综述：通过光学镊子研究病毒自我组装的动态过程、病毒基因组的包装机制以及病毒与细胞之间的相互作用

《European Biophysics Journal》：Dynamics of viral self-assembly, viral genome packaging, and virus-cell interactions studied by optical tweezers

　　摘要
病毒是复杂的超分子组装体，它们通过细胞间的传播来传递遗传物质，从而依赖于宿主细胞的机制。病毒采用被动和主动策略的结合，有效地包装、运输和释放核酸。虽然结构和生化技术能够提供关于病毒生命周期某些静态方面的见解，但生物物理学方法的最新进展现在允许直接测量其内在的动态活动，这一研究领域通常被称为物理病毒学。其中一种方法是光学镊子，它能够实现单分子水平上力和位置的精确测量。在过去几十年中，光学捕获微粒和操纵生物分子的能力彻底改变了医学和生物物理学研究。在本文中，我们对光学镊子进行了全面分析，探讨了其与成像模式的整合，并回顾了其在病毒及其成分研究中的多种应用。特别是，我们关注了使用光学镊子研究病毒-细胞相互作用、利用分子马达进行基因组包装以及病毒组装蛋白与其核酸的共组装的研究。

引言
与用于研究病毒的大规模方法不同，使用光学镊子研究病毒仍处于初级阶段。这是由于用于研究生物样本的单分子方法的发展相对较新。目前，人们不仅对病毒机械化学和生物物理功能的实时表征表现出浓厚兴趣，还希望将这些知识应用于纳米技术。在这篇综述中，我们将首先简要介绍病毒和光学镊子，然后讨论这种技术在单粒子水平上研究病毒的应用。

背景
病毒的生命周期是一个循环过程，其中传染性病毒颗粒（病毒体）将其基因组引入宿主细胞，导致新病毒体的形成和释放，这些新病毒体随后感染其他细胞。在宿主细胞内形成的病毒体通常是动态的且不稳定的；它们足够坚固，可以在细胞外保护病毒基因组，同时还能进行必要的结构变化并执行感染其他细胞所需的机械化学作用。病毒结构的复杂性要求使用各种技术来研究其静态和动态方面。除了大规模生化方法外，常见的静态方法还包括电子显微镜（EM）、X射线晶体学、核磁共振光谱（NMR）、质谱（MS）和其他光谱技术（Mateu 2013, W?rner et al. 2021, Lecoq et al. 2020）。另一方面，动态病毒过程通常通过荧光显微镜（Arista-Romero et al. 2021, Liu et al. 2020）或单分子/单粒子方法（Bruinsma et al. 2021, Kiss et al. 2020）进行研究。后者包括原子力显微镜（AFM）、光学镊子、磁镊子和干涉散射（Marchetti et al. 2016, Seifert et al. 2020, Garmann et al. 2019, Buzón et al. 2020, Arias-Gonzalez 2024）等工具。这些单分子技术使得能够观察病毒的活动，追踪核酸进入病毒衣壳的过程、它们的自我组装及其力学特性，为病毒生命周期过程的物理原理提供了独特的见解。

光学镊子
光学镊子是一种利用折射光子动量变化产生的光学力来实现微米级透明微粒光学捕获的技术。这种方法现在在生物物理学领域得到了广泛应用（Ashkin 1970, Bustamante et al. 2021）。从Arthur Ashkin在1970年描述如何用激光束捕获微米级颗粒开始，到2018年他获得诺贝尔物理学奖，再到今天的持续研究，光学镊子已被用于研究多种分子生物物理过程（Bustamante et al. 2021, Ashkin 2000）。光学镊子的优势在于其在力和位置方面的高分辨率以及其多功能性和动态范围。在过去50年里，基于光学镊子的研究在生物物理学和病毒学领域取得了重大进展（图1）。作为一种单分子技术，它通过允许研究人员观察和操纵单个分子的相互作用，揭示了病毒过程的详细机制，从而为病毒生命周期提供了新的见解。

图1
光学镊子在生物物理学中的里程碑。文中提到了一些一般性的里程碑，但大多数里程碑集中在物理病毒学方法上。1970年，Arthur Ashkin描述了如何用聚焦激光束捕获微米级颗粒（Ashkin 1970）。1986年，单束“光学镊子”能够在三维空间中稳定地固定微观颗粒（Ashkin et al. 1986）。1987年，可以操纵细菌和红细胞以及细胞内的细胞器（Ashkin et al. 1987）。1987年，可以操纵单个烟草花叶病毒和病毒簇（Ashkin and Dziedzic 1987）。1990年，可以操纵单个马达蛋白（Block et al. 1990）。1991年，可以用光学陷阱在水基溶液中拉伸单个DNA分子（Chu 1991）。1993年，可以测量驱动蛋白分子产生的力（Svoboda et al. 1993）。1994年，通过光学镊子和荧光显微镜观察单DNA的松弛动态（Perkins et al. 1994）。1996年，在较高力下测量DNA的弹性（Smith et al. 1996）。1996年，测量病毒包被微粒与单个红细胞之间的粘附力（Mammen et al. 1996）。2000年，研究模板张力对T7 DNA聚合酶活性的影响（Wuite et al. 2000）。2001年，测量单个噬菌体φ29 DNA的包装事件（Smith et al. 2001）。2001年，研究核酸与HIV-1核衣壳蛋白之间的相互作用（Williams et al. 2001）。2005年，测量单个核糖核酸酶蛋白分子的三态折叠（Cecconi et al. 2005）。2008年，测量完整的φ29噬菌体基因组的包装（Rickgauer et al. 2008）。2012年，研究φ29噬菌体包装马达的机械化学循环（Chistol et al. 2012）。2014年，通过捕获单个病毒体研究HIV-1颗粒的异质性（Pang et al. 2014）。2017年，控制噬菌体T4 DNA的包装速度（Lin et al. 2017）。2019年，测量单个类病毒颗粒围绕捕获DNA的自我组装（Marchetti et al. 2019）。2020年，研究SV40类病毒颗粒的多步骤组装机制（Rosmalen et al. 2020）。2021年，研究HBV自我组装起始的能量学（Buzón et al. 2021）。2023年，测量SARS-CoV-2的DNA包装能力（Morse et al. 2023）。2023年，研究噬菌体lambda包装马达与DNA的相互作用（Rawson et al. 2023）。2024年，研究埃博拉病毒糖蛋白的膜结合机制（Vaknin et al. 2024）。

当一个透明微粒与聚焦光束相互作用时，它会受到两种不同的力：梯度力（Fgrad）和散射力（Fscat）（Rohrbach and Stelzer 2001）。梯度力将物体拉向光强度较高的区域，其大小与光强度的梯度成正比。散射力源于微粒对光的吸收和散射。这种力通常会将颗粒推向入射光的方向（Ashkin 1970, Bustamante et al. 2021）。在高度聚焦的激光束中，梯度力可以克服散射力，从而在三维空间中稳定地捕获物体（Bustamante et al. 2021, Ashkin 2000）。图2展示了捕获微粒的示意图，以及涉及的力和入射光的反射和折射过程。

图2
对于与光相互作用的介电球体，入射光束由高数值孔径透镜聚焦（Bustamante et al. 2021）。(a) 如果颗粒的尺寸远小于光波长，可以将其视为瑞利散射体。此时，颗粒所受的光学力表现为散射力（Fscat，红色箭头），将颗粒推向光传播的方向；以及梯度力（Fgrad，黑色箭头），将其拉向光束的焦点。(b) 如果颗粒的尺寸大于光波长，可以使用光线学来描述这些力。颗粒作为折射体，折射入射光线（粉色箭头），这些光线被高数值孔径透镜聚焦。这些折射改变了光的动量，在颗粒上产生相等且相反的力。反射光线将颗粒向前推（反射，红色箭头），而折射光线将其拉向焦点（折射，黑色箭头）。图片来源于参考文献（Bustamante et al. 2021），经许可使用。

