通过光生物合成优化小球藻（Chlorella sp.）的生长参数，以提高生物氢的产量

《Biotechnology Letters》：Optimization of microalgal growth parameters for enhanced biohydrogen production via biophotolysis in Chlorella sp.

　　摘要
全球能源生产对化石燃料的依赖不断增加，导致温室气体排放加剧，这凸显了寻找可持续能源替代方案的必要性。氢气因其高能量密度和转换效率而被视为一种有前景的绿色燃料。在各种生产途径中，通过生物光解利用微藻产生生物氢的方法特别具有吸引力，因为它具有较高的生物量生产力、适应多种水源的能力、减少烟气排放的潜力以及较低的土地需求。本研究探讨了关键微藻生长参数对小球藻（Chlorella sp.）通过生物光解产生生物氢的影响。系统评估了从有氧条件转变为厌氧条件期间进行氮气置换、不同的光照周期（连续光照、连续黑暗和明暗循环）、葡萄糖补充（5、10和15克/升）以及温度（25、30和35摄氏度）的影响。在产生氢气的过程中监测了微藻细胞密度，以阐明其与氢产量的关系。初步实验在10毫升试管中进行，以确定最佳条件，随后在1000毫升夹套反应器中进行了放大实验。氮气置换通过去除氧气并激活氢化酶显著提高了氢产量，达到峰值氢浓度为11 ppm。连续光照产生的氢水平高于黑暗和明暗循环条件。葡萄糖的添加显著增加了氢产量，在15克/升的浓度下观察到最高的产量（30 ppm）。30摄氏度的最佳温度也最大化了氢产量。在这些条件下，由于代谢变化，随着细胞密度的降低，氢产量增加。放大实验使氢产量增加了405倍，证明了该过程的可扩展性。这些发现强调了优化藻类生长条件以平衡微藻生长和生物氢产量的重要性，对未来的工业应用具有重要意义。

