在沙漏形截面的圆形PDMS流体通道中独立并行生产可调谐血液凝块类似物

《Lab on a Chip》：Independent parallel production of tunable blood clot analogues in hourglass-profiled circular PDMS fluidic channels

　　

： 快速清除闭塞性血栓，无论是通过静脉溶栓还是血管内血栓切除术，均能挽救生命。然而，再通（recanalization）并非总能成功，其决定因素尚未被完全阐明。血栓呈现异质性组成，而临床样本和动物模型成本高、变异性大，且通常难以复现。为应对这些挑战，研究人员（研究人员）提出了一种血液凝块类似物（blood clot analogue）生产系统，可在精准调控的流动和钙离子条件下并行生成可调谐的凝块类似物。该平台整合了一个或多个压力控制的流体回路，它们可独立运行，并共用一个泵和多套由聚二甲基硅氧烷（poly(dimethylsiloxane), PDMS）制成的沙漏形截面圆形装置；PDMS是一种可透气的材料，可复制血管闭塞的血流动力学。利用此系统，研究人员生成了长度约0.8厘米至超过2.5厘米的凝块类似物，其展现出异质性的上游-狭窄-下游结构，其中红细胞（red blood cell, RBC）-纤维蛋白（fibrin）比例可在23%至76%之间调谐，紧密反映了临床血栓的组成。该组成是通过在不同CaCl2浓度（1.8–16.5 mM）和剪切速率（104–106s?1）下进行再钙化（recalcification）来调控的。在较高Ca2+水平（≥6.6 mM）下，致密的RBC-纤维蛋白主导的凝块迅速形成（<10分钟），呈现出层状的“Zahn线”结构。相反，较低的Ca2+条件（1.8–2.3 mM）延迟了闭塞（>40分钟），并产生弥散的中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular trap, NET）-血小板网络。该系统在血液再循环条件下可稳定运行超过1000分钟，确保了可重复性和成本效益，同时依据3R（替代、减少、优化）原则减少了对动物血栓模型的依赖。总而言之，该平台为血栓形成和血栓切除术研究提供了一个可控、符合伦理且具有生理相关性的模型。

论文解读：

研究背景与问题

缺血性心脏病自1990年以来一直是全球主要的死亡原因，其核心病理过程涉及血栓形成和后续的栓塞。血管内血栓切除术已成为治疗大血管闭塞性卒中的高效方法，但其疗效存在差异，研究表明血栓组成是决定手术效果的关键因素。红细胞（RBC）丰富的血栓通常与较高的再通成功率和较短的手术时间相关，而血小板丰富的血栓，其以密集的纤维蛋白网络、白细胞和胞外DNA为特征，可能导致治疗抵抗。然而，临床血栓样本存在异质性、成本高且难以获取，而现有的体外模型（如静态混合或旋转法）在结构和组成上常与真实血栓存在偏差，或受限于材料（如玻璃）的固有促凝性，难以分离剪切力与基底材料的影响。因此，开发一种能在生理相关血流动力学条件下，稳定、可重复生成可控血栓类似物的平台，对于标准化血栓切除装置评估、优化治疗策略至关重要。

研究概述与意义

本研究在《Lab on a Chip》期刊上发表，旨在解决上述问题。研究人员开发了一种集成化的血液凝块类似物生产系统。该系统采用沙漏形截面的圆形PDMS（聚二甲基硅氧烷）流体通道，可在一个泵的驱动下实现多个通道的独立并行操作，从而在精确控制的流动和钙离子（Ca²⁺）浓度条件下，生成组成可调谐的血栓类似物。该研究的主要结论是：钙离子浓度和局部血流剪切力是决定凝块类似物表型的关键调节因素。通过调节这两个参数，平台能够复现临床观察到的从致密RBC-纤维蛋白核心到松散NET-血小板网络的多种血栓结构。这为研究血栓成熟、溶栓抵抗以及血栓切除装置性能提供了一个生理相关、可重复且符合伦理的体外模型，支持了下一代溶栓和介入策略的理性设计。

关键技术方法概述

研究人员采用了几项关键技术：1. 系统构建：开发了压力控制的流体回路系统，包含可调高度储液器、滚子泵、流量传感器和数字显微镜成像模块，可实现长期稳定运行和实时监测。2. 器件设计与仿真：设计了沙漏形截面的圆形PDMS流体通道，其狭窄处直径（0.6 mm）为入口（3.0 mm）的20%，以模拟严重动脉狭窄。通过计算流体力学（CFD）仿真（采用k–ω湍流模型）证实，该设计可在狭窄处产生超过10⁶s^?1的高剪切速率。3. 样品制备与参数调控：使用新鲜猪全血（来源于台湾农业技术研究院）作为血液样本。通过在上游储液器注入端口添加不同浓度（1.8–16.5 mM）的CaCl₂溶液来启动凝血并调控钙离子环境。4. 双回路并行实验：系统可配置为双回路再循环网络，允许来自同一血源的血浆在两个独立回路中，在不同的流动或离子条件下并行生成凝块类似物，以减少生物差异带来的变异。5. 组织学分析与量化：形成的凝块类似物被取出，经石蜡包埋切片后，进行H&E（苏木精-伊红）和MSB（马休斯猩红蓝）染色，以区分不同组分。利用ImageJ/Fiji软件对MSB染色切片进行颜色分离和定量图像分析，比较主要凝块成分的相对比例。

