从Disynaphia filifolia中分离出的内生真菌Epicoccum sorghinum的化学谱型分析及其细胞毒性研究

《Brazilian Journal of Microbiology》：Chemical profiling and cytotoxic activity of the endophytic fungus Epicoccum sorghinum isolated from Disynaphia filifolia

　　摘要
内生真菌被认为是生物活性特殊代谢物的关键来源。在本研究中，从与Disynaphia filifolia相关的Epicoccum sorghinum (DF1)内生真菌培养物中分离出了六种化合物，其中包括一种新的脂肪族酰胺（1），被鉴定为2-羟基-N-(4’-氧代己-2’-基)-丙酰胺，以及其他已知化合物2,3-二氢-2-羟基-2,4-二甲基-5-反式-丙烯基呋喃-3-酮（2）、2,3-二氢-2-羟基-2,4-二甲基-5-丙基呋喃-3-酮（3）、环-L-Pro-L-Phe（4）、环-L-Pro-L-Tyr（5）和四氢altersolanol B（6）。通过光谱分析并与文献中报道的相关化合物进行比较，确定了这些化合物的结构。评估了所分离化合物对人类前列腺癌（PC-3）、宫颈癌（HeLa）和非肿瘤性角质形成细胞（HaCaT）细胞系的细胞毒性。在测试的化合物中，环-L-Pro-L-Phe对PC-3和HeLa细胞的细胞毒性最为显著。新的酰胺衍生物（1）对PC-3细胞表现出微弱的活性，对HeLa细胞无活性，而对HaCaT细胞的细胞毒性较低。其余化合物显示出从弱到中等的细胞毒性，其中PC-3细胞最为敏感。这些发现有助于对从D. filifolia中首次分离出的E. sorghinum产生的代谢物进行化学表征，并突显了其作为具有生物活性的结构多样化化合物来源的潜力。

图解摘要
内生真菌被认为是生物活性特殊代谢物的关键来源。在本研究中，从与Disynaphia filifolia相关的Epicoccum sorghinum (DF1)内生真菌培养物中分离出了六种化合物，其中包括一种新的脂肪族酰胺（1），被鉴定为2-羟基-N-(4’-氧代己-2’-基)-丙酰胺，以及其他已知化合物2,3-二氢-2-羟基-2,4-二甲基-5-反式-丙烯基呋喃-3-酮（2）、2,3-二氢-2-羟基-2,4-二甲基-5-丙基呋喃-3-酮（3）、环-L-Pro-L-Phe（4）、环-L-Pro-L-Tyr（5）和四氢altersolanol B（6）。通过光谱分析并与文献中报道的相关化合物进行比较，确定了这些化合物的结构。评估了所分离化合物对人类前列腺癌（PC-3）、宫颈癌（HeLa）和非肿瘤性角质形成细胞（HaCaT）细胞系的细胞毒性。在测试的化合物中，环-L-Pro-L-Phe对PC-3和HeLa细胞的细胞毒性最为显著。新的酰胺衍生物（1）对PC-3细胞表现出微弱的活性，对HeLa细胞无活性，而对HaCaT细胞的细胞毒性较低。其余化合物显示出从弱到中等的细胞毒性，其中PC-3细胞最为敏感。这些发现有助于对从D. filifolia中首次分离出的E. sorghinum产生的代谢物进行化学表征，并突显了其作为具有生物活性的结构多样化化合物来源的潜力。

