在分子印迹聚合物功能化的BiVO4平台上对牛血清白蛋白进行选择性光电化学检测

《Microchemical Journal》：Selective Photoelectrochemical detection of bovine serum albumin on molecularly imprinted polymer-functionalized BiVO4 platform

　　Seok Jin Lim | Jeongyeon Bae | Toshinori Fujie | Jong Pil Park | Jinyoung Park
高分子科学与工程系，庆北国立大学，大邱市 Buk-gu 区 Daehak-ro 80 号，41566，韩国

**摘要**
光电化学（PEC）传感器因其低背景信号和高灵敏度而作为蛋白质检测的分析平台受到了广泛关注。然而，它们的实际性能往往受到半导体光电电极中界面电荷分离效率低下以及复杂生物样本中分子选择性不足的限制。为了解决这些限制，研究人员开发了一种基于合理设计的氧化锡（SnO2）/钒酸铋（BiVO4）异质结光电电极的分子印迹 PEC 传感器，用于选择性检测牛血清白蛋白（BSA）这一模型蛋白。单斜晶系的 BiVO4 被用作光活性半导体，而 SnO2 中间层促进了电子提取并抑制了电荷复合，从而增强了光电流响应。此外，在光电电极表面电聚合了一个 BSA 印迹聚合物层以实现选择性分子识别。通过结合界面电荷工程和蛋白质印迹技术，该平台实现了灵敏度和选择性的提升，代表了基于 BiVO4 的 PEC 蛋白质传感领域中一个未被充分探索的策略。所制备的传感器具有 1–100 pM 的线性检测范围，检测限和定量限分别为 1.95 pM 和 5.136 pM。这些结果表明，该传感平台为高灵敏度和选择性的蛋白质分析提供了一个简单且低成本的解决方案，并突显了基于 BiVO4 的异质结在传感应用中的潜力。

**引言**
蛋白质在生物体内发挥着重要的生理作用，包括催化、分子运输和维持细胞结构。由于这些多样化的功能，蛋白质的定性和定量分析在疾病诊断、食品安全评估和环境监测等多个领域至关重要 [1], [2]。在蛋白质中，白蛋白是人体中最丰富的血浆蛋白，有助于维持血管内的胶体渗透压并促进脂质、药物和激素的运输。在正常生理条件下，白蛋白在尿液中的排泄量极少；然而，肾小球过滤或肾小管重吸收受损会导致尿液中白蛋白浓度异常升高。这种现象称为蛋白尿，是慢性肾病、糖尿病肾病和血管内皮功能障碍的早期生物标志物 [3], [4], [5]。牛血清白蛋白（BSA）因其与人类血清白蛋白（HSA）在结构和功能上的高度相似性而被广泛用作蛋白质分析的模型蛋白。BSA 成本低廉且易于获取，使其成为生物技术和分析应用中的标准蛋白 [6]。此外，BSA 可通过牛肉、乳制品和疫苗等多种途径进入人体。在某些个体中，由于免疫耐受性受损，接触 BSA 可能会引发免疫反应；多项研究表明，这类反应与 1 型糖尿病、膜性肾病和严重过敏反应的发病机制有关 [7], [8]。针对这些问题，世界卫生组织（WHO）为疫苗中的残留 BSA 含量制定了严格限制，规定每剂的最大允许浓度为 50 ng [9], [10], [11]。开发能够检测超痕量 BSA 的高灵敏度分析技术对于满足这一监管要求至关重要。迄今为止，已采用了多种分析技术进行蛋白质检测，包括分光光度法 [12]、荧光光谱法 [13], [14]、质谱法 [15], [16] 和酶联免疫吸附测定（ELISA）[17]。尽管这些方法具有高灵敏度，但它们通常存在一些局限性，如复杂的样品预处理程序、较长的分析时间、昂贵的仪器设备以及由于非特异性相互作用可能导致假阳性结果。为了克服这些传统方法的局限性，人们探索了用于 BSA 检测的电化学传感器 [18], [19], [20]。然而，这些系统仍存在固有的缺点，如信噪比较低、电流响应较弱导致灵敏度有限，以及对外部因素（如 pH 值和离子强度）的依赖性较强，从而影响信号稳定性和重复性。