在典型的光学镊子实验中，感兴趣的生物样本（例如小病毒或DNA分子）太小，无法直接被聚焦激光光捕获。相反，它被固定在一个微米级的微粒上，这种微粒通常由聚苯乙烯或二氧化硅制成，直径约为0.2至5微米（Neuman and Block 2004）。常用的连接分子，如生物素-链霉亲和素或称为“分子把手”的双链DNA片段，用于将感兴趣的分子连接到微粒上（Cecconi et al. 2008, Hashemi Shabestari et al. 2017）。

为了正确讨论光学镊子的物理原理，需要区分小于光波长的物体（称为瑞利散射体）和大于光波长的物体（表现为折射体）（Arias-Gonzalez 2024, Bustamante et al. 2021, Rohrbach and Stelzer 2001）。作用在瑞利散射体上的散射力可以表示为（Bustamante et al. 2021）：
$$\:{ \overset{\lower0.5em\hbox{$\smash{\scriptscriptstyle\rightharpoonup}$}} {F} }_{scat}=\frac{{n}_{m}\sigma\:}{c}\langle\overset{\lower0.5em\hbox{$\smash{\scriptscriptstyle\rightharpoonup}$}} {S} \rangle$$
其中，\(\:\sigma\:\) 是消光截面，nm是折射率，c是光速，\(\: \overset{\lower0.5em\hbox{$\smash{\scriptscriptstyle\rightharpoonup}$}} {S}\) 是坡印廷矢量，它与光的动量成正比，并指向光传播的方向（Bustamante et al. 2021, Rohrbach and Stelzer 2001）。作用在瑞利散射体上的梯度力表示为（Bustamante et al. 2021）：
$$\:{ \overset{\lower0.5em\hbox{$\smash{\scriptscriptstyle\rightharpoonup}$}} {F} }_{gradient}=\:\frac{\alpha\:}{2c{n}_{m}{\epsilon}_{0}}\nabla\:I$$
其中，\(\:\alpha\:\) 是颗粒的极化率，\(\:{\epsilon}_{0}\) 是真空的介电常数。因此，梯度力与强度梯度成正比，并指向强度最高的点。最常用的激光束具有高斯强度分布，因此梯度力将颗粒吸引到光束的中心。通过生成紧密的焦点，梯度力也将颗粒拉向焦点，从而在三个方向上捕获颗粒。应该注意的是，这是一个简化的解释，更正式的描述可以在文献中找到（Bustamante et al. 2021, Rohrbach and Stelzer 2001）。

对于大于光波长的物体，基于几何光线学的物理描述更为直观。光学镊子中使用的微粒通常与激光波长相当或更大。遇到激光束的物体要么折射要么反射部分光。这两种情况都会导致光的方向改变，因此动量也会改变。根据动量守恒定律，需要一个相反方向的力来平衡这些力（见图2）。当物体上的所有力相互抵消时，就会形成一个稳定的光学陷阱，这发生在焦点内部。因此，使用高数值孔径（NA）物镜产生紧密的焦点对于获得稳定的光陷阱至关重要（Bustamante等人，2021年）。在真实的光学镊子装置中，激光光通过显微镜物镜聚焦到样品室中以生成光陷阱。透射光被聚光透镜收集并导向位置敏感探测器。在激光束中稳定地捕获单个分子非常具有挑战性，尤其是在存在许多相同分子的情况下。相反，大多数光学镊子装置使用相对较大的珠子，分子可以附着在这些珠子上。通过移动陷阱来操纵珠子可以对系统施加机械力。此外，作用在珠子上的力可以精确测量，因为任何力都代表珠子动量的变化，而根据动量守恒原理，这会引起捕获激光束的偏转。该信号由位置敏感的光电探测器记录下来，并且通过仔细校准，可以检测为力或运动。在光陷阱中的珠子会受到类似弹簧的力（即对于缓慢的变形，该力可以用胡克定律合理描述，\(F\:=\:-kx\)，其中k是弹簧常数，x是从平衡位置的距离），弹簧常数的数量级为0.1 pN/nm。检测和量化生物物理过程需要对仪器进行仔细校准。最常见的校准方法包括布朗运动校准和粘性阻力校准（Bustamante等人，2021年）。

大多数早期的光学镊子实验都是使用单个陷阱进行的。大病毒可以直接被捕获到聚焦的激光束中，或者将涂有病毒的珠子捕获。或者，将核酸分子附着在珠子上（图3）。例如，可以通过将生物素分子共价连接到核酸上来实现这一点，生物素与珠子上的链霉亲和素分子有很强的结合力。然后，这些分子在另一端被固定在玻璃盖片上或被吸入微吸管中（Bustamante等人，2021年；Smith等人，2001年；Heller等人，2014年）。除了单光陷阱装置外，双光陷阱也变得普遍，其中两个珠子被分别捕获在不同的光陷阱中。双光陷阱可以通过将激光束分成两部分或使用声光偏转器（AOD）来实现。AOD是一种可以利用声波快速偏转光束的装置（Bustamante等人，2021年）。激光在两个焦点之间快速切换，以维持两个光陷阱。这减少了某些机械振动和漂移的来源，大大降低了信号中的噪声（Heller等人，2014年）。当使用具有多个层流通道的流动室时，双陷阱可以快速从一个通道移动到另一个通道，实现近乎即时的缓冲液交换。

图3：这个图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

光学镊子的实验几何结构，包括病毒和核酸连接物。a) 单个病毒被聚焦在样品室中心的红外激光捕获。b, c) 单陷阱OT装置，用于玻璃表面（b）或微吸管（c）上的核酸连接物；d) 双陷阱光学镊子装置，用于捕获核酸；e) 双陷阱光学镊子装置，使用共聚焦荧光显微镜成像蛋白质。灵感来自参考文献（Heller等人，2014年）。

通常，在双光陷阱光学镊子实验中，两个陷阱使用相同或相似的珠子。例如，单分子dsDNA的拉伸通常使用两个陷阱上的链霉亲和素涂层聚苯乙烯珠子进行。除了在两个陷阱中使用相同的珠子外，也有报道使用具有不同涂层或“把手”的不同大小的珠子，并通过微流控技术进行加载以适应实验设计。例如，2024年发表的一项研究使用两种不同功能化的聚苯乙烯珠子来研究埃博拉病毒的融合过程：一种珠子上共价连接了生物素化的dsDNA，另一种珠子上呈现链霉亲和素-生物素化的GP?TM-膜复合物（Vaknin等人，2024年）。将荧光显微镜引入光学镊子装置最近变得流行起来（Hashemi Shabestari等人，2017年）。虽然光学镊子可以实时监测力和动态，但荧光显微镜可以直接探测标记分子的定位、身份、数量和运动。这种方法可以用来识别和追踪与核酸链相互作用的标记分子。此外，通过光漂白实验，可以确定来自单个荧光团的信号强度。这允许量化结合的蛋白质数量。随时间监测结合的蛋白质数量可以得到吸附曲线，可以拟合吸附模型以提取热力学参数（Marchetti等人，2019年）。随时间的荧光信号可以以Kymograph的形式呈现（Marchetti等人，2019年；Buzón等人，2021年）；其中一个轴代表空间维度，另一个轴代表时间。Kymograph不仅包含关于结合蛋白质数量的信息，还包含每次结合事件中结合的蛋白质数量以及蛋白质寡聚体沿基底的扩散情况（Marchetti等人，2019年；Buzón等人，2021年）。

