染色体级别的基因组组装揭示了Actinidia rufa（红肉猕猴桃）卓越耐涝性的遗传机制

《Horticulture Advances》：Chromosome-level genome assembly reveals the genetic mechanisms underlying elite waterlogging tolerance in Actinidia rufa

　　摘要：红毛猕猴桃（Actinidia rufa）因其极强的耐水涝能力而成为杂交育种和培育新型猕猴桃品种的宝贵物种。本研究利用Illumina短读长序列技术和PacBio连续长读长序列（CLR）技术，完成了红毛猕猴桃的染色体水平基因组组装。组装后的基因组大小为613.66 Mb，N50值为3.06 Mb，94个基因组支架锚定在29条假染色体上。共鉴定出42,484个蛋白质编码基因和267.26 Mb的重复序列，占基因组的49.08%。系统发育分析表明红毛猕猴桃与中国猕猴桃（A. chinensis）具有密切的进化关系，两者最近的共同祖先可追溯至约700万年前。种群动态分析显示红毛猕猴桃曾经历了一次历史性的种群扩张，其当前适宜的栖息地主要分布在日本群岛和中国台湾地区。比较基因组分析揭示了大规模的结构变异，其中红毛猕猴桃第19号染色体上的一个区域与中国猕猴桃的第2号和第9号染色体上的两个不同片段相对应。此外，红毛猕猴桃‘MTS7001’品种的耐水涝能力优于中国猕猴桃‘Donghong’品种。基因表达分析显示，在早期水涝胁迫下，红毛猕猴桃上调了与能量代谢和激素信号传导相关的基因，尤其是与生长素、脱落酸和油菜素内酯相关的基因。本研究为红毛猕猴桃卓越的耐水涝能力提供了基因组层面的见解，有助于未来的猕猴桃分子育种工作。

引言：猕猴桃（Actinidia Lindl.）因其极高的营养价值和已证实的健康益处而被誉为“水果之王”（Wu等人，2025a, b, c）。该物种原产于中国西南部（Zhang等人，2023），现已在全球范围内多样化，包含约54个物种（x = 29）（Wu等人，2025a, b, c）。然而，商业栽培主要依赖于两个品种——中国猕猴桃变种（Actinidia chinensis var. chinensis）和美味猕猴桃变种（Actinidia chinensis var. deliciosa），这两种品种占所有已知猕猴桃品种的绝大多数（Huang和Liu，2014；Wang等人，2021）。这种有限的遗传多样性与猕猴桃属内的广泛自然变异形成对比，例如宽叶猕猴桃（A. latifolia）的高维生素C含量以及红肉猕猴桃品种的甜味与独特颜色组合（Wang等人，2025；Yuan等人，2022）。猕猴桃被广泛认为是超级食品，富含抗氧化剂和抗炎化合物（Suleria等人，2020），其未被充分利用的副产品（如果皮、种子、果肉和修剪残渣）含有丰富的酚类化合物和抗氧化活性，具有工业应用价值（Gubitosa等人，2022；Sanz等人，2021）。通常，猕猴桃属植物对水涝胁迫敏感，因此将它们嫁接在耐水涝的砧木上是提高植物适应性的有效方法。红毛猕猴桃原产于日本湿润的沿海地区，能够在低温和水涝土壤中茁壮成长——这些特性在商业猕猴桃品种中较为罕见。经过长期自然选择，红毛猕猴桃发展出了强大的抗逆遗传资源，尤其是其卓越的耐水涝能力。作为中国猕猴桃变种的近亲，红毛猕猴桃是品种改良的宝贵遗传资源（Liu等人，2017）。最近，红毛猕猴桃与其与中国猕猴桃的杂交品种‘Zhongkelvmi No. 9’引起了商业关注，该杂交品种不仅继承了耐水涝特性，还具有高糖分和独特的香气（Zhong等人，2024）。先前的研究（Miller等人，1997）表明，在包括美味猕猴桃（A. deliciosa）、中国猕猴桃（A. chinensis）、花猕猴桃（A. eriantha）和赫姆斯利猕猴桃（A. hemsleyana）在内的五种猕猴桃物种中，红毛猕猴桃对根缺氧的适应性最强。在育种实践中，嫁接在红毛猕猴桃砧木上的藤本植物表现出比嫁接在中国猕猴桃和尖叶猕猴桃（A. arguta）上的植物更高的光合效率和根系呼吸活性（Suezawa等人，2018）。总体而言，红毛猕猴桃不仅具有商业潜力，还具备显著的环境适应性和与主要猕猴桃品种的遗传兼容性，使其成为砧木改良和耐水涝育种的关键资源。从红毛猕猴桃等野生资源中鉴定和利用耐水涝基因对于开发抗性品种和促进可持续猕猴桃生产至关重要。然而，红毛猕猴桃卓越耐水涝能力的遗传机制仍需进一步研究。