作为传统传感方法的替代方案，光电化学（PEC）传感器作为一种结合了简单性和高灵敏度的下一代平台而备受关注。PEC 传感器通过在光电电极光照下产生电子-空穴对，并根据产生的光电流来量化分析物浓度来工作。这种方法具有多种优势，包括低背景噪声、快速响应时间、高灵敏度、操作简便、分析成本低以及易于设备微型化 [21]。此外，光学输入和电输出之间的物理分离减少了电气干扰，显著提高了信号精度和灵敏度。值得注意的是，光刺激作为一种稳定且独立的信号诱导机制，具有对背景电流和外部噪声的天然抗性，这是传统电化学系统中的常见挑战，因此提供了更高的灵敏度 [22]。基于这些优势，PEC 平台已被积极应用于开发针对多种分析物的高性能传感系统。例如，Gao 等人 [23] 成功使用基于 CdS/TiO2 的 PEC 系统检测亚硝酸盐物种，而 Pei 等人 [24] 利用 NiO/BiOI/AuNP/CdSe 组成的异质结 PEC 电极实现了有效的外泌体检测（AuNP 代表金纳米粒子）。根据这些传感应用，PEC 传感器的灵敏度对其整体性能起着关键作用，这主要取决于所使用半导体材料的物理化学性质和光电转换效率。各种半导体材料，如 CdS、TiO2、g-C3N4 和 ZnIn2S4，已被广泛用作光电电极，每种材料都有其独特的优势，但也存在固有的局限性 [25]。例如，CdS 具有优良的光电化学性能；然而，其高毒性和较差的环境稳定性严重限制了其在生物领域的应用 [26]。TiO2 以其无毒性和优异的光化学稳定性而闻名，但其宽带隙（约 3.2 eV）限制了其在太阳驱动传感应用中的有效性 [27]。已经采用了多种敏化策略（包括染料、量子点和表面修饰剂）将 TiO2 的光响应扩展到可见光区域 [28]，并相应地报道了基于敏化 TiO2 的可见光驱动传感系统 [29]。然而，这些敏化辅助系统仍存在长期稳定性和界面电荷转移效率低下的问题 [30]。尽管 g-C3N4 对可见光有响应，但其高电子-空穴复合率和较差的电荷传输性能导致了光电化学性能的下降 [31]。同样，ZnIn2S4 由于其低成本、易于合成和可见光吸收能力而具有吸引力；然而，其有限的电荷分离效率降低了其 PEC 活性 [32]。

为了克服传统半导体光电电极的结构和电子限制，人们投入了大量研究开发下一代光活性材料，这些材料具有优化的带隙，以实现高效的能量转换和与生物环境的兼容性。在这些系统中，钒酸铋（BiVO4）因其约 2.4 eV 的带隙、高太阳能转换效率、无毒性和低成本、易于合成以及优异的光化学稳定性而受到了广泛关注 [33]。特别是单斜晶系的 BiVO4 显示出出色的光催化活性，其可调节为不同的形态（如反相蛋白石、纳米棒和薄膜），从而增强了光捕获和反应效率 [34], [35], [36], [37]。然而，BiVO4 的电子迁移率低且电子扩散长度短，导致光生电子在到达电极表面之前大量损失。此外，体相和界面区域内的严重电荷复合显著降低了电荷分离效率 [37]。引入氧化锡（SnO2）中间层被提出作为一种有效的策略来克服这些电子传输限制。SnO2 具有高电子迁移率和低导带能量水平，能够从 BiVO4 中选择性地提取电子并快速将其传输到导电基底 [38]。此外，SnO2 作为空穴阻挡层，允许电子通过的同时抑制光生空穴的回流，从而减轻电子-空穴复合并显著提高电荷分离效率。SnO2 和 BiVO4 之间的优化带对齐使得界面电子传输更加高效，并降低了电荷传输的能量障碍。SnO2 的均匀涂层改善了 BiVO4 表面的电荷传输均匀性，同时提高了入射光子到电流的转换效率和光电流密度 [39], [40]。

尽管 PEC 传感器表现出优异的灵敏度和快速响应，但它们本质上缺乏分子选择性。这一限制主要源于光生空穴的强氧化潜力，由于高氧化潜力，它们会无差别地氧化多种有机底物，从而阻碍了复杂样本基质中分析物的选择性检测 [41]。为了解决这个问题，人们在电极表面固定了各种生物识别元件（如抗体、适配体和 DNA），以实现针对目标蛋白的高选择性。虽然这些生物识别材料在临床诊断中表现出优异的特异性，但它们在 PEC 基础传感器平台中的实际应用受到生产成本低、化学和热稳定性差以及保质期有限等问题的限制 [42]。