引言
内生微生物栖息在植物内部组织中而不引起疾病，并且越来越被认为是具有生物技术和治疗潜力的微生物[1, 2]。其中，内生真菌被认为是产生结构多样化且具有广泛生物活性的特殊代谢物的生产者[3, 4]。因此，从内生真菌中分离和表征代谢物是发现具有药物兴趣的新生物活性分子的一个有前景的替代途径[3, 5]。Epicoccum属（Didymellaceae）包括广泛分布于环境中的丝状真菌，包括土壤、植被和海洋生态系统。该属的物种可以作为内生菌或植物病原体出现，并且经常从无症状的植物组织中分离出来[6,7,8,9]。大约有18种Epicoccum物种被分类学上认可，其中Epicoccum nigrum由于其生态相关性和广泛分布而被最广泛研究[10]。Epicoccum物种以产生多种生物活性特殊代谢物而闻名，包括聚酮类、二萜类和类胡萝卜素，这些代谢物具有抗菌、抗氧化、抗病毒和抗增殖作用[8, 11, 12]。此外，非产毒性的Epicoccum菌株是食品工业应用中天然色素的有希望的来源，特别是类胡萝卜素和聚酮类如蒽醌、萘醌和吖唑酮[13, 14]。Epicoccum sorghinum以前被分类为Phoma sorghina，被认为是与高粱颗粒相关的主要真菌物种之一[15]。涉及该物种内生菌株的化学研究报道了二苯酯[16]、酚类化合物[17]和生物活性胞外多糖（EPS）[18]的分离，表明其特殊代谢物谱仍需进一步探索。我们的研究小组专注于对来自巴西Paraná州Campos Gerais地区菊科植物相关的内生真菌进行化学研究，该地区位于大西洋森林和塞拉多生物群落之间的生态过渡带[19]。在这种情况下，从Disynaphia filifolia中分离出了Epicoccum sorghinum作为内生菌，这种植物的地上部分之前已被报道含有tremetone作为主要化学成分，以及其他苯并呋喃衍生物、萜类、酚类和黄酮类[20]。尽管内生真菌的化学多样性和生物学相关性已被认可，但与Disynaphia物种相关的微生物仍尚未得到充分探索。在这里，我们报告了从Disynaphia filifolia中分离出的内生真菌Epicoccum sorghinum DF1产生的代谢物的化学表征，包括鉴定和阐明了一种先前未描述的脂肪族酰胺的结构。此外，还评估了所分离化合物对两种肿瘤细胞系和一种非肿瘤细胞系的细胞毒性，有助于理解与该本地植物物种相关的内生真菌的化学多样性和生物潜力。

材料与方法
**生物材料**
内生菌DF1之前是从Disynaphia filifolia（Hassl.）R. M. King & H. Rob（菊科）的地上部分中分离出来的，并从巴西Maringá州立大学微生物生物技术实验室（CMEA/LBIOMICUEM）的内生和环境微生物收藏中获取。这种内生菌已在国家遗传遗产及相关传统知识管理系统（SISGEN）中注册，代码为AEE079A-17。Disynaphia filifolia是一种本地物种，于2016年3月在巴西Paraná州的Ponta Grossa市（25° 05′ 16″ S, 50° 05′ 43″ W）采集，并由Marta Regina Barrotto do Carmo博士鉴定。一个凭证标本存放在Ponta Grossa州立大学植物标本馆（HUPG 22451）。此外，该植物也在SISGEN中注册，代码为A6E6D08。

**DNA提取、扩增和分子鉴定**
内生真菌的鉴定基于分子和形态学分析。分子鉴定使用内部转录间隔区（ITS）和β-微管蛋白基因（TUB）的部分序列进行。ITS区域使用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行扩增[21]。对于TUB基因，使用了引物T1（5′-AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3′）和Bt2b（5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′）[22]。扩增产物使用两种酶的组合进行纯化：Shrimp Alkaline Phosphatase（SAP）和Exonuclease I（EXO）。样品由ACTGene Análises Moleculares LTDA（Ludwigbiotec）进行测序。真菌序列提交给GenBank，并使用BLAST与类型序列进行比较。多基因位点比对使用MAFFT [23]在Geneious Prime v.2019.1.1中进行。最佳拟合进化模型通过MrModelTest v.2.3 [24]选择。贝叶斯推断使用MrBayes v.2.2.4 [25]（MCMC，1百万代；SD < 0.01）进行，后验概率在节点处显示。所得的系统发育树在FigTree v.1.4.2 [26]中可视化并编辑。ITS和TUB DNA序列在GenBank中的登录号为PX097382和PX101957。