引言
化石燃料继续主导全球能源生产，占全球能源消耗的约75%，同时也是温室气体（GHG）排放的主要来源，尤其是二氧化碳（CO?）。在这种情况下，氢气因其极高的比能量密度（约120-140 MJ kg?1）而成为最有前景的绿色燃料，这一密度是传统燃料（如甲烷或天然气55.5 MJ kg?1）、煤炭24 MJ kg?1、柴油48 MJ kg?1、液化石油气46.4 MJ kg?1和汽油44.4 MJ kg?1的2.5倍至5.9倍（Sharma等人，2021年；Silva等人，2024年）。氢气燃烧仅产生水作为副产品，不产生一氧化碳、二氧化碳、二氧化硫或氮氧化物（Mandotra等人，2021年）。氢气广泛用于燃料电池、航空航天和电力生产，以及氨合成、甲醇生产和钢铁制造等工业应用（Mandotra等人，2021年；Ahmed等人，2021年）。预测表明，到2025年氢气可以供应全球能源需求的8-10%，长期目标是将其份额增加到约18%，同时将生产和运输成本显著降低至1.80美元/千克（Sharma等人，2021年）。目前，大多数工业氢气是通过化石燃料重整产生的，这需要碳捕获和储存技术来实现碳中和（Sharma等人，2021年）。因此，人们对生物质衍生氢气生产途径的兴趣日益增长，这些途径具有将废物转化为能源的潜力、减少CO?排放和提高可持续性（Ahmed等人，2021年）。在生物途径中，使用蓝细菌、发酵细菌和微藻等微生物生产生物氢的方法受到了越来越多的关注。微藻因其快速生长率、高生物量和脂质生产力、能够利用烟气以及与耕地竞争小而受到重视（Anwar等人，2019年；Li等人，2022年）。此外，微藻可以在短短3.5小时内将其生物量翻倍，1千克干藻生物量可以捕获约1.83千克的CO?（Anwar等人，2019年）。
微藻产生生物氢的过程涉及几种代谢途径，这些途径分为依赖光的机制，包括直接生物光解、间接生物光解和光发酵，以及不依赖光的暗发酵。在直接生物光解中，光能驱动水分解反应，产生的电子随后用于氢气的生成。通过直接生物光解产生的氢产量通常为1.2-73.5毫升/升，生产周期为5-10天（Sharma等人，2021年）。这种途径可以产生纯度高达98%的氢气；然而，由于同时产生氧气，其实际效率受到限制，氧气会迅速抑制负责质子还原的[FeFe]-氢化酶（Rashid等人，2013年；Nagarajan等人，2017年；Ahmed等人，2021年；Mandotra等人，2021年）。因此，通过直接生物光解产生的氢气是短暂的且难以持续。间接生物光解提供了一个可行的替代方案，它将光合作用和氢气生成分为两个阶段：通过光合作用固定CO?进行有氧生物量积累，然后使用储存的有机化合物在厌氧条件下产生氢气（Rashid等人，2013年；Li等人，2022年）。在初始有氧阶段，微藻通过光合作用固定CO?以积累碳水化合物储备，如淀粉；随后在厌氧条件下，这些内源性底物被代谢生成还原剂，进而通过氢化酶介导的氢气生成（Rashid等人，2013年；El-Dalatony等人，2020年；Grechanik & Tsygankov，2022年）。这种两阶段策略产生的氢产量显著更高，为6.625-243毫升/升，生产周期为148-168小时（Sharma等人，2021年）。然而，其实际应用受到复杂的代谢调控、底物竞争和对环境条件的敏感性限制，这些因素共同限制了其可扩展性（Ahmed等人，2021年）。
藻类生长条件深刻影响氢化酶活性以及光合作用生长状态和产氢状态之间的代谢转换。氧气浓度是一个关键决定因素，因为酶的敏感性要求严格的厌氧环境以实现持续的氢气生成（Touloupakis等人，2021年）。氮气置换有效地从培养基中去除溶解氧，创造了激活对氧气敏感的氢化酶所需的还原环境，从而实现持续的氢气生成（Maturi等人，2026年）。先前的研究表明，与不进行氮气置换的系统（葡萄糖浓度为0.85±0.32摩尔/升）相比，向Clostridium sp.培养物中通入氮气（葡萄糖浓度为1.43±0.12摩尔/升）可使氢产量增加50%，这突显了去除氧气的重要性（Mizuno等人，2000年）。
光照可用性和光照周期对光合作用活性、底物积累和氢化酶激活有重要影响。连续光照已被证明可以在建立厌氧条件后维持光合作用电子流动并提高氢产量（Javed等人，2022年；Grechanik和Tsygankov，2022年）。Rashid等人（2011年）观察到，在完全光照条件下，普通小球藻（Chlorella vulgaris）在47小时内产生了496毫升/升的氢气，而在完全黑暗条件下为348毫升/升，证实了光对持续氢化酶活性的依赖性。Gabrielyan等人（2017年）报告称，在24小时光照/48小时黑暗循环下，P. kessleri RA-002的氢产量比在连续光照下高出2.5倍。外源碳源如葡萄糖可以通过支持异养代谢来提高氢产量，尽管在大规模应用中的经济可行性仍是一个问题（Rashid等人，2011年）。Rashid等人（2013年）证明，使用5克/升葡萄糖时，普通小球藻的氢产量最高可达812±5毫升/升，而更高和更低的浓度则产量较低。Jiménez-Llanos等人（2020年）使用10克/升葡萄糖优化了小球藻的氢产量，达到2.85摩尔/升。温度也起着关键作用，通过调节酶活性、代谢通量和生长动力学，不同微藻物种的最佳温度范围不同，其中中温微藻的最佳温度为25至40摄氏度（Javed等人，2022年）。Javed等人（2022年）报告称，在37和40摄氏度下，小球藻的氢产量分别为183和238毫升/升/小时。
尽管生物处理技术具有多种优势，但由于产量低，生物氢生产在商业上仍然不可行（Javed等人，2022年；Rathi等人，2023年）。本研究通过评估（i）氮气置换、（ii）光照周期、（iii）葡萄糖补充浓度和（iv）温度对小球藻间接生物光解的影响，系统地优化了藻类生长参数，以研究生物量发展与生物氢产量之间的关系。此外，使用1000毫升夹套反应器进行了放大实验，以验证实验室规模下确定的最佳参数，为开发可持续和可扩展的微藻生物氢生产策略提供了重要见解。

实验材料
本研究中使用的微藻菌株（Chlorella sp.）是从马来西亚砂拉越州科廷大学的一个淡水湖中分离出来的。藻类培养液（ACB；Sigma-Aldrich）被用作微藻培养的生长介质，提供必要的营养物质，包括1克/升硝酸钠、0.513克/升硫酸镁、0.25克/升磷酸二钾、0.058克/升氯化钙、0.05克/升氯化铵和0.003克/升氯化铁（MilliporeSigma 2018）。D(±)-葡萄糖一水合物（Merck，德国）被用作外部有机碳源，以支持微藻在厌氧条件下的代谢并维持氢生产。

