢物的存在，要求在民族植物学探索和严格的异地保护措施之间采取平衡的方法，以防止野生种群的过度开发[7] 和 [16]。迫切需要采取异地保护、生境保护措施，以及可持续利用措施，因为这种种子难以通过适当的发芽技术进行繁殖。为了保护野生基因组，应采用适合的发芽方法进行及时的播种和播种前处理，如3分钟H2SO4或GA3的应用，结合椰糠和土壤作为生长介质。这项研究的发现为优化大规模繁殖的发芽过程提供了重要见解，从而有助于这种极度濒危物种的长期异地保护和潜在的重新引入计划。