**发酵和提取**
内生菌DF1菌株在马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）（Acumedia?）和马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（Acumedia?）中培养和维持。DF1菌株在pH 6.8的条件下，使用PDB和最小培养基（MM）进行两种不同的培养条件。选择这种条件的研究假设是，营养组成的差异，比较复杂的培养基（PDB）和化学定义的培养基（MM），可能会调节特殊代谢途径的表达，从而导致代谢物谱的质变。MM的配方如下：NaNO3 60.00 g L?1，KH2PO4 15.00 g L?1，KCl 5.00 g L?1，MgSO4·7H2O 5.00 g L?1，FeSO4·7H2O 0.01 g L?1，ZnSO4·7H2O 0.01 g L?1，CuSO4·7H2O 0.01 g L?1。使用时，MM用蒸馏水稀释1:10，并添加10.00 g L?1的D-葡萄糖[19]。内生菌的浸没培养用于产生特殊代谢物。从在PDA上生长的真菌菌株中取出三个直径10 mm的琼脂圆盘，接种到20个Erlenmeyer烧瓶（250 mL）中，每个烧瓶含有100 mL的培养基，总培养体积为2.0 L。两种培养基的pH均调整至6.8。在28°C下静止条件下培养21天[27]。培养期结束后，使用过滤膜、Büchner漏斗和Kitasato通过真空过滤将菌丝从肉汤中分离出来。所得的培养肉汤用乙酸乙酯（3 × 150 mL）提取。有机相使用旋转蒸发器（Tecnal TE-210）在37°C下浓缩，分别得到80 mg和55 mg的PDB和MM提取物。这些值分别对应于PDB的约40 mg L?1和MM的27.5 mg L?1的产量。

**代谢物分离和鉴定的通用实验程序**
色谱分离在硅胶（200–300目；青岛海洋化工厂，中国）或Sephadex LH-20（100–200目；北京Solarbio科技有限公司，中国）色谱柱（CC）上进行。预涂有硅胶60G或硅胶F254（山东Sun Desiccant有限公司，鲁山）的板用于薄层色谱（TLC）。化合物在TLC上的可视化通过254和366 nm的紫外照射和/或喷洒H2SO4/茴香醛/醋酸/甲醇（5:0.5:10:85 mL）溶液后在150°C下加热，或使用Dragendorff溶液进行。还使用了Shimadzu LC-20AR HPLC进行分析和分离。分析时使用了Supelcosil LC-18（25 cm × 4.6 mm，5 μm）柱。分离是在Agilent半制备型Supelcosil LC-18柱（250 × 20 mm，15 μm）上完成的。UHPLC-ESIMS数据在配备有Bruker IMPACT II质谱仪系统的Shimadzu Nexera X2仪器上获得，该系统配备了电喷雾离子化（ESI）源、四极杆时间飞行（Q-Tof）分析器和多通道板检测器。光学旋转在JASCO P-1010偏振仪上获得。NMR光谱在Bruker Avance III HD光谱仪上记录，操作频率为300或500 MHz（1H）和75.5或125 MHz（13C），使用甲醇-d4、DMSO-d6和氯仿-d作为溶剂。

**化合物的分离和纯化**
MM提取物（55.0 mg）使用硅胶柱（闪蒸色谱）进行分离，用氯仿：甲醇（100:0、98:02、95:05、90:10、85:15、80:20、30:70和50:50 v/v）梯度系统洗脱，得到八个组分（DF1-MM-1至DF1-MM-8）。组分DF1-MM-6产生了化合物1（4.3 mg）。组分DF1-MM-3（7.0 mg）产生了化合物2和3的混合物（7.0 mg）。PD提取物（80.0 mg），之前在TLC谱中显示出在硅胶上保留较强的相对极性化合物，最初使用甲醇–水作为流动相在Sephadex LH-20上进行柱色谱，采用递减极性梯度系统（25:75、50:50、100:0），得到组分DF1-PD-1至DF1-PD-12。化合物2（4.7 mg），之前从MM提取物中分离并根据其相似的TLC谱鉴定，从组分DF1-PD-2中重新分离。组分DF1-PD-3使用硅胶CC（闪蒸色谱）进行洗脱，用己烷：乙酸乙酯（50:50、60:50、0:100 v/v）梯度系统产生七个组分（DF1-PD-3–1至DF1-PD-3–7）。组分DF1-PD-3–2和DF1-PD-3–4分别产生了化合物4（2.5 mg）和5（3.1 mg）。组分DF1-PD-5（19.0 mg）使用配备有Shim-pack PREP-ODS C18柱（250 mm × 20 mm；15 μm）的半制备型反相HPLC进行纯化，使用等度洗脱MeOH:H2O（50:50 v/v）30分钟，流速为12 mL/min，得到化合物6（2.4 mg，tR = 11.2 min）。