细胞浓度的校准
通过系列稀释准备了七个不同细胞浓度的小球藻样本，以建立细胞密度和光密度（OD）之间的相关性。应用了两倍系列稀释（稀释因子为2），获得了从1.800×10^6总细胞/毫升到61.025×10^6总细胞/毫升的七个样本范围。使用UV-Vis分光光度计（Lambda 25，双光束；PerkinElmer）在683纳米波长下测量每个稀释样本的光密度（Gon?alves等人，2013年）。
为了确保准确的细胞计数并减少细胞重叠，每个样本在显微镜分析前进一步稀释了十倍。通过将10微升的每种稀释液滴在Neubauer血细胞计数板上（Improved XB.K.25，深度0.10毫米，网格1/400平方毫米；Qiujing），并覆盖盖玻片。经过短暂的沉淀时间后，在10倍放大率下使用配备数字成像系统的光学显微镜（Nikon Eclipse LV100N Pol）计数四个角落正方形内的细胞。为了确保一致性和防止重复计数，只有那些接触每个正方形顶部或左侧边界的细胞才会被计数。图1显示了显微镜下10倍放大率下血细胞计数板上的微藻细胞的光学图像。

细胞浓度使用公式（1）（Benavides Escobar等人，2025年）进行计算。所得到的校准曲线用于将后续实验中的OD测量值转换为细胞浓度。
$$ {\text{总}}\;{\text{细胞/mL = }}\frac{{{\text{总}}\;{\text{细胞}}{\mkern 1微} \;{\text{计数}} \times {\text{稀释}}\;{\text{因子}} \times {\text{10000}}\;{\text{细胞/mL}}}}{{{\text{计数}}\;{\text{的}}\;{\text{正方形}}\;{\text{数量}}}} $$ （1）
记录每个稀释度的计算细胞浓度，并将其与相应的光密度（OD）值绘制在一起，以生成校准曲线。这种校准将能够快速、无损地监测培养生长，从而准确推断出细胞浓度。微藻样本的接种与制备
通过使用冷藏离心机（Universal 320R，Hettich）以4000 rpm的速度在室温下离心4分钟，对Chlorella sp.培养物进行浓缩，以获得适合氢气生产的高密度生物量。离心后，小心地去除上清液，每个试管中留下约10 mL的细胞液。

在250 mL的Erlenmeyer烧瓶中制备生长培养基，将0.374 g的ACB溶解在200 mL的蒸馏水中，最终干重浓度为1.87 g L?1，最终pH值为7.0 ± 0.2（MilliporeSigma 2018）。使用高压灭菌器（HVE-50，Hirayama）在121°C下灭菌20分钟来对制备好的培养基进行消毒。随后，将五个离心管中收集的50 mL浓缩微藻悬浮液无菌转移到含有灭菌生长培养基的每个Erlenmeyer烧瓶中。

**有氧条件下的生物量积累阶段**
使用UV–Vis分光光度计在683 nm处测量微藻培养物的初始光密度（OD），记录为2.6303 ± 0.01。然后在有氧条件下进行培养，使用鱼缸空气泵（Hailea ACO-9610，10 W）持续通气，并在室温（保持在25 ± 2 ℃）下使用冷白荧光灯以7780 lx的强度照明24小时，以促进光合作用生物量的积累。在整个培养期间，培养基的pH值保持在7.0 ± 0.2。培养期结束后，重新测量光密度，其值增加到2.8516 ± 0.01，表明生物量成功增长。之后，将培养物分装到10 mL的试管中，用于后续实验步骤。

**厌氧条件下的氢气生产阶段**
使用橡胶塞将实验容器密封，以确保在整个氢气生产阶段处于厌氧状态（Rashid等人，2009年）。为了确保可重复性和统计可靠性，为每个实验参数准备了三组独立的微藻样本（每组10 mL）。此外，还建立了四组相同的样本用于评估细胞生长。所有样本都在数字振荡培养箱（71 L；Model 1–5311-DS-230 V，LABNET，美国）中培养，以维持受控和均匀的操作条件。培养箱的工作温度为30 ± 5 ℃，振荡速度为120 rpm，光照强度为1040 lx。实验设置持续96小时（4天），在此期间监测生物氢气的产生量。

**数据收集**
在连续4天的时间内，每隔24小时测量一次产生的生物气体积和氢气浓度。使用气密注射器确定累积气体体积，而氢气浓度则使用便携式氢气检测仪（气体类型：氢气；型号：ATO-SKY2000-H2）进行量化。这些测量数据用于计算实验期间产生的氢气体积。

