在巴西米纳斯吉拉斯州的Zona da Mata地区，有三种不同的细菌导致‘Ubá’芒果出现叶斑病

《Journal of Phytopathology》：Three Distinct Species Cause Bacterial Leaf Spots in ‘Ubá’ Mango in Zona da Mata, Minas Gerais, Brazil

　　摘要

‘Ubá’芒果是巴西米纳斯吉拉斯州Zona da Mata地区农民的重要经济作物。该地区的有机农民最近报告称，这种芒果品种的果园中出现了原因不明的严重叶斑病，引起了广泛关注。本研究的目的是通过微生物分离、生化和分子特性分析、多位点序列分析以及致病性测试来确定该疾病的病原体。从患病叶片中分离出橙色、黄色和奶油色的细菌菌落。将这些菌落接种到健康的芒果植株上后，每种颜色的菌落都能再现典型的叶斑症状。从接种后的植株中再次分离出与自然感染植株中相同的菌落形态的细菌，证实它们是该疾病的致病因子。系统发育分析显示，奶油色细菌与Burkholderia contaminans类型菌株属于同一分支，而黄色和橙色细菌则分别属于Sphingomonas和Microbacterium属，表明发现了新的细菌基因型物种。这些结果表明，Ubá地区芒果树的叶斑病具有复杂的病因，并为诊断和控制方法的研究提供了关键信息。

1 引言

‘Ubá’芒果（Mangifera indica L.）是巴西米纳斯吉拉斯州Zona da Mata地区的特色品种，以其甜美的风味、浓郁的香气以及短而柔软的纤维而备受推崇（Benevides等人，2008年）。这一品种的独特特性使其被认定为Ubá市的自然和非物质财产（市政府法令第4258号，2003年）。该品种主要由小规模农民在Zona da Mata地区种植，其中许多采用有机或半有机种植方式。此外，也有大规模的果园用于果汁和果肉的工业加工和出口（Pinto等人，2004年）。然而，芒果生产受到植物病害的影响，农民们不断面临新的挑战。2022年，位于Zona da Mata地区的Giricema（南纬21.0085°，西经42.7187°）的有机农民报告称，在‘Ubá’芒果叶片表面随机分布着带有黄化晕圈的黑色斑点（图1）。当地生产者还指出，病害在果园低洼处更为常见，且与昆虫伤害同时发生，导致果园产量下降。图1显示了由自然细菌感染引起的芒果枝条（a）和叶片（b）上的随机分布的黑色斑点症状。已知有多种细菌性病害会影响芒果树，包括由Xanthomonas citri pv. mangiferaeindicae引起的细菌性叶斑病（Sossah等人，2024年）、由Pseudomonas syringae pv. syringae引起的细菌性顶端坏死病（Gutiérrez-Barranquero、Cazorla和de Vicente，2019年）以及由Pantoea agglomerans引起的芒果细菌性坏死病（Gutiérrez-Barranquero、Cazorla、Torés和de Vicente，2019年）。其中，细菌性叶斑病在全球范围内都有分布，曾在美洲、澳大利亚、非洲和亚洲部分地区被记录到（Gagnevin和Pruvost，2001年；Sossah等人，2024年）。Giricema果园中的叶斑症状与由X. citri pv. mangiferaeindicae引起的细菌性叶斑病相似，这种病害还会影响枝条和果实，有时会导致果实提前脱落（Honger等人，2024年）。尽管此前在巴西已有该病害的报道，但在Zona da Mata地区的‘Ubá’芒果中尚未发现其发生。本研究的目的是查明Giricema地区‘Ubá’芒果果园中观察到的叶斑症状的致病因子。为此，研究人员进行了病原体分离、致病性测试、一系列生化特性分析以及DNA序列比对，最终得出该病具有复杂病因的结论。