**2-羟基-N-(4’-氧代己-2’-基)-丙酰胺（1）**：黄色胶状物；[α]D24 + 45.5 (c 0.11, MeOH)；1H (300 MHz, CDCl3) 和 13C (75.5 MHz, CDCl3) NMR数据，见表1；HR-ESI–MS计算C9H17NO3 [M + H]+的分子量为188.1281，实测值为188.1275。

**体外细胞毒性**
使用MTT比色法[28]测量了化合物1、2、4、5、6和2 + 3混合物的细胞毒性潜力。细胞活力针对肿瘤细胞系HeLa（宫颈癌，ATCC? CCL-2）、PC-3（前列腺腺癌，ATCC? CRL-1435）和非肿瘤性HaCaT（永生化人类角质形成细胞，CLS 300493）进行测定。PC-3细胞在RPMI-1640（pH 7.6）中培养，HeLa和HaCaT细胞在DMEM培养基（pH 7.2）中培养。此外，培养基中补充了10%的L-谷氨酰胺和FBS，并在37°C和5% CO2气氛下培养。细胞以2.5 × 10^5细胞/mL的密度接种在96孔板中的每个孔（每个孔100 μL）。24小时后，细胞用不同浓度的（1.0至200 μg/mL）分离化合物处理48小时。所有储备溶液都在DMSO中制备成20 mg/mL的浓度，并稀释到用于测定的培养基中。所有实验条件下的最终DMSO浓度不超过1%（v/v）。多柔比星用作参考药物处理。处理后，小心移除培养基。细胞用PBS（pH 7.2）洗涤两次，随后向每个孔中加入50 μL的MTT溶液（2 mg/mL溶于PBS中）。将平板在37°C下孵育4小时。然后，移除上清液，将formazan晶体溶解在DMSO中，并在平板分光光度计（Power Wave XS，BioTek）中于570 nm处读取吸光度。半最大抑制浓度（IC50）定义为能够使处理过的细胞的光密度降低50%的浓度，通过非线性回归进行分析。结果表示为至少三个独立实验的平均值±标准差（SD）。

**计算机模拟的吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）预测**
由于该化合物1的结构新颖性，其药代动力学性质（包括吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）是通过SWISSADME网络服务器（http://www.swissadme.ch/）[29]进行预测的。评估的关键药物参数包括分子量、脂溶性（Log P）、溶解度（Log S）、血脑屏障（BBB）通透性、胃肠道（GI）吸收/口服生物利用度以及是否符合Lipinski的五规则（ROF）。此外，还通过SWISSADME网络工具生成的预测来评估CYP450酶的抑制潜力。输入数据使用了SMILES格式。

**统计分析**
统计分析使用GraphPad Prism版本8.0.1软件（GraphPad，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行。在统计比较之前，使用Shapiro-Wilk检验评估数据的正态性。由于所有数据集都满足正态分布标准（p > 0.05），因此使用单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey检验，以确定每个实验中各处理组之间是否存在统计学上的显著差异。整个研究应用了95%的显著性水平（p < 0.05）。

**结果与讨论**
**DF1菌株的鉴定**
在28°C下培养21天后，观察到了DF1菌株在PDA平板上的形态特征，并基于ITS序列建立了系统发育树（图1）。当在PDA上培养时，它形成密集且绒毛状的菌丝，具有棉絮状和丝绒般的质地，呈现灰色，并在培养皿的底部产生红棕色色素。从D. filifolia中分离出的内生真菌的ITS1-5.8s-ITS2基因被测序并提交到GenBank的BLASTN中。结果表明，最接近的匹配结果是属于Epicoccum属的几种“phoma-like”物种。在分析的物种中，Epicoccum sorghinum菌株，特别是CBS 627.68，在ITS区域具有100%的同一性，在TUB基因中具有97%的同一性。系统发育分析显示，DF1菌株与E. sorghinum紧密聚集，形成了一个具有98%bootstrap值的支系。