除了荧光标记的蛋白质外，使用具有特殊性质的染料可以提供更具体的信息。一个例子是使用嵌入染料，这种荧光染料只有在嵌入双链核酸的碱基对之间时才会发出荧光（Buzón等人，2021年）。因此，这种染料可以用来定位和监测核酸的双链区域。

**利用光学镊子理解病毒**

早在1987年，Arthur Ashkin就利用光学捕获技术来操纵病毒和细菌。他使用大约120毫瓦的氩激光功率来捕获水溶液中紧密堆积的单独烟草花叶病毒和病毒群（Ashkin和Dziedzic，1987年）。这激励了许多科学家进一步研究使用光学镊子操纵生物分子和病毒。例如，在1996年，Mammen等人开发了一种使用两个光陷阱的检测方法，以在受控生物条件下研究两个粒子之间的碰撞（图4）。他们研究了流感病毒覆盖的球体在各种附着抑制剂存在下与红细胞的粘附情况（Mammen等人，1996年）。图1还给出了其他几个使用光学镊子在物理病毒学中的例子。Ashkin在2000年的综述中回顾了光学捕获和操纵小中性粒子、原子和分子的历史，并预见使用光学镊子操纵各种物质（如细菌、病毒、T细胞、核糖体甚至非生物实体）的进一步研究（Ashkin，2000年）。

图4：这个图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

示意图展示了两个粒子之间受控碰撞的实验装置。流感病毒覆盖的微球（示意图中的黄色）被移动的陷阱捕获并移动。另一个陷阱保持静止，捕获单个红细胞。转载自参考文献（Mammen等人，1996年），经许可。

由于病毒体积小，容易被捕获后逃逸，以及光学镊子研究的重点转向DNA拉伸和DNA-蛋白质相互作用，使用光学镊子操纵单个病毒的开创性工作并没有得到太多后续研究。然而，在2010年，McNerney等人使用光学镊子在接近HIV Gag-iGFP转染的Jurkat T细胞附近操纵未感染的初级CD4+ T细胞，以研究诱导稳定粘附的因素（McNerney等人，2010年）。之后，Cheng实验室使用光学镊子在接近生理条件下稳定捕获、操纵并测量单个HIV-1病毒颗粒（图5）。在这项研究中，活的HIV-1病毒液在没有固定程序的情况下稀释在完全培养基中并注入微流控室（Pang等人，2014年）。当HIV-1颗粒被聚焦在室中心的830纳米红外激光捕获时，由于捕获激光同时对EGFP进行双光子激发，病毒在黑暗背景下立即变得“可见”。除了通过EGFP荧光信号检测病毒颗粒外，还通过观察物镜后焦平面（BFP）的激光偏转变化确认病毒被捕获。不同的偏转信号可以区分是单个病毒颗粒还是病毒聚集体被捕获，从而区分病毒颗粒的大小。单个颗粒和病毒聚集体表现出与谐振势中颗粒的布朗运动一致的行为（Pang等人，2014年；Neuman和Block，2004年）。

图5：这个图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

HIV病毒颗粒的光学捕获。(a) 实验装置的示意图，其中单个HIV-1病毒颗粒被引入微流控室并通过光学镊子固定到位。捕获是通过聚焦在室中心的红外激光实现的。(b) 被捕获的HIV病毒颗粒的双光子荧光（TPF）图像。比例尺，10微米。(c) 单个捕获的HIV病毒颗粒的不同TPF时间过程。(d) 使用后焦平面（BFP）干涉测量实时激光偏转。(e) 从d)中的数据计算出的功率谱及其拟合（绿色曲线）到混淆的洛伦兹分布。转载自参考文献（Pang等人，2014年），经许可。

在随后的研究中，Cheng实验室继续使用HIV-1作为光学镊子研究的模型病毒。他们精确确定了单个病毒的折射率，并以单分子分辨率量化了单个病毒之间的异质性。此外，他们还开发了一种微技术，将单个HIV-1病毒颗粒物理输送到溶液中的单个宿主细胞中（图6a），为研究病毒-细胞相互作用开辟了新的途径（Hou等人，2016年；Pang等人，2016年；Schimert和Cheng，2018年）。病毒-细胞相互作用也以稍微不同的方式进行了研究。不是通过DNA分子将病毒颗粒连接到珠子上，而是直接将颗粒涂覆在珠子上。这样，研究了流感病毒颗粒与细胞的结合（Sieben等人，2012年）。研究发现，流感A X-31病毒颗粒与细胞表面的唾液酸（SA）有强烈且特异的结合（图6b）。使用病毒涂层的聚苯乙烯珠子进行的力测量显示，与中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的结合力约为12 pN，在Madin–Darby犬肾（MDCK）细胞上则高达约23 pN，这可能是由于SA密度较高。神经氨酸酶处理显著降低了结合概率，证实了SA的特异性相互作用。在CHO细胞上的动态力谱显示了加载速率和断裂力之间的线性关系，表明存在单一的能量障碍（图6c和d）。需要注意的是，通常解释加载速率-断裂力依赖性是具有挑战性的，当相互作用很少时，即通常测量的是单个键的断裂而不是多个键的断裂时，这种解释会简化（Merkel等人，1999年）。通过将聚苯乙烯珠子涂覆DENV颗粒，研究了登革热病毒（DENV）与细胞上的多巴胺2型受体（D2R）的相互作用（Arifin等人，2024年）。然后将涂覆的珠子与CHO细胞接触。DENV与表达D2R的细胞之间的结合力量化为约50-60 pN，表明存在特异性相互作用。用D2R拮抗剂处理显著降低了结合力，证实了D2R作为DENV附着因子的功能作用。这些结果表明D2R可能是DENV的潜在受体，可能成为抗病毒策略的目标。

图6：这个图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

单病毒力谱研究病毒与细胞的相互作用。(a) 在单个DNA末端连接单个HIV-1病毒颗粒的示意图设计。然后可以通过DNA连接物操纵病毒颗粒，以探测病毒颗粒与固定在微吸管顶部的细胞之间的相互作用。(b) 测量珠子上病毒与生长在玻璃底Petri皿中的粘附细胞之间结合力的示意图设计；(c) 当珠子表面被BSA阻断时，无法检测到病毒涂层珠子与CHO细胞之间相互作用的力-距离曲线（c，插图）；(d) 表示CHO细胞表面单病毒-受体相互作用的动态力谱。每个数据点对应一个单独的结合事件，其中最可能的断裂力与加载速率相对应。误差条反映了陷阱刚度校准和断裂力测定的不确定性（Sieben等人，2012年）。经许可转载自参考文献（Schimert和Cheng 2018年，Sieben等人2012年）。最近，研究人员采用了一种新的方法来研究单个病毒，在测量过程中同时增强了光学陷阱的效果。利用集成的光学镊子系统和激光共聚焦荧光成像装置，成功捕获并实时成像了单个H9N2病毒（Xu等人，2023年）。同时，还可以基于培养基中的多个参数进行定量分析。研究表明，用量子点（QD）标记的单个H9N2病毒比未标记的病毒产生了更大的梯度力和陷阱刚度（图7a）。这种增加的陷阱刚度与QD诱导的被捕获结构的极化率增加有关（Xu等人，2023年）。尽管在这项工作中，QD标记被有效地用于用光学镊子捕获病毒，但这种方法无法区分不同类型的病毒。2024年发表的一项研究为将光学陷阱技术应用于物理病毒学研究提供了新的可能性。与受高能激光和光衍射限制的传统自由空间光学镊子不同，该论文利用近场光学技术，提出了一种使用集成共振光子晶体（PhC）腔作为光学纳米镊子的创新方法（图7b和c）（Villa等人，2024年）。他们发现L3槽纳米腔可以在不需要标记或特定表面生物受体的情况下区分细菌和噬菌体（图7c）。此外，通过调节低折射率介质中共振光学模式的空间范围，可以精确识别噬菌体家族内的不同表型。这项工作为在物理病毒学中使用光学镊子提供了新的见解，包括噬菌体疗法应用等方向（Villa等人，2024年）。