**确定生物氢气生产的最佳参数**
采用逐步实验策略系统地识别生物氢气生产的最佳操作条件。独立评估每个参数，以分离其对氢气产量的单独影响。
首先，向试管中通入氮气2分钟，压力为0.5 bar，然后立即用橡胶塞密封容器，以比较通氮和不通氮条件下的氢气产量。
在确定产生更高氢气产量的条件后，通过比较三种光照制度来研究厌氧阶段的光周期效应：连续光照（L/D 24:0）、连续黑暗（L/D 0:24）以及24小时光照后24小时黑暗的光暗循环（L/D 24:24）。在光周期的光照阶段，使用数字振荡培养箱内置的冷白荧光灯提供均匀的光照强度1040 lx。通过完全用铝箔包裹试管来实现黑暗条件，以防止光线穿透。
随后，研究葡萄糖作为额外碳源的影响，葡萄糖浓度分别为5、10和15 g L?1，以评估其对氢气产量的影响。通过将适量的D(-)-葡萄糖一水合物溶解在蒸馏水中来制备葡萄糖储备溶液，以达到所需的浓度。所有实验都在含有9 mL微藻悬浮液和1 mL葡萄糖溶液的10 mL试管中进行。
最后，通过比较25、30和35 ℃下的氢气产量来评估温度的影响。数字振荡培养箱设置相应的温度，同时保持所有其他实验条件不变。

**细胞生长分析**
如第2.5节所述，为细胞生长分析准备了四个平行样本。为了在整个氢气生产阶段保持厌氧条件，每个采样间隔只打开一个样本进行OD测量。通过测量683 nm处的OD值来每日监测细胞生长。使用第2.2节中建立的校准曲线将测得的OD值转换为细胞数浓度。根据方程（2）（Wahidin等人，2013年）计算指数生长阶段的特定生长率（μ (h?1)：
$$ \mu = \frac{{\ln \left( {N_{2} - N_{1} } \right)}}{{t_{2} - t_{2} }} $$
其中N?和N?分别代表时间t?和t?（h）时的细胞数浓度（细胞/mL）。

**反应器放大实验**
在之前优化的操作条件下，使用1000 mL的夹套玻璃反应器（Tengke，BORO 3.3）进行放大实验。图2展示了夹套反应器的示意图。反应器的工作体积约为800 mL，留有足够的空间以促进气体积累并防止培养过程中压力过高。

**图2**
该图的替代文本可能是使用AI生成的。
**图2的完整尺寸图像**
**在有氧条件下运行的夹套反应器的示意图**
光照由荧光光源提供，强度为2300 lx，使用反射架定位以确保均匀的光照。反应器夹套中充满水，并通过橡胶管连接到外部水储罐。使用鱼缸加热器将温度控制在30 ℃，同时使用潜水水泵不断循环水通过夹套，从而在整个实验过程中保持稳定和均匀的热条件。
反应器中加入由90%（v/v）微藻培养物和10%（v/v）葡萄糖溶液组成的混合物。加载前，分析720 mL微藻悬浮液在683 nm处的光密度（OD???），以确保培养物浓度在第2.4节规定的范围内。使用装有聚四氟乙烯（PTFE）过滤器（0.45 μm）的空气泵进行通气，以保持无菌。
在连续光照和通气的条件下培养24小时后，再次测量OD???，以监测生物量浓度的变化。连续通气还通过气泡作用促进混合，确保细胞定期受到光照，并减少长时间遮蔽。随后向反应器中加入80 mL浓度为15 g L?1的葡萄糖溶液。然后通过用氮气冲洗反应器5分钟来建立厌氧条件，随后立即用氯丁橡胶塞密封。图3展示了在30 ℃下运行的厌氧条件下的夹套反应器的示意图。连续12天进行气体测量，以监测随时间变化的氢气产量。在厌氧阶段，由于不提供通气（即没有气泡），每2小时手动轻轻摇晃夹套反应器以促进混合。

**图3**
该图的替代文本可能是使用AI生成的。
**图3的完整尺寸图像**
**在厌氧条件下运行的夹套反应器的示意图**

**微藻生物量的收获**
生物氢气生产完成后，通过冷藏离心收获微藻生物量。将培养样本转移到50 mL的离心管中，在25 ℃下以4000 rpm的速度离心4分钟。离心后，小心地倾倒上清液，并收集得到的生物量颗粒。
收获的微藻生物量随后在实验室冷冻干燥机（Fisher，1.5 L；Labconco）中在-40 ℃下冷冻干燥48小时（Ramos等人，2025年）。干燥后的生物量储存起来以备将来使用。

**统计分析**
所有实验均重复三次，结果以平均值呈现。使用SigmaPlot版本15.0（Systat Software，美国）进行数据处理和图形表示。

**结果与讨论**
**校准曲线**
图4展示了光密度与微藻细胞浓度之间的校准曲线。细胞浓度与光密度之间的关系由方程（3）描述，决定系数（R2 = 0.9991）很高，证实了线性拟合非常好，测量范围内的偏差可以忽略不计。强线性相关性表明，在实验期间光密度可以可靠地用作估计微藻生物量浓度的代理指标。
$$ y = 7 \times 10^{7} x - 1 \times 10^{6} $$
其中y代表细胞浓度（细胞/mL），x表示光密度。