**DF1菌株的物种鉴定**
(a)：在28°C下培养21天后在PDA平板上的分生孢子形态；(b)：基于ITS1-5.8S-ITS2基因序列通过贝叶斯推断计算出的系统发育共识树。贝叶斯概率在每个生物体之间的节点处显示出来。使用Didymella exigua CBS 183.55作为外部组。

**从Epicoccum sorghinum中纯化并阐明化合物的结构**
从内生真菌E. sorghinum DF1的乙酸乙酯提取物中分离出一种未描述的化合物，命名为2-羟基-N-(4’-氧代己-2’-基)-丙酰胺（1），以及五种已知化合物，包括两种呋喃酮2,3-二氢-2-羟基-2,4-二甲基-5-反式-丙烯基呋喃-3-酮（2）[30,31,32]、2,3-二氢-2-羟基-2,4-二甲基-5-丙基呋喃-3-酮（3）[30]、两种二酮哌嗪环-L-Pro-L-Phe（4）[33, 34]、环-L-Pro-L-Tyr（5）[34]，以及一种聚酮类化合物tetrahydroaltersolanol B（6）[35, 36]（图2）。通过NMR和ESI–MS/MS数据以及与文献的比较确定了这些化合物的化学结构。化合物1仅从最小培养基（MM）中的发酵中分离出来。化合物4、5和6仅在马铃薯葡萄糖培养基（BD）中获得。

**化合物1–6的化学结构**
化合物1是一种光学活性的黄色胶状物，其比旋光度为[α]D24 + 45.5 (c 0.11, MeOH)，根据HR-ESI–MS峰m/z 188.1275 [M + H]+（C9H17NO3的计算值，188.1281）定义（图S12）。根据1H NMR谱的特征信号（表1，图S2-S3），发现存在一个氧甲基质子δH 4.17 (1H, q, J = 6.8 Hz, H-2)、一个甲基质子δH 4.32 (1H, m, H-2’)、两个亚甲基δH 2.65 (2H, dd, J = 5.2 Hz; 12.7 Hz, H-3’) 和 δH 2.45 (2H, m, H-5’)，以及三个甲基δH 1.40 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-1)、δH 1.24 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-1’) 和 δH 1.04 (3H, t, J = 7.4 Hz, H-6’）。13C NMR数据（表1；图S4）和HSQC谱（图S8-S9）显示有9个信号，可以分别归因于酮基和酰胺基团的两个羰基碳δC 210.7 (C-4’) 和 173.7 (C-3)。此外，还有两个甲基碳δC 42.0 (C-2’) 和 68.3 (C-2)，两个亚甲基δC 36.7 (C-5’) 和 47.4 (C-3’)，以及三个甲基碳δC 21.4 (C-1)、20.3 (C-1’) 和 7.6 (C-6’)。在δH 6.88 (NH)处有一个宽的单峰，HSQC谱（图S8-S9）中没有相应的关联，这归因于与结构中的氮原子（NH）相连的氢。这一归属通过COSY谱（图S5-S7）中δH 4.32 (H-2’) 信号与δH 6.88 (NH)信号之间的相关性得到确认。此外，还观察到了δH 4.17 (H-2) 与 δH 1.40 (H-1)；δH 2.45 (H-5’) 与 δH 1.04 (H-6’)；以及δH 4.32 与 δH 1.24 (H-1’) 和 δH 2.65 (H-3’) 之间的相关性。H-2 (δH 4.17 1H, q, J = 6.8 Hz)的自旋耦合系统，以及H-2与C-1 (δC 21.4) 和 C-3 (δC 173.7)的HMBC相关性（图3，图S10-S11），证实了酰胺基团与结构的连接。此外，δH 2.65 (H-3’) 与碳δC 42.0 (C-2’)、20.3 (C-1’) 和 210.7 (C-4’)之间的相关性，以及末端甲基δH 1.04 (H-6’) 与碳δC 36.7 (C-5’) 和 210.7 (C-4’)之间的相关性也得到了证实。