自2013年中国猕猴桃（2n = 58）的第一个基因组发布以来（Huang等人，2013），高质量的基因组已成为阐明猕猴桃重要经济性状的遗传基础的关键。过去十年中，已发表了多种猕猴桃物种的染色体水平基因组组装结果，包括三个中国猕猴桃品种（Wu等人，2019；Xia等人，2023）、两个花猕猴桃品种（Tang等人，2019；Yao等人，2022），以及尖叶猕猴桃、多花猕猴桃、红毛猕猴桃、浙江猕猴桃和赫姆斯利猕猴桃（Akagi等人，2023；Yu等人，2023）。值得注意的是，中国猕猴桃‘红阳’（cv. ‘Hongyang’）、‘东红’（cv. ‘Donghong’）、宽叶猕猴桃（A. latifolia）和花猕猴桃（A. eriantha）的无间隙基因组也已成功测序（Yue等人，2023；Han等人，2022；Wang等人，2023）。这些全基因组资源为分子育种和功能研究提供了重要基础（Li等人，2025；Xu等人，2026）。在新测序的物种中，红毛猕猴桃因其对水涝、热胁迫的强耐受性和对猕猴桃最具破坏性的细菌病原体——丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae pv. Actinidiae）的强大田间抗性，而被认为是品种改良的宝贵资源库（Kisaki等人，2018）。

为了探索水涝胁迫引起的根缺氧耐受性的遗传机制，本研究使用PacBio连续长读长序列（CLR）技术和BioNano方法构建了高质量的红毛猕猴桃染色体水平基因组。通过对猕猴桃物种的比较基因组分析，鉴定了与水涝胁迫适应相关的基因，这些基因将有助于开发旨在提高猕猴桃抗性的新育种计划。Ka/Ks比率是使用CodeML和分支模型（Gao等人，2019年）基于分支方式计算得出的。为了检测基因组中的缺失和插入，将组装序列使用nucmer程序映射到参考基因组，并在1对1比对模式下使用delta过滤器过滤比对块。SNP以及插入/缺失（InDels）是通过MUMmer4工具包中的show-snps函数从1对1比对块中识别出来的。插入和缺失事件最终是通过BEDtools v2.31的subtract函数检测到的，其中两个比对中的缺失都被转换为存在/缺失变异（PAVs）。

猕猴桃品种个体的基因组重测序是使用Illumina HiSeq平台进行的。经过质量控制后，将清洁的读段使用BWA映射到参考基因组。SNP的检测是使用Genome Analysis Toolkit（GATK）（McKenna等人，2010年）中的HaplotypeCaller函数执行的。为了推断猕猴桃品种的种群规模轨迹和分化时间，应用了SMC++（Terhorst等人，2017年）。SMC++的成对数据集使用vcf2smc格式化，突变率（μ）设置为每代2×10^-8，世代时间设置为6年。物种随时间的分布模型是使用Maxent v3.4.1（https://github.com/mrmaxent/Maxent）（Vollering等人，2019年）建立的。A. rufa的存在数据是从各种标本馆的记录和全球生物多样性信息设施（http://www.gbif.org/）收集的。从WorldClim数据库（https://worldclim.org/）下载了四个不同时期的19个生物气候变量。通过皮尔逊相关性分析过滤了高度相关的变量。模型使用基于赤池信息量准则（AIC）的方法进行了优化，并通过随机交叉验证进一步验证。建模中包括的四个时期是末次冰盛期（LGM）（约0.022百万年前）、中全新世（MH）（约0.006百万年前）、当前时期（1970年至2000年的历史数据）以及预测的未来时期（2061-2080年）。

关键的生理和生化参数是使用标准方法评估的。叶片相对含水量（RWC）是通过测量新鲜重量和烘干重量来确定的。过氧化氢（H2O2）含量是在415纳米处通过光谱法测量的，这是在丙酮提取和一系列试剂反应之后进行的，计算基于标准曲线。丙二醛（MDA）浓度，表明脂质过氧化，是使用硫代巴比妥酸（TBA）方法测量的，吸光度读数在450、532和600纳米。超氧化物歧化酶（SOD）活性是通过硝基蓝四唑（NBT）光化学还原方法测定的，活性以每毫克鲜重的单位表示。净光合速率（Pn）和气孔导度（Gs）是在稳定的环境条件下使用便携式光合作用系统（LI-6400，Heinz Walz GmbH，Effeltrich，德国）记录的。

本研究选择了耐水淹的A. rufa cv. ‘MTS7001’（SL）和敏感于水淹的A. chinensis cv. ‘Donghong’（DH）作为研究对象。分别从SL和DH植物中收集了在0小时（R0）、12小时（R12）、24小时（R24）、48小时（R48）和72小时（R72）水淹后的根组织，用于RNA提取和Illumina HiSeq测序。RNA使用RNAiso Kit（TaKaRa，中国）提取。共构建了30个RNA-Seq文库，并在Illumina HiSeq系统上进行了测序。