图7
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。
全尺寸图像
单病毒的光学捕获与检测。(a) 单个R18标记和QD标记的H9N2病毒的陷阱刚度直方图（Xu等人，2023年）。(b) 在光子晶体（PhC）腔中对单个细菌进行光学捕获时的归一化透射信号；(c) 在L3槽腔（PhC腔之一）上对Myoviridae、Podoviridae和Ackermannviridae进行光学捕获时的透射特性（归一化透射位移）比较（Villa等人，2024年）。经许可转载自参考文献（Xu等人，2023年；Villa等人，2024年）。

基因组包装
病毒将病毒核酸封装在一个称为衣壳的蛋白质壳内，以保护其遗传物质，这一过程称为基因组包装。观察到两种不同的病毒组装途径。在一种途径中，病毒基因组和衣壳蛋白共同组装（Buzón等人，2020年；Daudén等人，2024年；Perlmutter和Hagan，2015年）；而在另一种途径中，首先形成一个空衣壳（前衣壳），然后通过ATP驱动的分子马达将其填充（Casjens，2011年；Prevo和Earnshaw，2024年）。在包装过程中，病毒核酸被压缩到非常高的密度。在一些冷冻电镜重建中，选定的粒子类别可以在衣壳内显示出同心、分层的密度；然而，这种外观可能是由于具有更高局部有序性的子集的平均结果，而其他研究则报告了无序或粒子特定的基因组排列（Comolli等人，2008年；Berndsen等人，2014年；Jin等人，2015年）。因此，内部基因组组织可能不是普遍存在的，而是系统依赖的，并且可能随衣壳几何形状、离子和静电条件以及非平衡包装动力学而变化（Jin等人，2015年）。光学镊子技术在研究病毒包装过程中显示出独特的优势，因为它允许在生物物理环境中操纵与大量衣壳蛋白相互作用的单个核酸分子，从而密切模拟真实的病毒包装过程。这些研究建立在之前使用光学镊子拉伸双链和单链形式的单个DNA或RNA分子的基础上，提供了对其机械性质的深入理解（Smith等人，1996年；Bustamante等人，2003年）。从结构和物理病毒学的角度来看，核酸的构象动力学起着关键作用。对这些核酸的拉伸测量对于理解参与核酸包装的蛋白质和分子复合物的能量障碍和功能至关重要。在本节中，我们将首先关注研究ATP驱动的分子马达将病毒基因组包装到已形成的衣壳中的过程。接下来，我们将讨论围绕基因组的自组装。

使用分子马达的基因组包装
许多有尾的双链DNA噬菌体，以及例如单纯疱疹病毒，首先组装一个无基因组的衣壳，即所谓的前衣壳或前头部。前衣壳在支架蛋白的帮助下组装，一旦外壳闭合，支架就被酶切并通过外壳上的小孔排出。支架曾经所在的位置现在可以被病毒基因组占据。对于像phi29、lambda和T4这样的双链DNA噬菌体，以及其他病毒，存在一种门控蛋白（头尾连接蛋白），它参与衣壳的组装并形成一个多亚基环，在完全组装的衣壳中形成门控通道。包装马达对接到这个环上，DNA通过这个位于衣壳独特顶点的门控结构进入和退出（图8a）。包装马达通常包括门控蛋白和与其结合的末端酶复合体。末端酶包含一个大的末端酶亚基、包装ATP酶和一个小的末端酶亚基、DNA识别蛋白，其寡聚状态和化学计量比在不同噬菌体系统中有所不同（Casjens，2011年）。马达位于空前衣壳的一个顶点（Sun等人，2010年）。包装马达能够将几微米长的DNA分子包装到直径只有20-100纳米的前衣壳中。这个过程要求马达克服巨大的能量和熵惩罚，并抵抗来自衣壳内部的显著压力（Sun等人，2010年）。大约在1995年的早期单分子研究中，开发了光学镊子方法来操纵单个DNA分子，并将其应用于量化基本物理性质，如松弛动力学和弹性响应（Perkins等人，1994年；Smith等人，1996年）。通过创新地用生物素标记DNA末端，操纵核酸变得更加容易。这些早期方法随后从裸露的核酸扩展到病毒系统，使得可以直接测量DNA包装到衣壳中的力学和动力学。双链DNA噬菌体\({\upphi\:}\)29、\({\uplambda\:}\)和T4是使用光学镊子研究最广泛的噬菌体。在Bustamante实验室2001年的一项开创性研究中，首次在单分子水平上跟踪了\({\upphi\:}\)29 dsDNA的包装过程（Smith等人，2001年）。

为了测量马达的DNA包装，他们首先启动包装，然后用不可水解的ATP类似物ATP-γS停止它。整个复合体被固定在未包装的DNA末端的一个链霉亲和素涂层的微球上，该微球被注入含有ATP的微流控腔室中。这个微球被光学陷阱捕获。然后引入一个涂有抗\({\upphi\:}\)29抗体的第二个微球，并用微吸管捕获（图8b和c）。通过控制和移动微球的位置，两个微球被拉得足够接近，使得前头部在几秒钟内与抗\({\upphi\:}\)29微球结合，从而在两个微球之间形成稳定的连接（Smith等人，2001年）。这些实验表明，\({\upphi\:}\)29马达对DNA施加的力量高达约60 pN，使其成为已知的最强大的生物马达之一。在饱和ATP的条件下，最大包装速率约为100 bp/s。然而，当前头部填充超过50%后，包装速率开始下降，当病毒基因组（长约6微米）接近完全包装时，速率接近零。通过将这些数据与在外部负载下测量的力-速度关系进行比较，研究表明在包装过程中衣壳内部会积累一个静电反力。为了进一步研究这一假设，Fuller等人系统地研究了离子条件对DNA包装的影响（Fuller等人，2007年）。他们的结果显示，离子强度独立调节马达活性和抵抗DNA限制的内部力。虽然Mg2+（约1 mM）对马达功能至关重要，但添加100 mM Na+在没有负载的情况下显著增加了马达的速度。相比之下，当Na+是主要离子时，抵抗包装的内部力增加了约80%。此外，增加总离子强度减少了内部力，支持了静电排斥是包装过程中遇到的内部阻力的关键因素这一观点。

图8
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。
全尺寸图像
使用光学镊子研究噬菌体基因组包装。(a) 显示噬菌体组装过程的卡通图（Prevo和Earnshaw，2024年）。(b) 实验装置（Smith等人，2001年）。(c) 显示在恒定力模式下DNA包装（蓝色）和\({\upphi\:}\)29包装马达在恒定伸展模式下产生的大作用力（红色）的特征轨迹，该作用力在55 pN左右停滞。插图：放大显示随机滑动事件（Smith等人，2001年）。经许可转载自参考文献（Smith等人，2001年；Prevo和Earnshaw，2024年）。

几年后，Smith的团队通过将预先组装好的头部-马达复合体连接到一个小球上，将DNA连接到另一个小球上，改进了该系统（Rickgauer等人，2008年）。当两者靠近时，马达与DNA结合并开始包装。这种设置允许从开始到结束测量DNA的移动，从而能够研究以前未表征的包装早期阶段，并更准确地测量被包装的DNA长度。实验结果可以推断出内部力约为110 pN，假设马达速度仅取决于相反的负载。然而，后续研究表明，马达随衣壳填充而减慢的部分是由于内部力，而另一部分是由于随着DNA密度增加而发生的ATP结合率的别构调节，将内部力的估计值修正为约20-30 pN（Berndsen等人，2015年；Liu等人，2014年）。研究发现，在头部填充的前半段，DNA的移动速率显著下降，而不是保持恒定。此外，包装开始时的平均DNA移动速率约为165 bp/s，这比在5 pN力夹具条件下部分填充的衣壳下之前测量的平均速率约100 bp/s高出约50%（Smith等人，2001年）。作者将这种差异归因于两个主要因素：接近零填充时的速度大约比填充三分之一时的速度快25%，接近零负载时的速度大约比5 pN时的速度快15%。剩余的约10%的差异归因于本研究中使用的新的启动方法以及双光学镊子仪器使得填充水平能够更精确地确定。