研究结果

3.1 受控流动下的凝块类似物形成

通过实时流量监测发现，凝块形成通常起始于剪切力最高的狭窄区域。闭塞时间随着CaCl₂浓度的升高（1.8–16.5 mM）而缩短。在较低浓度（1.8和2.3 mM）下，仅约一半的装置在超过300分钟的灌注期内发生闭塞。与内径3.0 mm的直管相比，在高CaCl₂浓度（6.6–16.5 mM）下，直管组闭塞更快，表明沙漏通道的高剪切（>10⁶s^?1）对初始聚集物有冲刷作用。在2.3 mM时，沙漏通道中可观察到小而可移动的聚集物间歇性地卡在狭窄处，形成短暂的血栓样片段而非稳定闭塞。

3.2 CaCl₂浓度对凝块类似物形成和组成的影响

组织学分析显示，高CaCl₂浓度（6.6–16.5 mM）下，凝块类似物迅速形成（<10分钟），呈现出由致密RBC-纤维蛋白核心和薄层血小板外壳组成的紧凑结构，形态上类似于动脉型血栓的层状“Zahn线”结构。而在低CaCl₂浓度（1.8和2.3 mM）下，形成的凝块结构松散，机械稳定性差，MSB染色显示其为血小板-纤维蛋白丰富区域，伴有稀疏的红细胞和偶见的外周白细胞/NET阳性区，表明其向NET-血小板-纤维蛋白组成转变。

3.3 剪切速率对凝块类似物形成和组成的影响

在沙漏通道内，沿上游、狭窄和下游区域，纤维蛋白的堆积密度存在差异。狭窄区域的纤维蛋白纤维显得更紧密、排列更整齐，这与较高的局部剪切速率促进纤维蛋白延伸和压实有关。在6.6 mM CaCl₂条件下，与直管内形成的松散纤维蛋白网络相比，沙漏通道内形成的凝块类似物具有更致密的纤维蛋白网络和紧密堆积的红细胞，外围有薄的血小板层。值得注意的是，沙漏通道组中观察到的外周NET-rich层在直管样本中不明显，表明狭窄几何形状内的高剪切和局部流动再循环在促进中性粒细胞活化和NET释放中起关键作用。在1.8 mM CaCl₂的低钙条件下，凝块类似物呈现出更弥散的NET-血小板-纤维蛋白结构。油红O（Oil Red O）染色在2.3 mM组的NET-rich区域外围发现了脂质积累。图像定量分析表明，RBC的比例随CaCl₂浓度升高而增加，而细胞核/NET的比例则下降。

3.4 凝块类似物的可取出性及PDMS流体通道的转化相关性

PDMS流体通道允许在连续流动下形成沿狭窄区域延伸的凝块类似物，并可轻松用细镊子取出，结构保持完整。这为后续的机械血栓切除术（如抽吸和支架取栓）测试提供了直接可用的样本。该平台遵循3R伦理原则，用完全体外系统替代了基于动物的血栓模型。

3.5 临床相关性与组成异质性

该平台通过同时控制钙离子浓度和流动剪切条件，能够精确、可重复地调控凝块类似物组成，生成从RBC-纤维蛋白主导到血小板-NET-纤维蛋白富集的不同表型，从而复现了患者来源血栓中观察到的组成异质性。临床研究已证实缺血性卒中血栓在组成和结构上具有高度异质性，血小板丰富区域和RBC丰富区域相互交织，NETs主要位于这些区域的界面，形成DNA-血小板-纤维蛋白杂交层，赋予其对抗溶栓和机械取栓的抵抗力。

3.6 剪切梯度作为血栓分层的机制驱动因素

剪切力是血栓结构的关键决定因素。生理性动脉高剪切促进血小板粘附和纤维蛋白压实，形成机械强度高的RBC-纤维蛋白核心。而局部剪切梯度和再循环区会刺激血小板-中性粒细胞相互作用和NET形成，特别是在凝血被部分抑制时。沙漏形圆形流体通道中的狭窄区域再现了高剪切加速，下游扩张产生了局部再循环，这些动力学共同促进了在不同钙浓度和剪切状态下形成不同的凝块结构。

3.7 意义与未来应用

通过整合化学和血流动力学控制，该凝块类似物生产系统架起了临床病理学与机制实验之间的桥梁。其双回路配置允许使用同一批次血液，在不同的血流动力学和生化条件下同时运行多个通道，消除了供体变异性，并可直接并排比较凝块表型。未来可探索表面修饰、组织培养整合以及不同的通道狭窄轮廓，以建立更特异、更仿生的环境，推进对血栓形成过程的理解。

总结与结论

本研究结论部分翻译如下：本研究表明，钙离子浓度和局部血流动力学剪切是决定凝块类似物表型的关键调节因素。利用沙漏形截面的圆形PDMS流体通道，研究人员在可控的体外环境中复现了临床观察到的凝块形态全谱——从致密的、RBC-纤维蛋白主导的核心到松散结构的、NET富集的网络。双回路配置进一步使得来自同一血源的血浆能在不同条件下并行形成凝块，从而最大限度地减少了变异性，并允许直接比较表型。总体而言，该平台为研究凝块成熟、纤溶抵抗和血栓切除装置性能提供了一个生理相关且可重复的框架，从而支持下一代溶栓和介入策略的理性设计。