Insights into the Role of Internal Catalysts in Asparagine-to-Succinimide Conversion in a Hyperthermophilic Glutamine Amidotransferase

《Journal of Biological Chemistry》：Insights into the Role of Internal Catalysts in Asparagine‐to‐Succinimide Conversion in a Hyperthermophilic Glutamine Amidotransferase

　　

本研究探讨了超嗜热古菌Methanocaldococcus jannaschii来源的谷氨酰胺氨基转移酶（Glutamine Amidotransferase, GATase）中，Asn109残基自发且完全转化为稳定的琥珀酰亚胺（Succinimide, SNN）的分子机制。尽管已知SNN修饰能显著增强该蛋白的热稳定性，但催化这一转化的内部残基尚不明确。研究人员通过对MjGATase及其突变体的质谱（Mass Spectrometry, MS）和晶体结构分析，结合量子力学/分子力学（Quantum Mechanics/Molecular Mechanics, QM/MM）分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟，鉴定了参与催化的关键残基。结果表明，Asp110、Tyr158和Lys151通过协同作用充当内部催化剂，促进主链酰胺质子的去质子化，从而加速SNN的形成。该研究不仅揭示了蛋白质三维结构如何调控翻译后修饰（Post-Translational Modification, PTM）的速率，还阐明了SNN介导的蛋白质热稳定性维持机制，为理解极端环境下蛋白质的稳定性提供了新的视角。

研究人员利用源自Methanocaldococcus jannaschii的谷氨酰胺氨基转移酶（MjGATase）作为模型系统，探究了Asn109向琥珀酰亚胺（SNN）转化的分子机制。尽管先前研究已证实SNN修饰能显著增强MjGATase的热稳定性，但催化该转化发生的内部残基及其具体机制仍属未知。为此，研究人员结合多种先进技术开展了系统性研究。首先，基于野生型MjGATase的晶体结构，识别了与SNN原子在4 ?距离内的潜在催化残基。随后，构建了10种单氨基酸突变体及随后的双突变体（D110V_K151L和K151L_Y158F），并利用电喷雾电离质谱（Electrospray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS）和串联质谱（MS/MS）分析了这些突变体中Asn109侧链的保留情况。为了从原子水平验证结构变化，研究人员测定了关键突变体（D110P、D110V_K151L、K151L_Y158F）的晶体结构。此外，研究采用了QM/MM MD元动力学（Metadynamics）模拟，计算了去质子化步骤的自由能垒，从而深入解析了催化机理。最后，通过圆二色光谱（Circular Dichroism, CD）和紫外吸收热变性实验评估了突变体的热稳定性，并通过酶活性测定验证了SNN修饰的功能特异性。

研究结果如下：

结构分析提示可能参与SNN形成催化的残基

研究人员通过分析MjGATase_SNN₁₀₉的晶体结构，识别出SNN原子在4 ?距离内的接触残基，包括Asp110、Tyr158、Lys151、Glu137、Lys107、Glu108和Lys113。其中，Asp110的侧链羧酸根与主链酰胺氮（N2）的距离表明其可能作为质子受体。Tyr158的羟基与Asp110的羧酸根存在氢键相互作用，暗示其可能参与质子传递。基于这些结构观察，研究人员设计了针对这些残基的单点及双点突变。

单突变体的质谱分析表明Asp110、Tyr158、Lys151、Lys113和Glu108在SNN形成中的作用

对10种单突变体的完整蛋白质谱分析显示，不同突变体保留了不同比例的完整Asn109。其中，D110V突变体中Asn109与SNN的比例接近1:1，而Y158F突变体中完整Asn109的比例显著增加。相比之下，K151L和K113A仅表现出少量的Asn109保留。这些数据初步表明，Asp110、Tyr158、Lys151等残基在促进SNN形成中扮演了关键角色。

双突变体MjGATase的MS和MS/MS分析显示高水平的完整Asn109

基于单突变体的结果，研究人员构建了D110V_K151L和K151L_Y158F双突变体。完整蛋白质谱及肽段水平的MS/MS分析证实，这两个双突变体极大地抑制了SNN的形成，保留了超过80%的完整Asn109群体，确立了这些残基在催化环化反应中的协同重要性。

D110P、D110V_K151L和K151L_Y158F突变体的晶体结构证实完整Asn109的存在

晶体结构解析（分辨率分别为2.4 ?、2.5 ?和2.4 ?）清晰地显示了Asn109侧链的电子密度，证实了质谱的结果。结构叠加分析显示，尽管整体折叠与野生型相似，但双突变体在108-111位残基的主链构象发生了显著偏移，导致Asn109的二面角（φ, ψ）落入拉氏图的左上象限，远离了利于SNN形成的“近攻击”构象。

保留完整Asn109的突变体表现出热稳定性降低但活性不变

热稳定性测定表明，含有完整Asn109的突变体（如D110P和双突变体）的熔解温度（T_m）显著降低至82-84 °C，而野生型蛋白在100 °C仍保持稳定。相反，这些突变体的酶活性与野生型相比没有显著差异。这证明SNN修饰是维持MjGATase超嗜热稳定性的关键因素，但并不参与催化活性中心的化学反应。

低pH下MjGATase_D110V_K151L中SNN的形成

将D110V_K151L突变体在pH 3.0、60 °C条件下孵育后，质谱检测到SNN109比例从17%上升至34%，表明即使在缺乏推定催化碱基（Asp110）的情况下，特定的局部微环境仍能驱动缓慢的环化反应。

QM/MM元动力学模拟

QM/MM MD元动力学模拟揭示了反应的自由能面。模拟结果显示，Asp110的侧链羧酸根能够高效地从其自身的主链酰胺NH基团中夺取质子，概率高达0.64（距离<2 ?）。模拟轨迹捕捉到了从反应物到产物盆地的一次转变，估算出去质子化步骤的活化能垒约为3.4 kcal/mol。结构分析表明，在反应路径的特定节点，Asn109的侧链会采取特定的取向以完成质子转移。

集体变量空间中的状态及其结构

通过分析集体变量（Collective Variables, CVs）的时间演化，研究人员定义了反应路径上的四个状态点。结构快照显示，从状态1到状态4，系统经历了质子从Asp110主链转移到Asn109侧链，再到部分环化和脱氨的过程，最终形成SNN产物。

综上所述，讨论部分指出，与肽段中Asn脱酰胺主要受后继残基影响不同，蛋白质中的脱酰胺速率主要由三维结构决定。本研究通过结合突变分析、高分辨率晶体学和QM/MM计算，明确了MjGATase中Asp110、Tyr158和Lys151作为内部催化剂的作用机制。Asp110通过其侧链羧基直接催化主链NH的去质子化，而Tyr158和Lys151可能通过调节局部静电环境或参与质子中继网络来辅助这一过程。研究证实，这种独特的内部催化机制使得Asn109能够快速且完全地转化为稳定的SNN，进而通过限制主链ψ二面角产生构象锁定，赋予蛋白质极高的热稳定性。这项工作不仅解释了MjGATase在极端环境下的生存策略，也为设计具有特定稳定性的工程蛋白提供了理论依据。该研究成果发表于《Journal of Biological Chemistry》。