在水淹胁迫下基因表达模式的分析中，每个样本的清洁读段使用TopHat2（Kim等人，2013年）映射到参考基因组。基因表达水平被标准化为FPKM值。使用R中的DESeq2包（Love等人，2014年）识别差异表达基因（DEGs）。对来自成对比较的DEGs进行了基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。表达量低的基因（FPKM<10）被排除，剩余的DEGs被选用于加权基因共表达网络分析（WGCNA）（Langfelder和Horvath，2008年）。共表达模块是使用WGCNA包中的pickSoftThreshold函数确定的自动网络构建功能检测到的，软阈值功率为16。候选基因是从在DH中表达量低而在A. rufa中表达量高的WGCNA模块中选出的。

实验数据最初使用Microsoft Excel 2021进行了整理和分析，每个质量指数的平均值和标准差是用SPSS 20.0软件计算的。所有数据都以平均值±标准差表示。统计显著性使用学生t检验确定，差异在P<0.05时被认为是显著的。使用GraphPad Prism 8和SPSS 20.0进行了显著差异的分析。

**结果**

选择了一个A. rufa个体（图1a）进行Illumina和PacBio测序。最初产生了61.61 Gb的Illumina配对末端读段，并用17-mer频率分布进行分析，预测基因组大小约为635.84 Mb，杂合度为0.65%，重复序列含量为44.07%（图S1）。总共60.45 Gb的PacBio CLR读段（约95.08倍的基因组覆盖度）被组装成467个contigs。基因组组装长度为613.66 Mb，最长的contig跨越16.18 Mb，contig N50为3.06 Mb。总共使用了111.11 Gb的10×Genomics链接读段进行支架构建，得到了222个支架，支架N50为5.05 Mb。将Illumina数据映射回最终组装得到的映射率为98.03%，核心真核基因映射方法（CEGMA）恢复了96.77%的核心真核基因，共同证实了参考基因组的高质量。

基因组特征进一步使用由2426个SNP组成的遗传连锁图谱锚定到伪染色体上，这些SNP分布在29个连锁群（LGs）中，总长度为2,651 cM。总共有序了93个支架（615.28 Mb；支架N50=19.84 Mb），其中29个最长的支架对应于29条染色体，覆盖了578.54 Mb，占总组装的94.03%（图1b）。此外，BUSCO分析显示，基于Embryophyta_odb10数据集，基因组组装的完整性为96.4%。

重复DNA序列占基因组的267.26 Mb（43.44%），主要由168.54 Mb的LTR逆转录转座子和59.82 Mb的DNA转座子组成（表S1）。共预测了42,484个PCGs，平均基因长度为5,518 bp，平均CDS长度为1,059 bp（图1c）。其中，94%的PCGs使用公共数据库进行了功能注释，而2,568个基因模型仍未被注释。

从15个物种中识别出总共101个SOGs，并用于构建系统发育树。此外，来自六个猕猴桃类群的PCGs——A. rufa、A. latifolia、A. chinensis cv. ‘Hongyang’（v3）、A. chinensis cv. ‘Donghong’、A. polygama和A. eriantha cv. ‘White’——被聚类，识别出所有六个类群共有的736个SOG家族（图2a）。系统发育分析显示，A. rufa与两个A. chinensis品种的关系最为密切（图2b），A. rufa和A. chinensis品种的最新共同祖先（MRCA）大约在700万年前分化。此外，Actinidia物种与Rhododendron delavayi和Camellia sinensis的关系更为密切。

**Actinidia rufa的进化和比较基因组分析**
A. rufa与其他物种共享的基因家族数量。A. chinensis DH、A. chinensis cv. ‘Donghong’；A. chinensis HY、A. chinensis cv. ‘Hongyang’。
A. rufa中扩增的基因家族。d 特定于A. rufa的基因家族的KEGG富集。
A. rufa中有2,785个基因家族发生了扩增，而13,214个基因家族发生了收缩（图2b）。扩增的基因家族在GO术语如“SOD活性”、“氧化磷酸化”和“超氧化物代谢过程”以及几个KEGG通路如“单萜类生物合成”、“氧化磷酸化”和“光合作用-天线蛋白”中显著富集（图2c）。与耐水淹相关的基因，包括SEEDSTICK（STK）、beta-N-乙酰己糖胺酶-1（Hex-1）、Hex-3和真核翻译起始因子5A（eIF5A），在富集通路中被检测到，突显了它们在水淹耐受性中的作用（Zhou等人，2023年；R Kumar等人，2017年；I Alam等人，2010年）。相反，收缩的基因家族在GO术语如“氧化-还原过程”、“氧化还原酶活性”、“血红素结合”、“四吡咯结合”和“线粒体包膜”中富集。在42,112个PCGs中，34,185个被分配到13,205个基因家族中，每个家族平均有2.59个基因，而4,433个基因是A. rufa特有的（图2d）。Pfam富集分析显示，A. rufa特有的基因在“PPR重复家族”、“五聚肽重复结构域”和“亮氨酸富集重复”家族中显著富集。