此外，Bustamante一直对\({\upphi\:}\)29 DNA包装马达的动态工作模式感到好奇（Bustamante和Yan，2022年）。他的实验室研究了各种实验参数（如ATP浓度、DNA底物的结构变化以及马达蛋白的突变）对DNA包装马达步进行为的影响。在饱和ATP（0.5 mM）下的初始马达速度随着力的增加而降低（Chemla等人，2005年）。利用高分辨率光学镊子，他们发现包装是以10个碱基对（bp）的增量进行的。对这些增量之前的停留时间的统计分析表明，在每个停留阶段有多个ATP分子结合。当施加高力时，很明显每个10 bp的增量实际上由四个2.5 bp的步骤组成（Moffitt等人，2009年）。大约在同一时间，他们试图确定马达和DNA之间的相互作用是什么导致了观察到的高达70 pN的停滞力。他们创建了具有不同片段大小的DNA分子（5、9、10、11、15和30 bp），其中磷酸基团已被中和。通过中和特定的DNA链，他们证明了这种马达在停留阶段每十个碱基对会接触两个相邻的DNA磷酸基团，但仅限于以5’到3’方向包装的链（Aathavan等人，2009年）。之后，他们研究了DNA包装机制中马达亚基之间的协调作用。使用不可水解的ATP类似物ATP-γS，发现单个类似物的结合会导致马达暂停，这表明马达亚基在这些暂停期间仍然保持协调，并产生10个碱基对的移动增量。此外，使用Na+-orthovanadate实验表明，阻止ADP的释放也会导致暂停，这表明在停留阶段ADP的释放是协调进行的。这解释了马达缺乏协同性的现象。另外，还发现非机械亚基也能结合并水解ATP，从而解决了整体研究和单分子研究之间的差异，表明每个循环消耗五个ATP，但只有四个ATP真正参与了DNA的移动（Chistol等人，2012年）。接下来，研究了在正常条件下特殊亚基在马达中的作用。研究表明，\({\upphi\:}\)29马达不仅在包装过程中产生力量，还引入了扭矩。为了确保这一观察结果不是由于DNA在衣壳内的卷曲造成的，研究人员对病毒头部进行了反复的冷冻和解冻处理，以打开孔洞，使DNA能够泄漏出来。在这些条件下，马达仍然以每十个碱基对1.5±0.2度的速度旋转DNA。还观察到，随着衣壳的填充，移动的增量从10个碱基对减少到9个碱基对，这可能是由于压力增加所致。这些变化表明特殊亚基在每个10个碱基对的移动增量结束时接触DNA磷酸基团，从而调节马达的循环。马达通过每次移动14度来维持与DNA的接触。这种旋转补偿了移动增量的减少，使特殊亚基能够持续与DNA接触并调节马达的机械化学循环（Liu等人，2014年）（图9）。接下来，研究人员创建了能够破坏这种协调的突变体，特别针对精氨酸残基R146，观察到含有单个突变亚基的马达表现与结合了一个ATPγS的马达相似。然而，在这种情况下，改变的表型是永久性的，并且是突变体马达固有的（Tafoya等人，2018年）。在最近的一项研究中，团队对涉及各种核酸的包装步骤进行了动态分析。包装马达经历一个循环过程，在ATP装载停留期和水解移动期之间交替，从而能够在四个不同的步骤中包装一圈DNA。提出了一种螺旋尺蠖式迁移机制，表明在ATP装载停留期间，马达采用锁紧垫圈结构，在每次水解移动期间恢复到平面形式。这种机制阐明了马达在遇到不同核酸时的差异行为。具体来说，当遇到DNA-RNA混合物和双链RNA时，马达会调整其移动增量以适应较短的螺旋间距，通过缩短第四步来实现，同时保持前三步的一致性。此外，对含RNA底物的间歇性抓握损失表明，马达与双链DNA的相互作用是最优的（Castillo等人，2021年）。

图9

Bustamante团队数十年来对\(\:\phi\:\)29 DNA包装马达的研究成果的总结图示。a) 展示了停留期和移动期间发生的化学过程的示意图（Liu等人，2014年）。b) 螺旋尺蠖机制的示意图解释（Tong和Bustamante，2021年）。

除了Smith和Bustamante实验室对\(\:\:{\upphi\:}\)29的研究外，其他病毒包装马达的机械化学性质也得到了研究。Smith实验室扩展了光学镊子的应用，研究了噬菌体λ，而Smith和Chemla实验室则对噬菌体T4进行了类似的研究，两者都使用了与\(\:\:{\upphi\:}\)29类似的方法。他们的研究表明，尽管包装方法不同，但高力量生成是病毒包装马达的共同特征。值得注意的是，他们发现T4马达的移动速率非常高，平均为700 bp/s，最高可达2000 bp/s（Fuller等人，2007年）。对于λ噬菌体，他们的研究检测到在总包装过程的30%阶段发生了前衣壳的扩张（Fuller等人，2007年）。基于这些系统，使用单分子光学镊子测量突变型λ和T4马达，确定了性能的残基级决定因素，包括将ATP识别与DNA结合的Q基序、调节移动速度和过程性的保守螺旋环区域，以及协调ATP水解与机械输出的P环NTP酶元件（Tsay等人，2009年；Tsay等人，2010年；delToro等人，2016年；delToro等人，2019年；Ortiz等人，2019年）。进一步的研究表明，一种催化性的谷氨酸与精氨酸协同作用，介导水解和机械化学耦合，并通过显示带电残基和离子条件的变化调节T4中的力量生成，支持了电静力对力量生成的贡献（Migliori等人，2014年）。这些结果共同表明，特定的残基和基序决定了ATP的结合和水解速率，控制了耦合效率，并调节了病毒包装马达的速度和最大力量。

随后，Rao及其同事报告了T4噬菌体前头部和已填充头部相似的包装活性率。他们发现，完全包装的头部以及大部分DNA被清除的头部都可以重新组装并重用包装机制。此外，他们发现各种外源DNA分子可以通过多个启动步骤填充T4衣壳（Zhang等人，2011年）。2017年，他们还研究了包装马达的运行速度，发现突变马达的ATP水解速率降低了约2.5倍，DNA包装速度降低了2.5到4.5倍。此外，发现激活gp16蛋白对于快速刺激ATP酶是必需的（Lin等人，2017年）。2018年，Smith和Rao团队对T4包装马达的合作研究表明，核苷酸依赖性的DNA抓握机制限制了基因组包装开始后的释放，确定了抓握状态和通道结构如何在负载下调节过程性（Ordyan等人，2018年）。2023年，Smith团队将这些测量扩展到λ马达，并量化了无TerS的T4末端酶复合体和包含TerS的λ末端酶复合体之间的核苷酸依赖性和非依赖性抓握以及移动过程中的摩擦。比较表明，TerS是过程性的关键决定因素，它作为一个滑动夹具，在TerL暂时失去抓握时限制了向后滑动（Rawson等人，2023年）。这些结果共同表明，T4和λ包装复合体都使用了“DNA末端夹具”机制，核苷酸控制的抓握调节了基因组包装过程中的过程性。