**图4**
该图的替代文本可能是使用AI生成的。
**图4的完整尺寸图像**
**光密度与微藻细胞浓度之间的校准曲线**

**氮气冲洗的效果**
氢气生产实验在固定的操作条件下进行，包括1040 lx的光照强度、120 rpm的搅拌速度和30 ℃的培养温度。图5a和图5b分别展示了四天厌氧阶段氢气浓度和累积氢气产量的时间曲线。图5b中观察到的低标准差值（范围从0到1.73）表明实验的可重复性和测量可靠性良好。

**图5**
该图的替代文本可能是使用AI生成的。
**图5的完整尺寸图像**
**不同冲洗条件对氢气浓度（a）、累积氢气体积（b）、细胞浓度（c）和细胞生长率（d）的影响**
在通氮和不通氮条件下，厌氧条件建立后生物氢气产量均有所增加，在第二天达到峰值，随后下降。这一趋势与Oncel等人（2015年）的先前研究结果一致，他们发现微藻培养物中的氢气产量峰值通常在厌氧条件建立后的2-3天内出现。峰值后的下降可以归因于营养物质的消耗和抑制性代谢副产物的积累。
在0.5 bar的压力下通氮2分钟后，氢气浓度明显高于不通氮的培养物。在通氮条件下，氢气浓度在第二天达到11 ppm的峰值，而不通氮的培养物在同一时间点的峰值约为6 ppm。尽管在达到峰值后氢气产量下降，但在整个四天的生产期间，通氮的培养物始终表现出更高的氢气水平。尽管如此，收集到的氢气总量相对较低，分别为7.53 × 10?? mL和2.34 × 10?? mL。
通氮下氢气产量的提高可以归因于厌氧条件的建立，这对激活氢化酶至关重要。氢化酶对氧气非常敏感，即使是微量氧气也会显著抑制其活性。这些发现与Ananyev等人（2008年）的研究结果一致，他们报告称氮气冲洗通过降低溶解氧水平并促进氢化酶的持续活性显著提高了Arthrospira培养物中的氢气产量。此外，Grechanik和Tsygankov（2022年）报告称，在厌氧条件下氢气产量达到峰值；然而，随着光照的持续，光合作用产生的氧气逐渐抑制了氢化酶的活性，导致氢气产量急剧下降。
图5c和图5d展示了细胞生长动态与氢气产量之间的相互作用。在不通氮的培养物中，氧气的存在支持了有氧呼吸，通过有机底物的完全氧化产生更多的ATP，从而促进细胞生长和生物量积累（Sarkar和Shimizu 2015年）。因此，如图5c所示，不通氮的培养物在氢气生产阶段表现出更高的细胞浓度。相比之下，通氮的培养物显示出较慢的生长速率，表明厌氧条件部分限制了细胞增殖。
到第6天时，通氮和不通氮条件下的细胞浓度相当（分别为2.19 × 10?和2.20 × 10?细胞/mL），表明Chlorella sp.可以在厌氧压力下维持生长，尽管生长速率略有降低。当培养物进入氢气生产阶段时，细胞浓度和特定生长率（图5d）趋于平稳或下降，反映了由营养限制和压力条件驱动的代谢转变。
值得注意的是，通氮培养物的氢气生产阶段开始时间比不通氮培养物稍晚（μ = 0.6020 h?1 vs μ = 0.6109 h?1）。这种延迟表明突然转变为厌氧条件暂时抑制了细胞分裂。然而，一旦适应了新的环境，经过氮气冲洗的处理后，微生物的代谢资源就从生长转向了氢气的生产，从而提高了氢气的产量，如图5a所示。总体而言，这些结果表明，小球藻（Chlorella sp.）中的生物氢气生产与细胞生长阶段紧密相关。在初始阶段，生物量的积累是主要过程，产生的氢气很少；而当环境压力和厌氧条件开始时，代谢方式会转变为氢气的生产。这一行为支持了采用两阶段（间接）生物光解策略来提高生物氢气产量的可行性。鉴于观察到的氢气产量始终较高，因此选择氮气冲洗作为关键的操作步骤，并在后续实验中进行了应用。

光照周期对生物氢气生产的影响
光照周期实验在固定的操作条件下进行，包括0.5巴的压力下进行2分钟的氮气冲洗、120转/分钟的搅拌速度以及30摄氏度的培养温度。照明使用的是强度为1040勒克斯的白荧光光源。不同光照周期下的累计生物氢气产量如图6b所示。