2 材料与方法

2.1 细菌分离、菌株与培养

2022年和2023年，研究人员在两个不同的生产区域收集了带有症状叶片的枝条。从坏死病灶边缘采集的组织样本首先用70%乙醇（1分钟）和2%次氯酸钠（2分钟）进行表面消毒，然后用无菌蒸馏水冲洗三次。消毒后的组织被浸泡后划线接种到523琼脂培养基（Kado和Heskett，1970年）上。培养皿置于28°C±1°C条件下培养48小时以促进微生物生长。每个菌落颜色的代表性菌株被单独接种到新鲜的523琼脂培养基上，在28°C下培养48小时进行细胞增殖。根据观察到的主要菌落形态，将纯化的细菌菌株分为三组。由于每组内的菌落在形态上无法区分，因此选择每组中的一个菌株作为代表进行生化、致病性和分子特性分析。至少三个纯化菌株的细胞被重新悬浮在30%甘油中，并储存在维索萨联邦大学（UFV）分子植物细菌学实验室的培养物库中（CFBM-UFV），温度为-80°C。X. citri pv. anacardii CFBM-UFV-0387（CCRMTAQ18）菌株被用作生化测试和16S rDNA扩增的阳性对照，该菌株由佩南布科联邦农业大学（Universidade Federal Rural de Pernambuco）的Marco Aurelio Siqueira da Gama教授提供。细菌菌株通常在523琼脂培养基上培养28小时以进行实验。

2.2 生化测试

为了验证Xanthomonas是否为致病因子，并根据菌落形态对菌株进行分类，研究人员按照既定方案（Mariano和de Souza，2016年；Schaad等人，2001年）使用在523琼脂培养基上生长的单个菌落进行了关键生化测试。具体包括：使用3% KOH溶液测试溶解性；通过含有尿素和结晶紫的液体培养基培养细菌来检测尿素水解；使用1%四甲基苯二胺溶液评估细胞色素C氧化酶活性；通过含有L-天冬酰胺作为唯一碳源和氮源的液体最小培养基培养细菌来检测天冬酰胺酶的产生；以及使用酵母葡萄糖碳酸钙琼脂（YDC）培养细菌来检测黄色或橙色色素的产生。每个测试都使用了Xanthomonas参考菌株以及从CFBM-UFV获得的适当阳性 and 阴性对照菌株。

2.3 植物生长与维护

健康的‘Ubá’芒果植株来自维索萨联邦大学（Universidade Federal de Vi?osa）农学系的果树科学教学、研究与推广部门。这些植株是通过将‘Ubá’芒果枝条（来自UFV芒果种质库，编号115；位于米纳斯吉拉斯州Visconde do Rio Branco）嫁接到1.5年生的‘Imbú’芒果（M. indica L.）砧木上培育而成的。嫁接后的植株被种植在3升袋中，并根据其需求进行灌溉和施肥。

2.4 致病性测试

嫁接后1至1.5年，研究人员采用三种不同的方法对芒果植株进行了接种：叶片渗透法和喷洒未受伤或受伤的叶片。作为不同菌落形态代表的菌株被培养在523琼脂培养基上，并重新悬浮在10 mM MgCl2溶液中。使用分光光度计将细胞悬浮液在600 nm处的光密度（OD600）调整至0.1（约10^8个菌落形成单位（CFU）/mL，然后制备1:10的稀释液。使用无针注射器将每种稀释液注入健康芒果叶片中，10 mM MgCl2作为阴性对照。对于另外两种方法，植株在接种前后24小时分别在100%相对湿度的喷雾室中处理。未稀释的细菌悬浮液加入0.01% Tween-80，接种前用7针装置轻轻划伤叶片的一半，另一半保持未受伤状态。未稀释的细菌悬浮液使用Jet Master接种泵（Schulz S.A.，位于巴西Joinville）喷洒在叶片两面直至流干。所有接种的植株在28°C±1°C的生长室中培养30天，并观察症状的发展情况。致病性测试分别在2022年6月和2023年7月进行了两次。为了确认其致病性，研究人员如上所述从接种植株中重新分离细菌，并将其形态特征与用于接种的菌株及从自然感染植株中分离的菌株进行比较。此外，还尝试从用10 mM MgCl2处理过的叶片中回收细菌菌株。

