磷脂酰肌醇甘露糖苷、脂甘露聚糖及脂阿拉伯甘露聚糖生物合成中MptB的关键作用

《Journal of Biological Chemistry》：Essential role of MptB in the biosynthesis of phosphatidylinositol mannosides, lipomannan and lipoarabinomannan in mycobacteria

　　

脂甘露聚糖（LM）和脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）是所有分枝杆菌细胞壁的重要组分，因其在分枝杆菌生理学和宿主-病原体相互作用中的作用而被广泛研究。尽管过去几十年在解析这些脂聚糖的结构和生物合成方面取得了显著进展，但其组装和转运至细胞表面的某些关键步骤仍不明确。本研究报道了对一种保守且必需的聚戊烯基磷酸甘露糖（PPM）依赖性甘露糖基转移酶MptB的表征，该酶参与从磷脂酰肌醇甘露糖苷（PIM）锚点开始延伸LM和LAM的甘露聚糖结构域的初始步骤。在耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）中遗传沉默mptB基因导致LM、LAM和PIM的合成停滞在这些糖脂的二甘露糖基化形式之后。在无细胞试验中，过表达mptB导致耻垢分枝杆菌膜中四甘露糖基化形式的PIM产量增加，而降低mptB表达则导致磷脂酰肌醇三甘露糖苷、四甘露糖苷和六甘露糖苷的合成显著减少。结合结构建模预测，这些试验的结果支持MptB作为一种α-(1,6)-甘露糖基转移酶，能够从二甘露糖基化和/或三甘露糖基化的PIM引物延伸LM的甘露聚糖主链。

论文解读：MptB在分枝杆菌脂聚糖生物合成中的关键作用

研究背景与立题依据

磷脂酰肌醇甘露糖苷（PIM）、脂甘露聚糖（LM）和脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）是分枝杆菌细胞壁的关键成分，在维持细胞膜通透性、内膜完整性以及宿主-病原体相互作用中扮演着重要角色。尽管学界已鉴定出参与其生物合成的大部分酶，但在LM和LAM线性甘露聚糖主链的延伸机制上仍存在知识空白。特别是，负责将初始的二甘露糖基化PIM（PIM₂）进一步延伸的α-(1,6)-甘露糖基转移酶的具体身份尚不明确。虽然已知MptA参与此过程，但遗传学证据表明还存在其他酶参与。此前关于MptB（Rv1459c/MSMEG_3120）的研究存在争议，有报道称其在耻垢分枝杆菌（M. smegmatis, Msmg）中并非必需，且对极性PIM和LM的合成影响不大。为了澄清这一矛盾并阐明MptB的确切功能，研究人员开展了此项研究，相关成果发表在《Journal of Biological Chemistry》。

关键技术方法

研究人员采用了条件性基因敲低（cKD）技术，利用温度敏感型质粒和TetR/Pip OFF系统调控mptB的表达，以评估其对细菌生长的影响。通过薄层色谱（TLC）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析总脂质变化。利用无细胞体系（Cell-free assays）结合放射性标记的GDP-[¹⁴C]-Man，测定膜组分中甘露糖基转移酶的活性。此外，还运用了AlphaFold 3进行结构同源建模，分析MptB与底物的结合模式。

研究结果

MptB是耻垢分枝杆菌生长所必需的

研究人员尝试通过两步同源重组灭活Msmg的mptB基因，但未能获得双交换突变株，表明该基因可能具有必需性。随后构建的条件性敲低菌株（cKD-mptBsm和cKD-mptBtb）显示，在抑制mptB表达（如提高温度或添加脱水四环素ATc）后，细菌生长受到显著抑制甚至完全停止。定量逆转录PCR证实基因表达被有效沉默。这一结果表明，mptB在耻垢分枝杆菌中是必需基因，这与之前认为该基因非必需的结论相悖。

mptB沉默对耻垢分枝杆菌脂质和脂聚糖合成的影响

对cKD菌株进行脂质提取分析发现，mptB沉默导致四酰化形式的磷脂酰肌醇二甘露糖苷（Ac₂PIM₂）相对积累，而三酰化和四酰化形式的磷脂酰肌醇六甘露糖苷（Ac₁PIM₆和Ac₂PIM₆）显著减少。SDS-PAGE及银染分析进一步证实，沉默菌株几乎完全或部分丧失了LM和LAM的产生能力。这直接证明了MptB参与了PIM向更高级形式以及LM/LAM的生物合成。

滴定mptB表达水平对体外PIM生物合成的影响

由于无法获得可溶性的纯化MptB蛋白，研究人员利用膜组分进行体外实验。结果显示，过表达mptB的膜组分在体外能显著增加一种迁移率低于PIM₂的甘露糖脂（后证实为Ac₁PIM₄）的生成。相反，来自mptB沉默菌株的细胞膜提取物在体外合成磷脂酰肌醇三甘露糖苷（Ac₁PIM₃）和四甘露糖苷（Ac₁PIM₄）的能力分别降低了80-96%和70-87%。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析最终确证了这些产物分别为Ac₁PIM₃和Ac₁PIM₄，表明MptB催化了向二甘露糖基化和/或三甘露糖基化PIM添加甘露糖残基的反应。

MptB的结构建模

利用AlphaFold 3进行的同源建模显示，MptB属于GT-C_A类糖基转移酶。结构预测表明，聚戊烯基磷酸甘露糖（PPM）供体和Ac₂PIM₃或Ac₁PIM₄受体能够结合在MptB的高度保守的活性位点空腔中，且催化残基D136位于合适的位置以催化α-(1,6)糖苷键的形成。该结构与已知的其它GT-C类糖基转移酶（如PimE和ALG12）具有相似性，进一步支持了MptB作为α-甘露吡喃糖基转移酶的结论。

讨论与结论

本研究解决了关于MptB功能的长期争议。数据明确表明mptB是耻垢分枝杆菌生长所必需的基因，其沉默会导致细胞死亡，这与该基因在结核分枝杆菌（Mtb）中被预测为必需基因的结果一致。研究发现，MptB负责催化PIM₂和/或PIM₃的甘露糖基化，这是合成极性PIM（PIM₆）以及后续LM和LAM的关键分支点。虽然尚不能确定MptB是直接连续添加第三个和第四个甘露糖，还是与另一种未知的α-(1,6)-甘露糖基转移酶协同作用，但本研究确立了MptB在LM甘露聚糖主链延伸中的核心地位。这一发现填补了分枝杆菌脂聚糖生物合成途径中的重要空白，并为针对这一必需酶开发新型抗结核药物提供了理论基础。