在不同光照周期下，连续光照（L/D 24:0）产生的氢气产量最高（2.34×10^-5毫升），其次是交替光照/黑暗周期（L/D 24:24；2.03×10^-5毫升）。在持续黑暗条件下（L/D 0:24；1.26×10^-5毫升），氢气产量最低。连续光照的优越性能可以归因于不间断的光合作用活动，这维持了电子流动和能量生成，从而保持了有利于氢化酶活性的细胞内氧化还原平衡（Antel等人，2011年）。L/D 24:24条件下的氢气产量略低于连续光照。如图6a所示，L/D 24:0和L/D 24:24条件下的氢气峰值浓度分别为8.80 ppm和5.51 ppm。循环光照下产量降低可能是由于黑暗阶段光合作用中断，暂时限制了氢气生产的能量供应。尽管如此，交替的光照和黑暗周期可能有助于调节与氢气代谢相关的基因，并减少氧气的积累，而氧气已知会抑制氢化酶的活性（Sanz-Luque等人，2020年）。

连续黑暗（L/D 0:24）条件下产生的氢气产量在所有测试的光照周期中最低。在黑暗条件下，氢气的产生主要依赖于发酵代谢，但由于代谢活动降低和还原电子载体的有限供应，氢气产量受到限制。有趣的是，图6a显示，在L/D 0:24条件下第3天和L/D 24:24条件下第4天和第6天，氢气产量出现了短暂增加。这种现象可以解释为黑暗期间光合作用产生的氧气停止，随后通过呼吸作用迅速消耗氧气，从而创造了有利于氢化酶激活的厌氧条件（Catalanotti等人，2013年）。在这些时期，发酵途径生成了如NADH和还原型铁氧还蛋白这样的还原电子载体，它们作为氢气生产的电子供体（Subramanian等人，2014年）。

不同光照周期下的细胞浓度和特定生长率趋势如图6c和d所示。连续光照（L/D 24:0）条件下，到第6天时细胞浓度（2.19×10^8细胞/毫升）和生长率（0.6561 h^-1）最高，这反映了由持续的光合作用活动驱动的生物量积累增强。L/D 24:24条件下的生物量积累略低，因为黑暗阶段生长受到周期性限制。相比之下，连续黑暗（L/D 0:24）条件下由于缺乏光合作用和能量生成减少，导致细胞浓度和生长率最低。

这些观察结果与先前的报告一致，表明较长的光照周期可以促进微藻中更高的生物量积累（Oncel等人，2015年）。在循环光照周期中，储存在细胞中的碳化合物（如淀粉）在黑暗阶段部分被消耗，用于支持细胞呼吸，导致净生物量积累减少。总体而言，连续光照同时增强了细胞生长和氢气生产，证明了其适用于最大化生物氢气产量的潜力。因此，选择了L/D 24:0光照周期，并在后续实验中研究了添加碳底物的影响。

**葡萄糖作为碳底物的影响**
在这个实验阶段，操作条件固定为每个样本氮气冲洗0.5巴2分钟、连续光照（L/D 24:0）光照强度1040勒克斯、搅拌速度120转/分钟以及30摄氏度的培养温度。如图7a所示，添加葡萄糖显著提高了小球藻培养物的生物氢气产量，氢气产量与葡萄糖浓度成正比增加。根据图7b，15克/升葡萄糖条件下的累计氢气产量最高（6.14×10^-5毫升），其次是10克/升（3.54×10^-5毫升）、5克/升（3.03×10^-5毫升），以及不含葡萄糖的对照组（2.34×10^-5毫升）。

葡萄糖添加对氢气产量、细胞浓度和特定生长率的影响
葡萄糖添加后氢气产量的增加可以归因于多种机制。首先，在过渡阶段提供的葡萄糖作为额外的碳和能量来源，促进了细胞内能量储备（如淀粉和脂质）的积累，这些储备可以在厌氧条件下用于氢气的生成（Li等人，2024年）。其次，葡萄糖的可用性刺激了参与氢气代谢的关键酶，特别是氢化酶，从而提高了氢气生成速率。如图7b所示，15克/升葡萄糖条件下第6天的氢气峰值浓度达到30 ppm，表明葡萄糖不仅增加了总氢气产量，还维持了较长时间的氢气生成。葡萄糖的添加还影响了小球藻的生长行为，这从细胞浓度（图7c）和特定生长率（图7d）中可以看出。随着葡萄糖添加，细胞密度增加，其中10克/升葡萄糖条件下的细胞浓度最高（257,993,000细胞/毫升），其次是5克/升（236,328,000细胞/毫升）、15克/升（234,928,000细胞/毫升）以及无葡萄糖条件（219,255,000细胞/毫升）。这种生物量生产的增强可以归因于小球藻的混合营养代谢能力，使其能够同时利用有机碳和光合能量。葡萄糖的存在加速了细胞分裂和生物量积累，相对于光自养生长而言。