2.5 DNA提取、16S rDNA测序与比对

根据制造商说明，使用Wizard DNA纯化试剂盒（Promega Corporation，美国威斯康星州Madison）从在523琼脂培养基上培养48小时的细菌细胞中提取总DNA，并使用NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific，美国特拉华州Wilmington）进行定量。使用通用引物（表S1）（Weisburg等人，1991年）部分扩增16S rDNA区域（Weisburg等人，1991年）。PCR反应在15 μL总体积中进行，使用Platinum Taq DNA聚合酶试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州Waltham）按照制造商说明进行。模板DNA浓度调整为每反应20 ng。扩增在PTC-100 Peltier热循环仪（MJ Research）中进行，程序包括初始步骤94°C 2分钟，随后是35个循环：94°C 30秒、52°C 30秒、72°C 2分钟，最后是72°C 5分钟。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上通过电泳分离，使用GelRed（Biotium，美国弗里蒙特）染色，并在凝胶文档系统（Loccus，巴西圣保罗）中在紫外光下观察。扩增产物使用Wizard SV Gel和PCR Clean-UP系统（Promega Corporation）进行纯化，并在ABI 3500（Applied Biosystems，美国福斯特）中进行测序，使用扩增所用的引物对。使用SeqAssem（Hepperle，2004年）获得每个基因的正反序列的一致序列，并通过Blastn（Altschul等人，1990年）与GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中存储的序列进行比对。

2.6 系统发育分析

通过贝叶斯推断进行多位点序列分析（MLSA），将芒果菌株归类到已发表的有效细菌物种中。使用了之前描述的用于扩增Sphingomonas、Microbacterium和Burkholderia物种基因序列的引物（表S1）（Chen等人，2012年；Richert等人，2005年；Spilker等人，2009年；Tayeb等人，2008年）（Chen等人，2012年；Richert等人，2005年；Spilker等人，2009年；Tayeb等人，2008年）。扩增条件与16S rDNA相同，根据每对引物的适当退火温度进行（表S1）。用于系统发育构建的Sphingomonas、Microbacterium和Burkholderia类型或参考菌株的基因序列来自GenBank中验证的基因组序列（表S2–S4）。序列比对使用Muscle算法（Edgar，2004年）在MEGA版本11中实现（Tamura等人，2021年）。序列连接使用SequenceMatrix（Vaidya等人，2011年）。单基因或连接基因序列的系统发育分析采用贝叶斯推断和Markov Chain Monte Carlo统计方法（MrBayes，Ronquist等人，2012年）。系统发育分析中使用的最佳替换模型通过MrModel（Nylander，2004年）和Akaike信息准则（AIC）为每个基因选择。所有基因应用了具有不变位点比例（+I）和伽马分布速率（+G）的General Time Reversible（GTR）模型。贝叶斯分析进行了两次独立运行（每次1000万次），并在FigTree（https://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/）中可视化，并使用Inkscape（https://inkscape.org）进行编辑。

2.7 脂肪酸谱分析

使用Microbial Identification System（MIS；MIDI Inc.，美国新泽西州纽瓦克）确定CFBM-UFV-0370和CFBM-UFV-371菌株的脂肪酸甲酯（FAME）谱，以获得额外的分类信息。细菌在胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）培养基（Taylor和Geldreich，1979年）上培养28小时，然后根据MIS协议收集菌落进行FAME提取。提取物使用Hewlett-Packard 7890A气相色谱仪（Hewlett-Packard，美国加州帕洛阿尔托）进行分析，通过将其峰值与Sherlock Microbial Identification System（MIDI Inc.，美国新泽西州纽瓦克）的内部标准进行比较，以评估FAME的组成和丰度。获得的CFBM-UFV-370和CFBM-UFV-371分离株的FAME谱型与之前描述的同属物种的FAME谱型进行了比较（Alves等人2015年；Li等人2004年；Mawlankar等人2015年；Yabuuchi等人1990年）。

3 结果

3.1 从症状叶片中分离细菌

在两个不同的年份里，由两位不同的实验室成员独立进行分离尝试后，始终从症状叶片中分离出了三种不同形态的细菌菌落：黄色、橙色和奶油色的菌落（图2）。这些菌落在处理过的叶片组织中非常丰富。为了获得纯培养物，每种菌落类型至少有三个单独的菌落被划线接种到新鲜的琼脂培养基上，并储存在CFBM-UFV中以进行进一步的表征。图2：在图查看器中打开（PowerPoint）