总结光学镊子在双链DNA包装研究方面的成果，可以简要如下：\({\upphi\:}\)29、λ和T4包装马达的特性基于它们的力量、速度和过程性，不同噬菌体的包装速度差异显著。最慢的是\({\upphi\:}\)29，速度约为100 bp/s（Smith等人，2001年），而λ噬菌体的速度约为600 bp/s（Fuller等人，2007年）。T4噬菌体表现出最高的包装速率，平均约为900 bp/s（Fuller等人，2007年；Kottadiel等人，2012年），在某些情况下甚至达到2000 bp/s（Fuller等人，2007年）。噬菌体的基因组长度也有类似的趋势，表明基因组大小与包装速度之间存在关系，因为不同噬菌体的感染寿命相似，所有噬菌体都在大约3-5分钟内完成基因组包装（Rao和Feiss，2015年）。所有这些包装研究的一个普遍观察是，随着衣壳填充的增加，马达速度降低，因此抵抗力也增加（Smith等人，2001年；Fuller等人，2007年；Fuller等人，2007年；Fuller等人，2007年）。这些包装马达具有很高的过程性；它们能够以每次10个碱基对的增量移动长段的DNA（几千个碱基对），从而一次完成许多催化循环。在所有这些马达中都观察到了马达的暂停和滑动现象。根据ATP水解的自由能变化（约120 pN·nm），实验确定的最大力量下限约为60 pN，以及每次ATP水解约2.5个碱基对的步长，估计这些包装马达的能量效率至少为30%（Rao和Feiss，2015年）。噬菌体包装马达能够在紧密协调五个ATP酶亚基的同时克服DNA包装的大能量消耗，这为了解噬菌体的生物学特性以及强分子马达的化学和物理学提供了宝贵的见解。

然而，基于分子马达的基因组包装不仅发生在DNA病毒中。2017年，Hanhij?rvi等人首次使用光学镊子研究了\(\:\:{\upphi\:}\)6噬菌体的RNA包装细节（Hanhij?rvi等人，2017年）。这种包装过程的复杂性归因于病毒的基因组。\(\:\:{\upphi\:}\)6噬菌体是一种双链RNA病毒，其正链（+）单链RNA（ssRNA）基因组前体被包裹在预先形成的前衣壳（PC）中，促进了负链的合成。研究结果表明，包装过程是间歇性的，在慢速和快速阶段之间交替进行，这可能反映了RNA二级结构展开的差异。尽管整体平均包装速度较低（0.07–0.54 nm/s），但在快速包装阶段速度可以达到4.62 nm/s。

大多数单链基因组病毒通过被动共组装途径进行组装，其中基因组在衣壳蛋白的组装过程中被压缩。已经观察到，许多不同的病毒在仅含有衣壳蛋白和遗传物质的缓冲液中会自发形成有传染性的病毒颗粒，这表明这是一个与酶活性或其他能量来源无关的被动过程。因此，组装在能量景观中趋于最小化，同时显著压缩了长核酸分子（Buzón等人，2020年）。基因组作为衣壳蛋白组装的模板，图10展示了一个病毒样蛋白质诱导核酸链缩短的例子。基于理论和计算机模拟，已经提出了几种衣壳组装途径，这些途径取决于蛋白质-蛋白质和蛋白质-基因组之间的平衡（Perlmutter等人，2014年；Zlotnick等人，2013年）。其中两种途径分别是具有强蛋白质-蛋白质相互作用的有序成核和生长机制（图11b），以及具有较弱蛋白质-蛋白质相互作用的无序集体机制（图11c）。然而，由于系统的异质性，这些过程的动力学和动态在原位研究非常困难。直到最近，才有可能使用实时单粒子方法研究病毒组装过程（Marchetti等人，2019年）。这些方法，包括光学镊子，是阐明这一过程的强大工具，因为它们可以提供单个粒子的实时信息，以及集合平均值和分布。组装可以在准天然环境中进行研究，并且可以轻松调整盐浓度和pH等因素。大多数单粒子研究结合了几种不同的技术，提供了尽可能完整的组装过程动态视图。在本节中，重点介绍了光学镊子实验对该领域的一些关键贡献。

在最早的关于螺旋VLP组装的单粒子研究中（Marchetti等人，2019年），一个双链DNA分子被固定在两个珠子之间，然后暴露于合成多肽中，以研究肽组装成棒状病毒样颗粒的动态过程。这个系统作为烟草花叶病毒（TMV）的模型，多肽被荧光标记。将荧光方法引入OT实验是一种非常强大的方法，可以增加可以获得的信息量。实验结果显示了不同大小的荧光颗粒在DNA基底上的移动。此外，研究还表明，随着荧光强度的增加（图10a），DNA的拉伸长度会缩短，因此结合的多肽数量也会增加。随时间变化的荧光强度数据显示，结合动力学与相对简单的朗缪尔吸附模型（图10c）吻合得很好，这允许计算平衡常数和结合自由能的变化。此外，还可以确定每次结合事件中多肽的绝对数量。监测多肽寡聚体在基因组上的移动性发现，对于超过五个亚基的寡聚体，其扩散常数几乎降为零（图10d）。这表明存在一种经典的、有序的成核-生长机制（Marchetti等人，2019年），其中蛋白质-蛋白质相互作用很强（图11b），临界核大小为五个蛋白质。

除了螺旋病毒外，这种方法还被用于研究二十面体衣壳的组装过程。使用猴病毒40（SV40）病毒样颗粒作为模型系统，揭示了SV40病毒样颗粒（VLPs）围绕双链DNA（dsDNA）的多步组装机制（Rosmalen等人，2020年）。最初，VP1五聚体与DNA的结合显著缩短了DNA的持久长度。此外，五聚体似乎稳定了DNA的环状结构。随后，五聚体之间的相互作用形成了具有缩短轮廓长度的中间结构。这些结构最终稳定为颗粒，使DNA的轮廓长度永久缩短，这与野生型SV40中观察到的DNA压缩一致。这些数据表明，多步机制可以导致完全组装的交联SV40颗粒。特别是，这一过程涉及强烈的蛋白质-基因组相互作用和较弱的蛋白质-蛋白质相互作用，从而形成无序的路径（图11c）。VP1五聚体迅速与DNA结合，从而增加了VP1五聚体的局部浓度，DNA起到天线的作用，然后每个VP1五聚体之间的多个DNA结合位点形成了环状结构，进一步压缩了DNA。此外，这种压缩通过增加五聚体的局部浓度形成了许多中间结构，随后由于二硫键的形成，这些中间结构随时间稳定下来。

图10：该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。

全尺寸图像：基因组周围的组装（Marchetti等人，2019年；Rosmalen等人，2020年；Buzón等人，2021年）。(a) 衣壳样多肽对DNA的逐步包装（i）伴随着荧光强度的增加（ii），直接关联了多肽与DNA包装的过程。(b) 显示两种不同浓度下多肽随时间结合到DNA上的曲线图。(c) 从(b)中的曲线图来看，多肽的结合遵循朗缪尔吸附行为。(d) 多肽寡聚体的扩散常数，显示含有超过5个多肽的寡聚体的移动性急剧下降。插图：随时间变化的单个寡聚体大小，表明从含有超过5个多肽的寡聚体开始时，生长的可能性更大。(e) SV40 VP1五聚体分布的断裂步长，平均步长为40±1纳米。(f) 使用插层染料SYTOX green来定位HBV衣壳蛋白诱导的dsDNA区域的设置示意图，图像和曲线图显示dsDNA区域随时间保持稳定。经参考文献（Marchetti等人，2019年；Rosmalen等人，2020年；Buzón等人，2021年）许可复制。

