摩根氏菌属中VI型分泌系统(T6SS)的全基因组生物信息学分析

《MicrobiologyOpen》：Genome-Wide In Silico Analysis of the Type VI Secretion System (T6SS) Within the Morganella Genus

　　

摘要 摩根氏菌属是摩根氏菌科的成员，是人类肠道菌群中的机会性病原菌。它们适应性强，可引起多种感染，并且由于其毒力因子和耐药基因而难以治疗。2017年，摩根氏菌被列入世界卫生组织细菌性病原体优先清单。2024年的一项基因组研究发现，临床相关物种之间存在显著差异，特别是介于M. sibonii和M. morganii之间，其中M. sibonii拥有独特的VI型分泌系统操纵子。本研究旨在探索VI型分泌系统在摩根氏菌物种中的分布和多样性。研究对1966年至2023年间收集的293株摩根氏菌基因组进行了回顾性分析。使用SecReT6平台和RAST对VI型分泌系统基因簇及其亚型进行了注释，并对tssB基因进行了系统发育分析。通过使用BlastP和Alphafold进行生物信息学分析，鉴定了推定的效应蛋白和免疫蛋白。研究人员发现M. sibonii分离株拥有四个VI型分泌系统基因簇，亚型分别为i1、i3 v.1、i3 v.2和i5。相比之下，大多数M. morganii分离株缺乏VI型分泌系统，只有三分之一的菌株含有亚型i1的VI型分泌系统。值得注意的是，M. morganii通常携带VI型分泌系统预测的TseV效应蛋白，而M. sibonii则表现出更多样化的效应蛋白。本研究揭示了摩根氏菌属中物种特异性的VI型分泌系统模式，并表明VI型分泌系统可能在细菌生活方式竞争和宿主-病原体相互作用中起关键作用。这为未来研究摩根氏菌的致病性铺平了道路。

研究背景与目的

摩根氏菌是肠杆菌目摩根氏菌科的革兰氏阴性机会性病原菌，广泛分布于环境及人、哺乳动物和爬行动物的肠道菌群中，可引起脓毒症、脓肿等多种感染，且因天然产生DHA头孢菌素酶、对碳青霉烯类药物敏感性低以及多重耐药(XDR)和广泛耐药(XDR)菌株的出现而治疗困难。2017年，世界卫生组织将其列入“细菌性病原体优先清单”，并于2024年将其列为“关键”级别。近年来，基于基因组学的分类学分析将摩根氏菌属重新划分为摩根摩根氏菌、中间摩根氏菌和西博尼摩根氏菌三个物种/亚种。其中，西博尼摩根氏菌的基因组具有特异性，包括一个独特的VI型分泌系统(T6SS)操纵子。T6SS是一种广泛存在于革兰氏阴性菌中的接触依赖性纳米分子装置，可递送多种靶向原核或真核细胞的效应蛋白(效应子)，在细菌间竞争、宿主定植、营养获取等多种生理和致病过程中发挥关键作用。然而，迄今为止，尚无研究系统性地探讨VI型分泌系统在摩根氏菌属中的分布、多样性及其潜在功能。鉴于VI型分泌系统在细菌-环境和细菌-宿主相互作用中的重要作用，研究人员旨在通过全基因组生物信息学分析，描述临床相关摩根氏菌物种中VI型分泌系统的分布、多样性及推定的效应蛋白，以期为理解其致病机制提供新见解。

研究方法概要

本研究为回顾性基因组分析。研究队列包括293株于1996年至2023年间从德国、英国、法国等多个国家临床标本中分离的摩根氏菌菌株。通过全基因组测序和系统发育分析确定了物种分类。利用SecReT6平台和RAST工具对所有菌株基因组进行VI型分泌系统基因簇的识别、亚型注释和可视化。基于tssB基因的系统发育分析用于亚型分类。通过比较基因组学工具分析不同菌株间VI型分泌系统簇的同源性和同线性。通过手动分析vgrG基因附近的遗传环境，并利用BlastP和Alphafold数据库进行比对，鉴定了推定的效应蛋白及其免疫蛋白。对主要效应蛋白的编码基因进行了核苷酸序列比对和距离分析。

研究结果

3.1 VI型分泌系统亚型在摩根氏菌物种间的多样性

在293株临床分离株中，约半数菌株含有至少一个VI型分泌系统簇，而产碳青霉烯酶菌株携带VI型分泌系统的比例略高。所有摩根氏菌的VI型分泌系统均属于T6SSi型，并进一步分为i1、i3和i5三种亚型。亚型分布呈现物种特异性模式。