**化合物1的鉴定**
基于这些信息，化合物1被鉴定为2-羟基-N-(4′-氧代己-2′-基)-丙酰胺。由于材料量有限，无法确定其绝对构型。尽管已有报道从微生物来源中分离出含有酰胺的代谢物[37,38,39,40]，但化合物1含有两个立体中心（C-2和C-2′），且没有找到具有已知绝对构型的近似类似物来支持基于生物合成或光谱比较的可靠构型鉴定。在类似的简单脂肪族酰胺系统中，立体化学结果可能因产生生物体和生物合成途径的不同而有所不同。如果未来的研究能够以更大的量分离出化合物1，可以采用先进的光学立体化学技术来确定其绝对构型。据我们所知，这是对该化合物的首次化学表征。

化合物2之前是从Stemphylium radicinum中分离出来的[30]，随后在与Vaccinium angustifolium的叶子和茎相关的内生真菌Mollisia nigrescens中被鉴定出来[32]。它也在从Taxus brevifolia中分离出的内生Penicillium sp.中被报道过[31]，以及在来自绿藻Ulva sp.的海洋来源真菌Ascochyta salicorniae中被报道过[41]。化合物3最初由Grove（1971）[30]描述为2,3-二氢-2-羟基-2,4-二甲基-5-反式-丙烯基呋喃-3-酮（2）的化学还原产物。据我们所知，这是首次报道化合物3作为天然产物被分离出来。此外，这项研究首次报道了这些代谢物在Epicoccum属中的存在。二酮哌嗪4和5之前由Qader等人（2021）[37]从Epicoccum nigrum菌株M13中分离出来。然而，这是首次在E. sorghinum物种中报道这些化合物。这些环状二肽是一类由多种真菌属广泛产生的特殊代谢物。Tetrahydroaltersolanol B（6）之前从Alternaria solani[35]和Stemphylium botryosum[42]中分离出来。然而，据我们所知，这是首次在Epicoccum属中报道这种化合物。

**细胞毒性活性**
化合物1、2、4、5、6及其混合物对人类前列腺癌（PC-3）肿瘤细胞和永生化宫颈癌细胞（HeLa）进行了测试。还评估了它们对非肿瘤永生化人类角质形成细胞（HaCat）的细胞毒性。化合物3未能以纯形式分离出来，因此由于可用质量不足，无法进行细胞毒性评估。所得结果见表2。

**表2：从E. sorghinum中分离出的化合物对不同细胞系的细胞毒性**
在分离出的化合物中，环-L-Pro-L-Phe（4）显示出最高的细胞毒性活性，其对PC-3的IC50值为37.91 μg/mL，对HeLa细胞的IC50值为24.65 μg/mL。尽管这些值表明有可测量的抑制效果，但与高效抗肿瘤剂相比，其活性可能被认为是中等的。二酮哌嗪（DKPs）是一类环状二肽，据报道通过调节细胞增殖和凋亡途径发挥抗肿瘤作用[43,44,45]。先前的研究报告称，从Exiguobacterium acetylicum的无细胞滤液乙酸乙酯提取物中分离出的二酮哌嗪对体外结肠癌HT-29细胞具有抗癌潜力。其中，环-L-Pro-L-Phe显示出有希望的细胞毒性效果，支持了含有脯氨酸的DKPs作为抗肿瘤剂的潜在生物学相关性[46]。新的化合物2-羟基-N-(4’-氧代己-2’-基)-丙酰胺（1）对PC-3细胞的细胞毒性较弱（IC50 = 110.58 μg/mL），在最高测试浓度（200 μg/mL）下对HeLa细胞没有显著活性。这些结果表明，在所采用的实验条件下，化合物1不是一种强效的细胞毒性剂。呋喃酮2,3-二氢-2-羟基-2,4-二甲基-5-反式-丙烯基呋喃-3-酮（2）对PC-3显示出中等活性（62.94 μg/mL），对HeLa细胞的活性较弱（156.11 μg/mL）。然而，当化合物2和3混合测试时，观察到生物活性降低，低于单独测试化合物2时的活性。其余分离出的化合物（5和6）显示出弱到中等的细胞毒性效果。Tetrahydroaltersolanol B（6）之前从Stemphylium globuliferum中分离出来，据报道对人类慢性髓系白血病（K562）和人类肺癌（A549）细胞系无效。结构修饰，包括羰基的还原和羟基取代基的去除，似乎显著降低了生物活性[47]。重要的是要强调，本研究中观察到的细胞毒性效果仅通过体外生存力测定来确定，反映了化合物在受控实验条件下的直接药效学相互作用。没有进行实验来研究特定的分子靶点或信号通路。此外，由于需要体内模型，因此没有实验评估吸收、分布、代谢和清除等药代动力学参数。对化合物1进行的ADMET分析是计算机模拟预测，不应解释为经过实验验证的药代动力学数据。因此，目前的发现应被视为探索性的，仅限于细胞水平的药效学效果。