2021年，通过关注衣壳蛋白与基因组的相互作用，研究了HBV病毒的包装过程的特点。这项研究创新性地结合了荧光光学镊子和高速原子力显微镜技术，以提高分辨率。报告了在HBV衣壳蛋白（Cp）组装条件下，单链DNA（ssDNA）轮廓长度的变化。结果表明，大约在3分钟内包装了约1000个碱基，表明Cp二聚体在积极进行包装。此外，大多数轨迹显示包装过程通过连续的组装和解体步骤进行，突出了该过程的可逆性。他们从包装轨迹中提取了步长数据，发现了两种步长群体，一种大约为-70个碱基（组装），另一种大约为+64个碱基（解体）（Buzón等人，2021年）。这表明Cp表现出最佳的组装配置或组装足迹，导致约70个核苷酸（nt）的包装。这些实验表明，即使基因组处于张力状态下，Cp也能够浓缩核酸。此外，通过荧光显微镜结果发现，Cp与核酸的相互作用促进了DNA的压缩（Buzón等人，2021年）。这项研究还扩展到了研究各种包膜蛋白的结构组装过程，比较了不同病毒自组装启动所涉及的能量。具体来说，HBV包膜蛋白的富接触五聚体排列被确定为组装途径中的关键中间体。这项工作还阐明了自组装过程所需的能量平衡，提供了对驱动和稳定病毒组装因素的更深入理解。

图11：该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。

全尺寸图像：病毒包装的特性。(a) N蛋白结合和包装vRNA的多步过程模型（Morse等人，2023年）。(b) 由强蛋白质-蛋白质相互作用主导的有序成核-生长途径（Perlmutter等人，2014年）。(c) 由蛋白质-基底相互作用主导的无序集体途径（Perlmutter等人，2014年）。经参考文献（Morse等人，2023年；Perlmutter等人，2014年）许可复制。

蛋白质-基因组相互作用的动力学可以通过OT力谱实验特别好地探测。例如，这种方法已经应用于SV40（Rosmalen等人，2020年）、乙型肝炎病毒（HBV）（Buzón等人，2021年）和人类免疫缺陷病毒-1核衣壳蛋白（HIV-1 NC）（Williams等人，2001年；McCauley等人，2015年；McCauley等人，2020年）。在这样的实验中，DNA分子被多次拉伸和放松。存在几种聚合物行为模型，例如蠕虫状链（WLC）模型（Smith等人，1996年；Bouchiat等人，1999年；Kricheldorft等人，1995年）或可伸展的自由连接链（eFJC）模型（Smith等人，1996年；Bustamante等人，1994年）。通过将聚合物模型拟合到力-延伸曲线中，可以提取几个物理参数。一个重要参数是持久长度，这是聚合物物理学中的一个度量，它决定了聚合物轮廓方向保持相关性的最大长度，即它是聚合物硬度的度量。对于HBV，研究表明持久长度随着Cp浓度的增加而增加，且是饱和的（Buzón等人，2021年）。通过这些依赖浓度的动力学实验，可以通过拟合MGvH模型来表征Cp-DNA相互作用的能量学。将计算出的能量学与高速原子力显微镜（HS-AFM）测量结果结合起来，揭示了二聚体五聚体作为一个重要中间结构，表明每个凝聚步骤的工作量（约100 kBT）与在单链DNA上形成五聚体的自由能变化（ΔG = 90±10 kBT）相符，表明单个Cp二聚体可以促进DNA的压缩，并作为衣壳生长的核心（Buzón等人，2021年）。

一个有趣的例子是HIV-1核衣壳（NC）蛋白在逆转录期间和之后的病毒基因组包装机制，它不直接参与病毒生命周期的初始自组装阶段。HIV-1是一种有包膜的逆转录病毒，其基因组被衣壳蛋白包裹；然而，基因组的压缩是由NC蛋白介导的。在感染过程中，vRNA基因组被逆转录成双链DNA（dsDNA），然后在衣壳解包后整合到宿主基因组中。最近的研究表明，衣壳解包需要全长dsDNA的压力积累，而过早的解包会导致DNA被宿主降解，这表明成功的感染需要在衣壳的微小自由体积内完成逆转录（Burdick等人，2024年）。在逆转录过程中，NC被认为作为一种核酸伴侣，有助于破坏二级RNA结构，这也已经通过光学镊子进行了研究（Williams等人，2001年；McCauley等人，2015年；McCauley等人，2020年；Post等人，2016年）。除了作为逆转录的伴侣外，还发现NC在压缩新合成的DNA中起重要作用（Gien等人，2022年；Gien等人，2024年）。值得注意的是，NC被认为在调节衣壳解包以响应逆转录中起关键作用（Gien等人，2022年；Gien等人，2024年；Müller等人，2022年），通过压缩新合成的dsDNA，在逆转录完成之前保持衣壳的完整性。NC在压缩DNA和保护病毒基因组方面的作用突显了其在基因组包装领域的重要性，因为它有效地组织了核酸，类似于自组装。使用荧光光学镊子和原子力显微镜研究了dsDNA的压缩（Gien等人，2022年；Gien等人，2024年），研究表明NC单独就能将延长的dsDNA分子完全压缩成球形颗粒。与AFM测量结果一致，观察到在未拉伸的dsDNA分子上形成了荧光标记的NC颗粒，当张力增加时，其强度减小。在力-延伸测量中（Gien等人，2022年），DNA-NC相互作用分为两个步骤；首先用高达20 pN的力拉伸无蛋白DNA，其行为类似于理想的聚合物（根据蠕虫状链模型）。NC通过简单的双分子结合与延长的DNA结合，略微缩短了聚合物，然后NC-DNA复合物由于蛋白质结合而放松，形成了具有修改后的持久长度的理想化聚合物。在一定的拉力以下，NC立即压缩DNA，随着伸长的减少保持张力。包装速率取决于光学陷阱的放松速率，并不限于1000 nm/s（Gien等人，2022年）。在不同的实验中，研究表明，一旦形成了NC-DNA凝聚体，它就能抵抗远高于此力平台的力。

尽管NC对DNA的压缩在质量上类似于其他多价阳离子，但发现NC与DNA的结合强度比典型的DNA压缩阳离子钴六胺（CoHex3+）和精胺（Spe3+）高约4个数量级，这可能是由于芳香族堆叠的作用。在后续的类似实验中，发现NC上有一些特定的阳离子残基对DNA的结合和压缩很重要（Gien等人，2024年）。估计含有NC分子的dsDNA的体积与未压缩的、水合的dsDNA相似（Burdick等人，2024年）。因此，在DNA-NC凝聚体中，衣壳内的NC分子体积不会增加压力积累，这被认为导致衣壳内的压力相对较低，从而防止了过早的解包（Gien等人，2022年；Gien等人，2024年）。

