《Journal of Biological Chemistry》：Longitudinal analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and Mucin-2-glycans in infants reveals enrichment of sulfated and glucuronic acid-bearing HMOs
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在婴儿期，成人样胃肠道（GI）微生物组的获得始于出生，并在幼儿期完全发育。这种定殖受饮食影响，在母乳喂养的婴儿中，饮食含有高浓度的可溶性人乳寡糖（HMOs），这是一种与装饰黏蛋白-2（MUC2）的聚糖结构相似的前生物。MUC2是微生物群与下方黏膜组织之间的第一
在婴儿期，成人样胃肠道（GI）微生物组的获得始于出生，并在幼儿期完全发育。这种定殖受饮食影响，在母乳喂养的婴儿中，饮食含有高浓度的可溶性人乳寡糖（HMOs），这是一种与装饰黏蛋白-2（MUC2）的聚糖结构相似的前生物。MUC2是微生物群与下方黏膜组织之间的第一道防线；它也为胃肠道共生微生物提供了营养丰富的栖息地。本文描述的研究建立在两个早期发现的基础上：从粪便样本表面采样粘附的MUC2的能力，以及在人乳中发现的硫酸化HMOs类别。研究表明，MUC2携带聚糖的去硫酸化是其被胃肠道微生物体外代谢的关键，如果硫酸化聚糖在代谢上具有抗性，则随之产生两个假设。首先，与主要的前生物HMOs相比，硫酸化HMOs将在婴儿胃肠道中富集；其次，HMOs中高丰度的糖表位（如硫酸化）将使微生物组代谢活性偏离MUC2，导致宿主糖组发生可检测的变化。研究人员表明，可以从同一份婴儿粪便样本中非侵入性地同时采样HMOs和MUC2。配对乳汁/粪便样本的毛细管电泳分析表明，粪便中硫酸盐含量高的HMOs显著富集。高分辨质谱（HRMS）被用于检测大量硫酸化HMOs，包括一类同时含有葡萄糖醛酸（GlcA）残基的新型HMOs。婴儿来源的MUC2衍生聚糖也通过HRMS进行了分析；这是首次报道的半定量纵向研究，为未来的研究提供了基准。
本研究由Nitin Nitin、Parandis Daneshgar、Darrek Kniffen等学者合作完成，发表于《Journal of Biological Chemistry》。论文聚焦于婴儿胃肠道（GI）微生物组早期定殖过程中，人乳寡糖（HMOs）与宿主黏液层关键成分黏蛋白-2（MUC2）之间的相互作用及代谢命运。
研究背景源于婴儿出生后胃肠道微生物组逐步建立，其过程深受母乳喂养中高浓度的HMOs影响。HMOs不仅在结构上模拟了MUC2上的聚糖，为肠道共生菌提供营养，还参与调节宿主免疫反应。既往研究已证实，MUC2上的硫酸化聚糖因其代谢抗性而在肠道中富集，这引出了两个核心假设：一是硫酸化HMOs同样会在婴儿胃肠道中抵抗代谢而富集；二是高丰度的HMOs会竞争性地将微生物的代谢活动从MUC2上“引开”，从而导致宿主糖组发生改变。然而，此前缺乏直接从婴儿粪便中同步、非侵入性获取HMOs和MUC2并进行纵向比较的研究。为此，本研究旨在通过对母婴配对样本的长期追踪，验证上述假设并解析新生儿MUC2糖组的动态特征。
为实现研究目标，研究人员采用了几项关键技术方法。首先是样本采集，研究纳入了四对母婴组合，收集了产后2至5个月的配对乳汁与粪便样本。其次是分离技术，研究人员优化了从粪便样品中分离纯化MUC2的方法，并利用还原β-消除（reductive β-elimination）技术释放O-聚糖。在分析手段上，结合了毛细管电泳激光诱导荧光检测（CE-LIF）用于快速分析带电荷聚糖的迁移率，以及高效液相色谱与高分辨质谱联用（HPLC-HRMS）用于精确测定聚糖的单糖组成和结构注释。此外，还运用了偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和Spearman相关性分析等统计学方法处理复杂的糖组学数据。
研究结果部分通过多个维度的实验得出了以下结论：
关于“硫酸盐和/或GlcA-containing HMOs的证据：哺乳期稳定性与在新生儿胃肠道中的富集”，研究人员通过CE-LIF和HPLC-MS分析发现，成熟人乳中存在大量迁移率超过已知唾液酸化HMOs的新型酸性HMOs。质谱数据显示，这些HMOs中含有硫酸根、葡萄糖醛酸（GlcA）甚至两者兼具的结构，其中一部分还含有Neu5Ac，形成了罕见的三阴离子糖表位。纵向分析显示，尽管部分HMOs（如LNT、2’FL）作为前生物被微生物消耗，但硫酸化HMOs（如3’SO3L）在粪便中的相对丰度显著高于乳汁，证实了硫酸化修饰赋予了HMOs在婴儿胃肠道内的代谢抗性。
在“通过HPLC-MS在乳汁和粪便中检测到新型含GlcA的HMOs”方面，研究进一步鉴定了40种推定的HMOs，其中15种同时含有GlcA和硫酸根基团。串联质谱（MS/MS）分析证实了这些新型结构中单糖的连接方式和分支情况，例如确定了某些HMOs是基于3FL或2’FL核心延伸而来。这些数据支持了此类复杂修饰的HMOs确实存在于母乳中，并能完整通过消化道被回收。
针对“新生儿胃肠道MUC2的糖组学分析”，研究人员首次成功地从少量冻干粪便中分离出高质量的MUC2，并鉴定出160种独特的O-聚糖。分析显示，新生儿MUC2糖组主要由唾液酸化聚糖主导（平均约53%），其次是中性、岩藻糖基化和硫酸化聚糖。尽管在四个月的时间内未观察到明显的随时间变化趋势，但不同个体间的糖组构成存在显著差异。相关性分析揭示了特定的聚糖簇，例如一组富含岩藻糖/中性聚糖的簇（如22010_1、22110_1）与另一组富含唾液酸化聚糖的簇之间存在显著的负相关关系，这反映了O-聚糖生物合成过程中的竞争性机制。
在“母乳喂养婴儿摄入的HMOs与MUC2糖基化之间的关联”研究中，研究人员探讨了乳汁HMOs谱与粪便MUC2糖组之间的相关性。结果显示，虽然整体上硫酸化HMOs与MUC2硫酸化聚糖之间未表现出正相关，但特定的HMOs（如LNFP1与LNFP3）与MUC2的特定糖基化类型呈现出截然相反的关联模式。例如，LNFP3与MUC2的唾液酸化呈负相关，而与岩藻糖基化呈正相关，这为“HMOs竞争性调节微生物对MUC2的代谢”这一假设提供了直接证据。
讨论部分总结指出，本研究极大地扩展了已知HMOs的结构多样性，新增了24种含硫酸盐和GlcA的HMOs结构，并将此类修饰的存在范围推广到多种哺乳动物。研究证实，硫酸化HMOs由于难以被微生物代谢而在婴儿肠道内显著富集，这与它们在MUC2聚糖上的行为一致。此外，研究建立的从微量粪便中分析MUC2糖组的方法，为今后非侵入性研究婴儿肠道黏液屏障功能提供了强有力的工具。重要的是，研究揭示了HMOs摄入与宿主黏液糖组动态之间的潜在联系，表明饮食中的复杂聚糖可能通过调节微生物活性间接塑造宿主的黏膜免疫环境。这些发现不仅深化了对HMOs生理功能的认识，也为理解婴儿肠道微生物组与宿主互作的早期机制提供了新的视角。