3.2 芒果分离株的生化特性

首先，使用X. citri pv. anacardii作为对照，进行了生化测试，以表征从病组织中分离出的菌株，以验证Xanthomonas是否可能是导致‘Ubá’芒果出现黑斑的原因。代表黄色菌落组的CFBM-UFV-0370分离株在YDC培养基上产生了黄色色素，并且对KOH具有溶解性，但在细胞色素C氧化酶、脲酶和天冬酰胺酶测试中呈阴性结果。代表橙色菌落组的CFBM-UFV-0371分离株在YDC培养基上产生了黄色色素，但对KOH具有溶解性，在细胞色素C氧化酶、脲酶和天冬酰胺酶测试中呈阴性结果。最后，代表奶油色菌落组的CFBM-UFV-0384分离株在YDC培养基上没有形成黄色菌落，也没有降解尿素，但在KOH溶解性、细胞色素C氧化酶和天冬酰胺酶测试中呈阳性结果（表1）。这三个代表性分离株的结果与其根据菌落形态分类的结果一致。此外，CFBM-UFV-0370的分离株结果与X. citri pv. anacardii参考菌株的结果以及之前描述的Xanthomonas属的结果相符（Saddler和Bradbury 2015年）。表1：从病芒果组织中分离出的细菌的分生化特性。

3.3 代表性芒果分离株的致病性

将CFBM-UFV-0370、CFBM-UFV-0371和CFBM-UFV-0384分离株（分别代表黄色、橙色和奶油色菌落类型）接种到受伤的芒果叶片中后，出现了病害症状。相反，当未受伤的叶片一半被喷洒细菌悬浮液时，则没有出现症状（数据未显示）。CFBM-UFV-0370、CFBM-UFV-0371和CFBM-UFV-0384分离株引起的症状分别在接种后5天、7天和7天出现，表现为被小褪色晕圈包围的小坏死斑点（图3a–d）。在叶片受伤一半喷洒细菌悬浮液的植株中，所有三个测试分离株在接种后11天也出现了类似的症状（图3e–h）。接种叶片表现出的症状与自然感染芒果果园中的症状相似。病变逐渐扩大，并被明显的褪色晕圈包围，但在接种后16至30天的疾病评估期间保持不变。尽管用10 mM MgCl2喷洒的叶片在针刺造成的伤口周围出现了微小的坏死损伤，但这些损伤没有随时间增长，且其外观与细菌分离株引起的病变不同（图3e）。

3.4 在属水平上的病原体鉴定

最初，尝试使用从橙色、奶油色和黄色菌落中提取的DNA中的属特异性引物来扩增Xanthomonas序列。尽管尝试了不同的PCR条件，但从代表性芒果分离株的DNA中从未扩增出片段，但从阳性对照菌株X. citri pv. anacardii CFBM-UFV-0387的DNA中扩增出了片段（数据未显示）。因此，我们决定首先在属水平上确定显示所有菌落形态的菌株的分类位置。使用CFBM-UFV-0370和CFBM-UFV-0371代表性分离株的16S rDNA部分序列进行Blast搜索（表S5），发现其与Sphingomonas sanguinis NBRC 13937T（99.69%；登录号NR_113637.1）和Microbacterium proteolyticum RZ36T（99.63%；NR_135869.1）的相似性最高。CFBM-UFV-0384分离株的16S rDNA部分序列与Burkholderia paludis MSh1T（100%；NR_178850.1）、Burkholderia lata 383T（100%；CP000152.1）和Burkholderia contaminans J2956T（100%；NR_104978.1）的相似性最高。

3.5 在种水平上的病原体鉴定

使用部分和连接的16S rDNA、recA和rpoB序列构建的系统发育树（表S5）显示，CFBM-UFV-0384分离株与几个Burkholderia contaminans菌株分在同一分支中，包括该物种的模式菌株（图4）。当使用每个单独位点的部分序列独立构建系统发育树时，也观察到了CFBM-UFV-0384分离株与Burkholderia contaminans菌株的类似聚类（图S2）。