然而，较高的葡萄糖浓度也会促进营养物质的更快消耗和代谢副产物的积累，这可能导致更早进入稳定期。在15克/升葡萄糖条件下，这种行为尤为明显（图7d），其中生长减缓与氢气产量增加同时发生，表明代谢方式从生物量积累转变为氢气生成。这些发现与先前的报告一致。Deng等人（2019年）观察到，在光自养条件下，Chlorella kessleri在六天后的特定生长率为0.41天^-1，最大生物量为0.31克/升。相比之下，添加2-15克/升葡萄糖的混合营养培养在最初的两到三天内显示出显著更高的生长率（0.76-1.27天^-1），最大生物量浓度在1.05至4.46克/升之间。值得注意的是，当葡萄糖浓度达到10克/升时，生物量显著增加，而更高浓度（12-15克/升）由于氮和磷等必需营养物质的限制，产量增加效果减弱。Cheirsilp和Torpee（2012年）也报告了在较高葡萄糖水平下的类似饱和效应。

总体而言，葡萄糖的添加有效地支持了小球藻的混合营养代谢，提供了额外的碳和能量，以增强生物量形成和生物氢气生产。尽管15克/升葡萄糖并未产生最高的细胞浓度，但由于其优越的生物氢气产量，它被选为本研究中的最佳条件。

**温度的影响**
在这个实验阶段，操作条件保持为每个样本氮气冲洗0.5巴2分钟、连续光照（L/D 24:0）光照强度1040勒克斯、搅拌速度120转/分钟以及30摄氏度的培养温度。图8a中的生物氢气生产曲线表明，温度在调节小球藻培养物的氢气产量方面起着关键作用。在测试的条件中，30摄氏度下的累计氢气产量最高，其次是25摄氏度；而35摄氏度下的产量最低。如图8b所示，30摄氏度下培养的生物体在氢气生产阶段表现出快速的氢气产量增加，达到最大产量6.14×10^-5毫升。25摄氏度条件下也支持了大量的氢气生成，尽管产量较低，总产量为4.38×10^-5毫升。相比之下，35摄氏度下的氢气产量在整个实验期间明显受到抑制，最终产量仅为2.07×10^-5毫升。

30摄氏度下较高的氢气产量可以归因于酶活性和热稳定性之间的最佳平衡，这有助于氢化酶的有效功能和电子转移过程。在这个温度下，细胞代谢保持足够的活性，为氢气生成提供还原当量，而不会造成过度的热应力。相反，35摄氏度下观察到的氢气产量降低表明参与氢气代谢的温度敏感酶部分受到抑制或失稳。这一观察结果与Paramesh等人（2018年）的发现一致，他们报告说虽然Chlorella vulgaris能够耐受较高的温度，但超出最佳范围的温度可能会损害代谢效率。此外，高温还会导致关键代谢酶的变性以及光合蛋白的失活，而低温结合碳限制会抑制光合作用，所有这些都会破坏细胞呼吸和光合电子流动，最终降低生物氢气生产的效率（Jiao等人，2024年；Ekpan等人，2025年）。温度对细胞浓度和生长率也有依赖性变化，如图8c和d所示。30摄氏度下的细胞浓度最高（234,928,000细胞/毫升），其次是25摄氏度（229,482,000细胞/毫升），而35摄氏度下的生物量积累最低（204,611,000细胞/毫升）。在所有温度下，进入氢气生产阶段时生长率都出现下降，反映了从生物量形成向氢气生成的代谢转变。

在25摄氏度下，生长率从第2天的0.6900 h^-1逐渐下降到第6天的0.6107 h^-1，在氢气生产阶段保持了最高的生长稳定性。相比之下，30摄氏度下培养的生物体生长率出现中等波动，随后急剧下降到0.5711 h^-1，表明代谢方式从生物量积累转变为氢气生成。在35摄氏度下，生长率的不稳定性最为明显，从第2天的0.6903 h^-1急剧下降到第3天的0.5616 h^-1，并伴有随后的波动。这种行为表明热应力的开始，可能会损害细胞稳态并降低生长和氢气生产的效率。总体而言，结果表明30摄氏度是在测试条件下小球藻的最佳温度，它在厌氧阶段提供了细胞生长和最大生物氢气生产之间的良好平衡。因此，这个温度被选为最佳操作条件，通过两阶段生物光解过程生产生物氢气的最终优化参数总结在表1中。

**表1 微藻生物氢气生产的最佳条件**

**夹套反应器的放大**
表1中总结的最佳操作条件被应用于将微藻培养系统从10毫升试管放大到1000毫升的夹套反应器。从小型实验室试管到受控夹套光生物反应器的放大是将以微藻为基础的生物氢气生产从概念验证实验转化为更实用反应器平台的重要步骤。放大后，氢气产量显著提高。1000毫升夹套反应器（工作体积800毫升）的平均氢气产量达到每天6.22×10^-3毫升H2，与10毫升试管（每天1.535×10^-5毫升H2）相比增加了大约405倍。这一显著增加表明反应器规模和操作稳定性对生物氢气生产效率有重要影响。