光学镊子也被用来研究SARS-CoV-2的基因组包装过程（Morse等人，2023年）。SARS-CoV-2是一种有包膜的病毒，其内部的基因组由核衣壳（N）蛋白压缩（Eltayeb等人，2024年；Cubuk等人，2021年；Laughlin等人，2024年）。N蛋白由两个重要域组成，通过一个连接器连接，即N末端域（NTD），仅参与RNA结合，以及C末端域（CTD），后者还促进寡聚化以形成核衣壳（Morse等人，2023年；Laughlin等人，2024年）。通过使用光学镊子，作者实时直接测量了SARS-CoV-2核衣壳蛋白在单分子水平上的结合和基因组压缩能力（图11a）（Morse等人，2023年）。在这项研究中，ssDNA被固定在两个珠子之间，施加了小的张力（约10 pN）以防止完全塌陷。使用全长N（NFL）蛋白时，观察到两个不同的核酸压缩步骤，并且中间有一个暂停。当仅用NTD孵育时，发现NTD-DNA结合是非协同的双分子结合，DNA的压缩与NFL蛋白观察到的第一个压缩步骤相似。另一方面，观察到CTD能够完全压缩ssDNA，尽管速度比NFL慢。基于这些发现提出的模型表明，它遵循一个多步过程。N蛋白在溶液中主要以二聚体的形式存在，由于病毒基因表达，其局部浓度很高。与ssRNA的结合主要通过NTD发生，随后通过CTD介导的寡聚化来封装基因组。由于本研究使用的是单链DNA（ssDNA）作为底物，而SARS-CoV-2是一种单链RNA（ssRNA）病毒，因此在野生型（WT）病毒颗粒中观察到的某些结构可能需要特定的相互作用，但这些相互作用在当前研究中并未被观察到，这可能是由于病毒RNA（vRNA）与N蛋白之间的序列依赖性相互作用所致。上述研究表明，在病毒包装过程中负责压缩核酸的蛋白质-基因组相互作用可能受到共同的物理化学力的调控。带负电荷的基因组与带正电荷的衣壳蛋白之间的静电相互作用是驱动组装过程的主要力量（Buzón等人，2020年）。这些相互作用通常是非特异性的，许多能够在不同非天然聚合物上形成病毒样颗粒（VLPs）的系统都证明了这一点。例如，SV40衣壳蛋白能够与多种RNA以及合成聚苯乙烯磺酸盐（PSS）形成VLPs（Li等人，2017年），尽管其本质上是DNA病毒。植物RNA病毒——豇豆褪绿斑驳病毒（CCMV）也被观察到更倾向于使用PSS进行包装，可能是因为PSS具有疏水性骨架（Tresset等人，2014年）。已有研究表明模板聚合物会影响组装结果（Li等人，2017年），但在具体机制方面仍知之甚少。病毒包装过程中的这种非特异性现象引发了关于体内组装过程的许多疑问。宿主细胞环境的拥挤特性要求高度的特异性。除了病毒基因组外，细胞质中还存在许多其他核酸分子（如mRNA）。病毒基因组必须通过衣壳蛋白被识别，以确保只有该基因组被包装进病毒颗粒中。尽管观察到了驱动自我组装的非特异性相互作用，但病毒仍表现出高度的基因组特异性，仅将其自身基因组包装成具有感染性的病毒颗粒（Buzón等人，2020年；Bruijn等人，2022年）。这种特异性的本质仍存在争议且部分不清楚。对于某些病毒而言，研究表明它们通过所谓的包装信号实现特异性，即衣壳蛋白能够识别基因组上的短序列，这些序列通常会形成对衣壳蛋白具有高亲和力的二级结构（Bruinsma等人，2021年；Buzón等人，2020年；Bruijn等人，2022年；Calcines-Cruz等人，2021年）。尽管普遍认为包装信号会影响组装过程，但它们对组装动力学的影响尚不明确。一项研究使用基于CRISPR-Cas蛋白的人工包装信号与合成多肽结合，在人工系统中模拟了包装过程（Marchetti等人，2019年；Calcines-Cruz等人，2021年）。基于本研究的观察结果，研究人员开发了一个包含人工包装信号的基因组包装动力学模型（Bruijn等人，2022年）。研究发现Cas蛋白可以作为有效的成核点，显著提高包装速率。模板聚合物的影响，包括包装信号的作用，尚未通过光学镊子技术进行详细研究。将光学镊子实验与高分辨率荧光技术（甚至超分辨率显微镜）结合使用，可能会揭示衣壳蛋白在底物上优先定位的有趣细节。然而，使用光学镊子研究包装信号也存在挑战：例如，包装信号通常位于核酸底物的末端，而底物需要通过生物素-链霉亲和素键固定在微珠上；此外，野生型病毒RNA常常具有复杂的二级结构，这给实验带来了不便，因为光学镊子实验通常需要较长的连接臂。解决这一问题的方法是使用DNA接头，将RNA分子与固定在微珠上的DNA分子共价连接起来，从而在双光学陷阱中稳定地固定RNA结构。这种方法也被用于研究HIV-1的TAR-RNA发夹结构（McCauley等人，2015年；Post等人，2016年）和SARS-CoV-2的SL4发夹结构（Sundar Rajan等人，2024年）。人工系统为包装信号的研究提供了良好的起点（Calcines-Cruz等人，2021年），因为类似的系统已经通过光学镊子进行了研究（Marchetti等人，2019年），并且该系统也适用于线性双链DNA底物。

**结论**
与传统的大规模方法不同，光学镊子是一种基于激光的工具，能够以皮牛顿（pN）级别的力捕获和操控单个颗粒，代表了病毒学领域的一种相对较新的方法。光学镊子在病毒学中的应用正在不断扩展。光学镊子可以测量力-伸长或扭矩-旋转等相关参数随时间的变化，提供动态信息，从而验证和完善先前的机制模型。这项技术为理解病毒机制提供了无与伦比的见解。光学镊子是一种强大的单颗粒技术，可用于实时研究病毒动态。它具有高空间分辨率、时间分辨率和力分辨率，能够探测生物分子过程在其相关范围内。光学镊子在实验操作上非常灵活，可以执行多种类型的实验。此外，光学镊子实验还可以与荧光显微镜结合，将视觉信息与定量力数据结合起来。光学镊子在单颗粒病毒学中的价值体现在它们对噬菌体DNA包装和病毒样颗粒在核酸基底上的自我组装的研究中。随着可重复性和分辨率的提高，以及先进可视化技术的发展，光学镊子的潜力将进一步增强。通过与其他技术的结合，光学镊子的影响还可以进一步放大。例如，光学镊子实验可以与荧光显微镜、电子显微镜或（高速）原子力显微镜（AFM）等可视化技术结合使用。同时进行光学镊子实验和荧光显微镜成像可以实时观察过程并测量单个分子复合体上的力。将光学镊子实验与电子显微镜或AFM结合在同一实验中进行则更具挑战性，这些实验通常分别在不同的样本上进行，之后再合并数据以获得完整的观察结果。例如，Buzón等人（2021年）展示了如何通过这种组合获得关于病毒组装的更深入的见解。另一个例子是将高分辨率冷冻电镜（cryo-EM）数据与光学镊子获得的机制信息结合起来，形成了一个强大的系统，用于揭示各种产力酶的分子机制（Tong和Bustamante，2021年）。光学镊子的信息还可以与传统的生化测量和分子动力学模拟相结合，将残基级别的化学信息与机械化学输出联系起来（Ortiz等人，2019年）。研究其他病毒（非双链DNA噬菌体）的包装过程时，也可以采用类似的可视化与动态技术组合。此外，通过不对称重建技术，可以更精确地解析病毒颗粒内部核酸的构象（Beren等人，2020年）。将这些结构与光学镊子实验结合起来，探究DNA在衣壳内的运动情况，并将结果与现有的软物质系统理论进行比较，将有助于我们更好地理解紧密DNA限制下的物理现象（Fizari等人，2023年）。研究模板聚合物和包装信号对病毒颗粒组装机制的影响，有助于开发具有生物学意义的病毒组装动力学模型。此外，在合成聚阴离子（如PSS）上研究病毒样颗粒，为开发受病毒启发的纳米容器和携带聚合物货物的递送系统提供了有趣的方向。目前，人们对病毒机械化学功能的实时表征以及将这些知识应用于纳米技术方面越来越感兴趣。在这篇综述中，我们强调了光学镊子在病毒学领域的一些关键贡献，并全面总结了关于病毒分子动力学的研究。通过将这些动态信息与结构和生化分析相结合，我们可以提供严谨的方法来建模病毒功能和稳定性，从而实现病毒机制的精确热力学表征。这些模型为纳米技术应用的进步奠定了基础。