3.6 新基因组种的FAME谱型

为了进一步验证CFBM-UFV-0370和CFBM-UFV-0371分离株是否属于新的细菌基因组种，我们确定了它们的FAME谱型，并将其与系统发育树中与其亲缘关系最近的细菌物种的FAME谱型进行了比较。使用工具数据库比较CFBM-UFV-0370和CFBM-UFV-0371分离株的FAME谱型，确认了它们在属水平上的分类位置，但它们与不同的Sphingomonas和Microbacterium物种存在差异。CFBM-UFV-0370分离株中主要存在的脂肪酸是18:1 ω7c/18:1 ω6c（70.1%），这在与CFBM-UFV-0370亲缘关系最近的S. yabuuchiae和S. parapaucimobilis模式菌株中有报道（表2）。此外，用于比较的模式菌株中存在17:0 ω6c，但在CFBM-UFV-0370的FAME谱型中未发现。对于CFBM-UFV-0371分离株，最丰富的脂肪酸是15:0 anteiso（43.7%）、16:0 iso（23.4%）和17:0 anteiso（21.3%），这与M. proteolyticum和M. enclense模式菌株的谱型相反（表3）。CFBM-UFV-0371的FAME谱型中含有微量的12:0、15:1 anteiso A、16:1 iso G、18:0和20:0，而这些在用于比较的模式菌株中不存在。表2：CFBM-UFV-0370分离株及其系统发育亲缘关系的细胞脂肪酸组成（%）。

4 讨论

受到巴西Zona da Mata地区芒果生产者的启发，他们正在经历一种以叶片坏死斑点为特征的严重芒果疾病爆发，我们着手确定其致病因子。从病组织中分离出的细菌表现出三种不同的菌落形态。生化测试表明，这些分离株中的一些与Xanthomonas属观察到的反应不同。考虑到之前在不同国家由X. citri pv. mangiferaeindicae引起的爆发及其在芒果植物上引起的症状相似性（Sossah等人2024年），我们尝试特异性检测Xanthomonas，但未能成功。令人惊讶的是，当将这些菌株接种到健康植物中时，每个菌落形态组的代表性分离株都能引起与芒果果园中观察到的相同的症状。从接种了这些菌株的植物中分离出的细菌具有与最初从自然感染植物中获得的相同的生长模式和形态特征，这满足了科赫假设。使用16S rDNA序列比较，将在GenBank中存储的每个菌落形态的分离株与接种组中的分离株进行了鉴定，而从用10 mM MgCl2处理的叶片中未分离出任何细菌菌落（图S1），从而验证了科赫假设。