研究了A. rufa、A. polygama和A. chinensis cv. ‘Hongyang’之间的保守同线性。大多数染色体在三个物种之间显示出高度保守的同线性（图3）。值得注意的是，A. rufa的Chr19与A. chinensis cv. ‘Hongyang’和A. polygama的多个染色体具有同源区域（图3a），表明它们在物种分化后发生了染色体分裂或融合事件。在A. rufa和A. chinensis cv. ‘Hongyang’之间也观察到了倒位，包括A. rufa的Chr19和A. chinensis cv. ‘Hongyang’的Chr2之间的倒位。具体来说，A. rufa的Chr19的一个区域在A. chinensis的Chr2和Chr9上有两个拷贝（图3b）。共有412个基因位于这个区域内，KEGG富集分析揭示了重要的通路，如cAMP信号传导、类固醇生物合成、蛋白酶体功能和Epstein–Barr病毒感染。值得注意的是，在A. chinensis基因组中检测到了两个组蛋白乙酰转移酶（HATs）和RING-box蛋白样（RBXs）的拷贝。在这些412个基因中，识别出了参与耐水淹的关键因子，如APETALA 2（AP2）样因子、BRCA1/BRCA2和WRKY转录因子。

**Actinidia基因组之间的同线性分析**
A. rufa、A. polygama和A. chinensis cv. ‘Hongyang’之间的保守同线性。灰色楔形表示匹配的基因对，其中一个用红色突出显示。
A. rufa的Chr19与A. chinensis（cv. ‘Hongyang’和‘Red5’）的Chr2和Chr9之间的同线性。通过A. rufa和A. chinensis基因组之间的1对1同线性块的比对，共识别出16,198,692个SNPs和4,276,640个InDels。进一步比较A. rufa和A. chinensis基因组后发现，有4,588个A. rufa特异的基因组片段（约73.59 Mb）长度超过10 kb，代表PAVs。这些PAVs在染色体上的分布不均匀，尤其在Chr22、Chr28和Chr29上观察到聚集。PAV基因在“类胡萝卜素生物合成”和“角质质、木脂质和蜡生物合成”等通路中显著富集。

基于SMC++的人口统计分析清楚地表明，A. rufa在约1780万年前经历了显著的人口扩张。相比之下，A. eriantha、A. latifolia和A. polygama的人口在约3160万年前开始下降。这些分析进一步表明，在人口下降之后，猕猴桃物种经历了人口稳定（图S2）。物种分布模型显示，Model H1产生了最低的AIC值。从LGM到MH，A. rufa的适宜分布区域有所收缩，尤其是在中国中部地区（图4a，b）。然而，从MH到现在，中国中部和南部的适宜区域减少了（图4c）。日本和台湾岛屿在所有气候情景下始终表现出最高的栖息地适宜性。对未来的预测表明，A. rufa的适宜区域将显著向东亚岛屿退缩（图4d）。颜色代表发生的概率。在积水胁迫下，A. rufa和A. chinensis之间的生理差异。为了评估对积水胁迫的生理反应，在淹水处理后0小时、12小时、24小时、48小时、72小时以及7天时收集了A. rufa cv. ‘MTS7001’和A. chinensis cv. ‘Donghong’的叶片（图5a）。随着积水胁迫的加剧，A. rufa cv. ‘MTS7001’表现出比对照品种A. chinensis cv. ‘Donghong’更强的耐受性。此外，‘MTS7001’的下降趋势更为平缓，并且在处理72小时后仍保持了较高的相对水分含量（RWC）（图5b）。在氧化应激方面，从12小时到72小时，‘MTS7001’中的H2O2水平显著低于‘Donghong’，表明‘MTS7001’具有更强的活性氧（ROS）清除能力。同时，在积水胁迫下，两种品种的SOD活性都增加了（图5d）。与‘Donghong’相比，‘MTS7001’的MDA水平较低，这意味着‘MTS7001’在积水胁迫下的膜脂质过氧化程度较轻（图5e）。与A. chinensis cv. ‘Donghong’相比，在水淹处理的早期阶段，A. rufa表现出与能量代谢和激素诱导的抗性相关的基因表达水平更高，这些基因与生长素、ABA（脱落酸）和油菜素内酯等物质有关。这项研究为了解A. rufa的耐水淹遗传机制提供了宝贵的见解，为未来猕猴桃的分子育种策略研究奠定了基础。