PC-3细胞总体上比HeLa细胞对测试的化合物更敏感。尽管化合物1对肿瘤细胞的抑制活性有限，但它对非肿瘤人类角质形成细胞（HaCaT）的细胞毒性较低，IC50值为135.49 μg/mL，表明其一般细胞毒性较低。这种特性可能有利于未来针对替代生物靶点或结构优化的研究。其他分离出的化合物对HaCaT的细胞毒性介于39.4 μg/mL到70.5 μg/mL之间。PC-3细胞相对较高的敏感性可能部分归因于肿瘤细胞系之间的内在生物学差异。PC-3细胞具有不同的膜脂质组成和代谢特性，这可能会影响中等脂溶性化合物的通透性和细胞内积累[48, 49]。此外，前列腺癌细胞中报告的线粒体功能和氧化还原调节的差异可能会影响对生物活性代谢物的敏感性[46]。这些解释仍然具有推测性，需要进一步研究以阐明这种差异性的基础。

物理化学、药代动力学和药理学参数在新药候选物的发现中起着重要作用，因为许多发明的药物在开发过程中失败。因此，使用SwissADME[29]网络工具对未描述的化合物1进行了计算机模拟的ADMET评估（表S1）。从结构上看，该分子具有少于十个的氢键受体和少于五个的氢键供体。此外，每个分子中可旋转的键的数量均少于十个，这些数值位于Veber和Egan为具有良好口服生物利用度和渗透性的化合物所定义的可接受范围内（拓扑极化表面积，TPSA = 66.4 ?2）。该分子表现出高胃肠吸收率、非常好的水溶性（估计溶解度高达57.8 mg/mL，ESOL Log S = ?0.51）以及中等亲脂性（共识Log P = 0.48），表明其具有良好的口服生物利用度。这与高胃肠吸收的预测结果一致，同时该化合物预计不会穿过血脑屏障（BBB），这可能根据治疗目标的不同而具有优势。尽管该化合物具有有利的药代动力学特性，但这些特性并不一定与其体外细胞毒性相关。相对较低的亲脂性和缺乏通常与细胞毒性剂相关的结构基序可能部分解释了其在体外有限的细胞毒性作用。在代谢方面，化合物1预计不会抑制任何主要的细胞色素P450酶（CYP1A2、CYP2C19、CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4），从而降低了代谢相互作用的风险。未发现任何结构警示（PAINS或Brenk），并且该化合物符合Lipinski药物相似性规则，表明其具有较低的非特异性毒性风险，这与在HaCaT细胞中观察到的较低细胞毒性一致。其合成可行性得分（2.22）表明该分子在合成上易于处理，并适合进行药物化学优化。因此，尽管化合物1并非一个强效的细胞毒性先导化合物，但其ADMET特性支持其作为化学稳定且生物安全的支架的适用性，有可能进一步进行结构修饰或探索其他生物活性。

结论：本研究扩展了与Disynaphia filifolia相关的内生真菌Epicoccum sorghinum的化学知识，鉴定了六种代谢物，其中包括一种先前未描述的脂肪族酰胺衍生物，被鉴定为2-羟基-N-(4’-氧己烷-2’-基)-丙酰胺。生物评估显示，分离出的化合物具有不同的细胞毒性特征。二酮哌嗪环（L-Pro-L-Phe）表现出最显著的细胞毒性作用，而新的酰胺对非肿瘤HaCaT细胞的细胞毒性较低，并且具有有利的计算机模拟药代动力学特性，表明其具有进一步结构优化或探索其他生物活性的潜力。据我们所知，这是首次报道从Disynaphia物种中分离出的内生真菌。这些发现扩展了Epicoccum属已知的化学多样性，并强调了与本地植物物种相关的内生真菌作为结构新颖天然产物宝贵来源的潜力。