4 讨论

受到巴西Zona da Mata地区芒果生产者的启发，他们正在经历一种以叶片坏死斑点为特征的严重芒果疾病爆发，我们着手确定其致病因子。从病组织中分离出的细菌表现出三种不同的菌落形态。生化测试表明，这些分离株中的一些与Xanthomonas属观察到的反应不同。考虑到之前由X. citri pv. mangiferaeindicae引起的不同国家的爆发及其在芒果植物上引起的症状相似性（Sossah等人2024年），我们尝试特异性检测Xanthomonas，但未能成功。令人惊讶的是，当将这些菌株接种到健康植物中时，每个菌落形态组的代表性分离株都能引起与芒果果园中观察到的相同的症状。从接种了这些菌株的植物中分离出的细菌具有与最初从自然感染植物中获得的相同的生长模式和形态特征，这满足了科赫假设。使用16S rDNA序列比较，在属水平上确定了每个菌落形态组的代表性分离株。结果表明，每个菌株属于不同的属：Sphingomonas、Microbacterium和Burkholderia。Sphingomonas属的分离株经常在健康芒果植物的根际和内生菌系中发现（Adhikary等人2022年；Kumar等人2021年）。在MLSA树中，CFBM-UFV-0370分离株被分配到一个与从巴西的植物、土壤和人类样本中分离出的多个物种相关的独立分支中（Deusdará等人2023年；dos-Santos等人2024年；Fagotti等人2024年）。根据系统发育分析的结果，可以得出结论，这里导致‘Ubá’芒果出现叶斑的Sphingomonas很可能是一个新的基因组种，它与S. yabuuchiae、S. parapaucimobilis、S. pseudosanguinis、S. sanguinis、S. fuzhouensis和S. paucimobilis有共同的祖先。在本研究中发现的、与CFBM-UFV-0370分离株系统发育上最接近的物种中，没有一种被报道为巴西的植物病原体。然而，在中国广东，S. carotinifaciens在2016年被描述为导致芒果果园出现枯萎和叶脉干腐症状（Liu等人，2018年；Liu等人，2025年）。我们的分析将这一中国菌株（NY01）归入一个与CFBM-UFV-0370分离株密切相关的多物种支系。尽管这两种分离株都会引起芒果植株的疾病，但它们表现出不同的致病方式：中国分离株导致系统性症状，而巴西分离株则在‘Ubá’芒果上引起局部的小叶坏死斑点。这些病原体的共同祖先表明，广谱性的Sphingomonas菌株可能适应于在芒果树上引发疾病，并且可以不经察觉地广泛传播。此外，巴西和南亚菌株之间的致病性差异可能与它们的系统发育分歧有关。已有研究从健康芒果植物的微生物组中分离出Microbacterium细菌（Wang等人，2025年），但关于这些菌株引起疾病的报道存在争议。该属的菌株既从果园中的健康植物中分离出来，也从表现出枯萎症状的植物中分离出来（Khan等人，2014年）。尽管如此，Microbacterium尚未被明确证明与芒果疾病的引发有关。在这方面，有一篇基因组报告描述了一种Microbacterium菌株作为芒果疾病的疑似致病因子（Rakhashiya等人，2015年），但作者没有描述疾病症状或满足科赫法则的要求，且该基因组组装被NCBI分类为受污染的。此外，NCBI数据库将这一组装（GCA_000724685.2）归类为Enterobacter hormaechei菌株的基因组，其16S rDNA和gyrB序列与Microbacterium菌株没有显著相似性（数据未显示）。总之，我们的研究首次描述了Microbacterium物种作为芒果植物的病原体。值得一提的是，先前的一项研究报道了该属的一个菌株在印度尼西亚引起水稻叶绿素条纹病（Kaku等人，2000年）。Burkholderia contaminans属于Burkholderia cepacia物种复合体，具有全球分布（Vanlaere等人，2009年）。在巴西，它已经从临床环境（如人类样本和设备）以及天竺葵植物中分离出来（de Sá Paraskevopoulos等人，2025年；Jaimes，2025年）。某些Burkholderia物种是具有重要经济价值的作物的著名病原体，如洋葱（Velez等人，2023年）、水稻（Ortega和Rojas，2021年）、玉米（Gijon-Hernandez等人，2011年）和香蕉（Lee和Chan，2007年）。虽然已经从芒果植物中分离出Burkholderia细菌（de los Santos-Villalobos等人，2013年；Wang等人，2025年），但它们对这种植物的致病性尚未得到证实。有趣的是，先前的一项研究将一种Burkholderia菌株与巴基斯坦信德地区的芒果枯萎症状联系起来（Khan等人，2013年），但其对芒果的致病性尚未得到确认。在我们的分析中，这种巴基斯坦菌株（TJI49）与CFBM-UFV-0384分离株属于一个远缘的支系。最后，我们的工作首次观察到Burkholderia细菌引起芒果树疾病。在这里，我们描述了三种主要被认为是对芒果树有益的内生菌，作为植物生长促进剂和/或病原体拮抗剂（Asaf等人，2020年；Cordovez等人，2018年；de los Santos-Villalobos等人，2013年）。可以推测，本研究中描述的细菌分离株可能从与芒果植物建立某种生态相互作用的菌株进化而来。尽管如此，导致Zona da Mata地区芒果疾病的病原体、植物和/或环境的潜在变化仍然不清楚。对该地区近期环境条件的研究以及对本研究分离株的进一步表征可能会揭示这些植物病原体的出现机制。例如，植物内生菌群是细菌间水平基因转移的生态位，也是获得细菌致病性特征的一种方式（Kado，2009年）。此外，有报道指出Sphingomonas和Burkholderia属在Xanthomonas感染的芒果植物微生物组中富集（Li等人，2025年）。在这里，我们观察到新的基因组物种在芒果树上引起类似于X. citri pv. mangiferaeindica引起的细菌黑斑症状，但在任何受感染的组织中均未检测到Xanthomonas的存在。我们假设，将Zona da Mata地区分离的菌株与引起芒果叶斑的Xanthomonas菌株的基因组序列进行比较，可能有助于了解致病基因的水平转移。我们描述了无法归类到任何已发表细菌物种的Sphingomonas和Microbacterium分离株。它们在MLSA系统发育树中的分歧通过与其最接近物种的FAME谱型显著差异得到支持。因此，我们提供了将这些分离株归类为新细菌基因组物种的强有力的证据。这种新的Sphingomonas基因组物种以其主要膜相关脂肪酸18:1 ω7c/18:1 ω6c的含量而与相近物种区分开来。它在KOH中的溶解性测试呈阳性，在YDC培养基上产生黄色菌落，而在尿素酶、细胞色素C氧化酶和天冬酰胺酶测试中呈阴性。代表性分离株包括CFBM-UFV-0370、CFBM-UFV-0374和CFBM-UFV-0375。对于新的Microbacterium基因组物种，15:0 anteiso、16:0 iso和17:0 anteiso是主要的膜相关脂肪酸，在KOH中的溶解性、尿素酶、氧化酶和天冬酰胺酶测试中呈阴性；但在YDC培养基上产生黄色菌落的测试中呈阳性。代表性分离株包括CFBM-UFV-0371、CFBM-UFV-0372和CFBM-UFV-0373。本研究的结果对于开发和实施Zona da Mata地区‘Ubá’芒果黑斑病的诊断和控制方法至关重要。未来对每个细菌基因组物种的代表性分离株进行基因组序列分析，可以为它们的分类提供有力支持。