如图9a所示，在厌氧阶段的早期，氢气浓度迅速增加，第二天达到最大值594 ppm，随后在第14天逐渐下降到59 ppm。最初的快速增加表明在优化的厌氧条件下氢化酶得到了有效激活，而随后的下降可能是由于底物耗尽、代谢转变以及长期培养过程中抑制性副产物的积累。这些观察结果与最近的研究发现一致，即温度调节的光合作用切换和氧气清除策略可以延长氢化酶的活性，尽管还需要进一步优化营养物质的输送和代谢调控（Li等人，2024年）。图9：该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图像：来自夹套反应器的氢气生产性能：a为氢气浓度，b为氢气产量。将微藻系统放大通常会导致性能下降，因为难以维持一致的培养条件（Hawrot-Paw和Ratomski，2024年）。因此，成功地将优化的实验室条件转化为受控的反应器系统是这项工作的重要贡献。在更大规模下观察到的氢气产量增加可以归因于参数控制的改进，包括更稳定的温度调节、更好的质量传递以及比小规模试管更均匀的混合。此外，更大的培养体积允许更高的整体代谢活性和更有效地利用可用的碳和能源，从而促进持续的氢气生产。这些发现强调了在优化条件下运行的夹套光生物反应器在可扩展的生物氢生产中的潜力。如果在更大的反应器体积下能够保持相似的生长和氢气生产效率，基于微藻的氢气生成可能成为一种可行的可再生能源途径。然而，在实现进一步放大之前，必须解决几个挑战，包括实现均匀的光照分布、在更大体积下的有效热管理以及优化的营养物质输送。此外，与照明、搅拌和温度控制相关的能量需求必须与氢气产量仔细平衡，以确保整个过程的能源效率。总体而言，这项研究不仅优化了关键的培养参数，还在受控的反应器系统中成功展示了其可扩展性，并显著提高了氢气产量，从而区别于现有文献。仍需要进一步的研究来关注反应器设计优化、能量平衡评估和长期运行稳定性，以充分实现大规模基于微藻的生物氢生产系统的潜力。

结论：本研究系统地研究了藻类生长参数对小球藻（Chlorella sp.）培养中生物氢生产和细胞生长的影响，采用逐步优化策略通过两阶段（间接）光解过程提高氢气产量。从有氧条件到无氧条件的转变被认为是启动氢气生产的关键阶段。氮气置换有效地建立了无氧条件，与非置换培养相比，显著提高了生物氢产量。这种改进归因于溶解氧的去除，它激活了对氧气敏感的氢化酶，并诱导小球藻向产氢途径的代谢转变。光照周期对氢气生产性能有显著影响。在测试的条件中，连续光照（L/D 24:0）产生了最高的生物氢产量，其次是交替光照-黑暗周期（L/D 24:24），而连续黑暗（L/D 0:24）产生的产量最低。持续的光照支持持续的光合作用，使生成氢气代谢所需的还原当量成为可能，并促进整体氢气生产率。还评估了碳底物补充和厌氧阶段温度的影响。葡萄糖的添加显著提高了氢气产量，在15克/升的浓度下获得了最高的产量。外部有机碳源的存在支持混合营养代谢，提供额外的能量和碳骨架，有助于持续的氢气生产。温度优化表明30摄氏度是最有利于生物氢生产的条件，优于25摄氏度和35摄氏度。这个温度在酶活性和细胞稳定性之间提供了最佳平衡，而更高的温度可能会引起热应力并损害代谢功能。对微藻生物量生长的评估揭示了细胞密度、生长速率和氢气生产之间的密切关系。观察到明显的代谢权衡，即氢气产量的增加伴随着生长速率的降低，因为细胞资源从生物量积累重新定向到氢气生成。这些发现强调了确定细胞生长和氢气生产之间最佳平衡的重要性，以确保过程稳定性和持续的生物氢输出。在优化条件下进行的放大实验表明，从10毫升试管成功过渡到1升夹套反应器，氢气产量增加了大约405倍。这一显著改进突显了在适当的操作条件下扩大基于微藻的生物氢生产系统的可行性和潜力。总体而言，这项研究强调了藻类生长参数在调节小球藻生物氢生产中的关键作用。尽管这些发现是特定于该物种的，但确定的优化条件为开发高效和可持续的基于微藻的生物氢生产系统提供了宝贵的见解。结果支持了两阶段光解作为一种有前景的可再生氢生成策略的可行性，并为未来的放大和过程优化研究奠定了基础。