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  西博尼摩根氏菌：绝大多数菌株含有4个VI型分泌系统簇，分别为亚型i1、i3 v.1、i3 v.2和i5，其中i3 v.1簇为西博尼摩根氏菌特有，位于海藻糖操纵子下游，而i3 v.2簇也存在于中间摩根氏菌中。
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  摩根摩根氏菌：超过60%的菌株不含任何VI型分泌系统簇，剩余37.7%的菌株仅含有一个亚型i1的簇。在VI型分泌系统阴性的摩根摩根氏菌中，发现了tssF基因的残留，提示其i1簇发生了部分缺失。
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  中间摩根氏菌：VI型分泌系统簇的数量从0到4个不等。近半数菌株仅含有一个亚型i5的簇，该亚型主要用于区分中间摩根氏菌。VI型分泌系统基因簇的结构基因组成在物种间具有保守的同线性，但簇的数量和亚型组合存在差异。

3.2 vgrG基因在摩根氏菌物种中的流行率和多样性

vgrG基因编码T6SS的针尖结构组分，并可作为效应蛋白的载体。分析发现，vgrG基因的数量和分布在不同物种间差异显著。

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  摩根摩根氏菌：约半数菌株被注释到vgrG基因，其中大部分存在于VI型分泌系统i1阳性菌株中。
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  西博尼摩根氏菌：所有菌株均为VI型分泌系统阳性，且vgrG基因数量在1到6个之间，显示出更高的多样性。
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  中间摩根氏菌：绝大多数菌株为VI型分泌系统阳性，但vgrG基因数量变异更大。值得注意的是，仅携带亚型i5簇的中间摩根氏菌菌株未检测到vgrG基因。

3.3 摩根氏菌中的效应蛋白和免疫蛋白

通过分析vgrG基因下游序列，研究人员鉴定出多种推定的T6SS效应蛋白及其免疫蛋白，其分布具有物种特异性。

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  摩根摩根氏菌：效应蛋白种类相对单一，绝大多数菌株携带TseV内切核酸酶效应蛋白及其对应的免疫蛋白TsiV。此外，还检测到少量脂酶和RhS型蛋白效应蛋白。
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  西博尼摩根氏菌：效应蛋白库高度多样化，主要包括脂酶、S型绿脓菌素、TseV和RhS型蛋白。还发现了少量多态性毒素33型、Tde1/ParE毒素-抗毒素系统等独特效应蛋白。
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  中间摩根氏菌：效应蛋白库呈现出摩根摩根氏菌和西博尼摩根氏菌的混合特征，包括RhS型蛋白、脂酶、TseV，以及西博尼摩根氏菌中未见的VasX毒素和DUF4150蛋白。
  核苷酸序列分析显示，tseV基因在摩根摩根氏菌和西博尼摩根氏菌中分别形成了两个高度保守的基因型。相比之下，脂酶、RhS和S型绿脓菌素编码基因则表现出更高的序列多态性，提示其功能或靶标可能更为多样化。

讨论与结论总结

本研究首次在摩根氏菌属中开展了大规模的VI型分泌系统基因组学分析。结果表明，VI型分泌系统在该菌属中普遍存在，且其分布、亚型及效应蛋白库均表现出显著的物种特异性。研究人员认为，不同VI型分泌系统亚型的积累可能与生态位适应和功能特化有关。VI型分泌系统阳性菌株与耐药性（尤其是碳青霉烯酶产生）之间观察到的非显著正相关趋势，提示细菌间竞争（由VI型分泌系统介导）可能通过诱导DNA损伤或释放胞外DNA等机制，间接促进耐药性的获得或传播。在效应蛋白方面，TseV、脂酶和RhS是跨物种保守的核心效应蛋白家族。TseV作为一种DNA靶向内切核酸酶，与免疫蛋白TsiV形成效应-免疫蛋白对，在细菌间竞争中发挥作用。脂酶和S型绿脓菌素等效应蛋白则缺乏明显的原核免疫蛋白，暗示其可能主要靶向真核细胞，参与宿主-病原体相互作用。西博尼摩根氏菌和中间摩根氏菌拥有更丰富的效应蛋白库和辅助蛋白（如包含DUF4123、DUF2169结构域的伴侣蛋白），这可能赋予了它们在复杂环境中更强的竞争和适应优势。然而，本研究存在一定局限性，包括SecReT6数据库的覆盖度、短读长测序可能导致的组装误差以及不同注释工具间的差异等。未来的研究需要通过湿实验验证这些推定的效应蛋白功能，并阐明不同VI型分泌系统亚型在摩根氏菌致病性和生态适应性中的具体作用。

结论（翻译自论文5. Conclusion）

我们的分析揭示了可能参与细菌间竞争、适应和在某些生态位中占主导地位（抗细菌）的新效应蛋白候选物，也可能参与与宿主的致病过程（抗真核）。这些发现可能为未来的研究铺平道路，并为我们理解摩根氏菌属的致病性提供新的见解。然而，这些结果必须通过湿实验来确认。关键是要描述VI型分泌系统在两个物种中的意义，阐明其作用模式和激活方式，并确定潜在效应蛋白及其相应免疫蛋白的功能和靶点。