5 结论
本研究证明，在巴西MG地区的Zona da Mata，三种不同的细菌物种导致了‘Ubá’芒果树的叶部坏死黑斑。通过基于广泛接受的基因标记的MLSA系统发育分析和生化分析，确定Burkholderia contaminans以及Sphingomonas和Microbacterium属的两个新基因组物种是致病因子。这些结果为开发和实施控制方法以减轻该疾病的负面影响提供了重要信息。

作者贡献
Nikolas Emanuel Chaves-Silva：正式分析、研究、写作——原始草稿；
Adryelle Anchieta Sousa：正式分析、研究、写作——审稿和编辑；
Sandro Lúcio Silva Moreira：研究、资源提供、写作——审稿和编辑；
Camila Mota De Assis Figueiredo：研究；
Cleverson Vieira Pires：研究、资源提供、写作——审稿和编辑；
Mateus Pereira Gonzatto：资源提供、写作——审稿和编辑；
Alex Gazolla de Castro：研究、写作——审稿和编辑；
Marcos Rogerio Tótola：研究、写作——审稿和编辑；
Jorge Luis Badel：概念化、资源提供、数据管理、方法学制定、资金获取、项目管理、监督、写作——审稿和编辑。

致谢
作者感谢巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）为Nikolas E. Chaves-Silva和Adryelle A. Sousa提供博士奖学金，以及巴西佩尔南布科联邦农村大学的Marco A. S. da Gama教授提供X. citri pv. anacardii CCRMTAQ18参考菌株。本文的发表费用由巴西高等教育人员培训协调委员会（CAPES）资助（ROR标识符：00x0ma614）。

资金
本研究部分由巴西高等教育人员培训协调委员会（CAPES）资助，财务代码001。

伦理声明
作者声明与本出版物无关的任何利益冲突。在本研究中，疾病病因的确定完全在维索萨联邦大学的实验室完成。Cleverson V. Pires隶属于Syagrus Agroambiental公司，该公司为芒果生产者提供技术支持。这位合著者参与了田间症状观察和样本采集，未涉及任何财务或其他利益冲突。

数据可用性声明
支持本研究发现的数据作为支持信息提供。如有需要，可从相应作者处获取额外数据。