作为一种有前景的替代方案，分子印迹聚合物（MIPs）引起了广泛关注，它们是含有针对目标分子特异性结合位点的合成受体。MIPs 通常是通过功能单体与模板分子之间的非共价相互作用形成预聚物复合物，然后聚合成高度交联的聚合物网络来制备的。随后去除模板后，留下与目标分子大小、形状和功能基团分布相匹配的识别腔。这种分子印迹策略模仿了抗原-抗体或酶-底物系统中观察到的天然锁钥机制，从而提供了高分子特异性。除了选择性识别能力外，MIPs 还表现出显著的结构完整性、化学稳定性和延长的操作稳定性，使其成为传感应用中生物识别元件的有吸引力的替代品 [43], [44]。尽管由于蛋白质的大分子尺寸、结构复杂性和在聚合过程中的变性倾向，蛋白质的印迹仍然具有挑战性，但基于电聚合的表面印迹策略的最新发展为精确控制薄膜形成和改善识别位点的可访问性提供了有效解决方案 [45], [46]。得益于这些优势，已经开发了许多基于 MIP 的传感平台，用于高度选择性地检测 BSA [47], [48], [49], [50], [51]。近年来，基于 MIP 的 PEC 传感器被广泛用于检测小分子，如邻苯二甲酸二辛酯 [52]、尿酸 [53]、过氧化苯甲酰 [54] 和多巴胺 [55]；这些研究表明，由于 MIP 识别和 PEC 信号放大的协同优势，MIP 基传感器表现出优异的灵敏度和分子特异性。此外，多项研究已将 MIP-PEC 传感策略成功应用于蛋白质目标，包括癌胚抗原 [56] 和甲胎蛋白 [57]，显示出比传统生物传感器更高的选择性和稳定性。然而，关于基于 MIP 的 PEC 传感器用于检测 BSA 的报道仍然相对有限，尽管 BSA 作为研究生物分子相互作用和临床诊断的模型蛋白具有重要意义 [22]。此外，只有少数研究在基于 MIP 的 PEC 传感器中使用 BiVO4 作为半导体光电电极进行蛋白质检测 [58]，主要是因为大多数 BiVO4 相关研究集中在 PEC 水分解应用上。因此，BiVO4 作为生物传感功能平台的潜力尚未得到充分探索。

在这项研究中，基于 SnO2/BiVO4 异质结光电电极的氟掺杂氧化锡（FTO）制备了一种分子印迹光电化学传感平台，用于敏感和选择性地检测 BSA。该平台的一个关键特点是引入了 SnO2 中间层，它促进了界面电子提取并抑制了电荷复合，以及电聚合的 MIP 层用于选择性蛋白质识别。使用 BSA 作为模板，p-苯二胺（p-PD）和间苯二酚（Res）作为功能单体，该平台旨在增强光电流响应和分子选择性。在电聚合过程中，p-PD 和 Res 通过非共价相互作用（包括氢键和 π–π 相互作用）与 BSA 表面的功能基团相互作用，从而使聚合物层围绕蛋白质模板形成。聚合物形成后，使用含有十二烷基硫酸钠（SDS）的水溶液去除嵌入的 BSA，以破坏这些非共价相互作用，留下与 BSA 在大小、形状和表面功能上互补的识别腔。该系统提供了一种未被充分探索的材料设计方法，用于蛋白质印迹的光电化学传感，并扩展了基于BiVO4的异质结在生物传感中的应用。

**材料**
FTO基底（尺寸为20毫米×10毫米×2.2毫米，电阻率为6–9欧姆/平方毫米）购自Omniscience（韩国永仁市）。氯化亚锡二水合物（SnCl2·2H2O）购自Alfa Aesar（美国马萨诸塞州沃德希尔），用于制备SnO2层。硝酸铋五水合物（Bi(NO3)3·5H2O）和对苯醌分别购自Daejung Chemicals & Materials Co.（韩国始兴市）和Tokyo Chemical Industry Co.（日本东京），用于电沉积铋层。

**FTO/SnO2/BiVO4光电电极的优化**
图1a展示了在FTO电极上制备SnO2/BiVO4异质结的工艺流程。为了评估制备出的光电电极的光学吸收特性，进行了紫外-可见光谱（UV–Vis）测量，结果如图S1a所示。FTO和FTO/SnO2电极在300纳米以上波长的吸收强度显著下降，表明它们在可见光区域的吸光能力较弱。几乎相同的UV–Vis光谱表明FTO对可见光的吸收非常低。

**结论**
在本研究中，通过优化SnO2层的厚度来提高光电转换（PEC）效率，制备出了FTO/SnO2/BiVO4配置的光电电极。在光电电极表面合成了用于BSA检测的分子印迹（MIP）薄膜，其中目标蛋白的摩尔用量经过优化以最大化吸附性能。利用扫描电子显微镜（SEM）表征了各电极层的表面形貌，并通过X射线衍射（XRD）和X射线光电子能谱（XPS）分析了其晶体结构和元素组成。

**作者贡献声明**
Seok Jin Lim：方法论、实验设计、数据分析、概念构建。
Jeongyeon Bae：方法论、实验设计、数据分析。
Toshinori Fujie：数据分析、概念构建。
Jong Pil Park：撰写初稿、指导工作、数据分析、概念构建。
Jinyoung Park：撰写初稿、指导工作、方法论设计、数据分析、概念构建。

**资助**
本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）基础科学研究计划的支持，该计划由科学技术信息通信部（MINistry of Science and ICT）资助（项目编号：RS-2023-00240220），以及大邱地区创新系统与教育（RISE）Glocal 30计划的支持，该计划由教育部（MOE）和大邱市政府共同资助（项目编号：2025-RISE-03-001，负责人：J. Park）。此外，本研究还得到了韩国国家研究基金会（NRF）的资助。

**利益冲突声明**
作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系，这些因素可能会影响本文所报告的研究结果。