同时抑制PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kδ会导致显著的肿瘤抑制效果…… 开放获取（Open Access）

《Cancer Research Communications》：Simultaneous inhibition of PI3Kα, PI3Kβ, and PI3Kδ leads to significant tum... Open Access

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摘要

在I类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）亚型中，主要调节癌症中增殖和存活的亚型会根据遗传背景和起源谱系的不同而有所差异。我们之前报告过，如滑膜肉瘤和尤文肉瘤等转位相关肉瘤（TRS）对广谱I类PI3K抑制剂非常敏感，但主导亚型仍不清楚。为了解决这个问题，我们研究了每种PI3K亚型在TRS细胞中的作用。在包括TRS在内的肉瘤细胞系中，既没有I类PI3K亚型也没有PI3K相关基因表现出共同的突变。选择性抑制PI3Kα可以适度抑制Akt/mTOR信号通路，从而导致生长抑制和细胞凋亡，而单独抑制PI3Kβ或PI3Kδ则没有效果。有趣的是，同时抑制PI3Kα和PI3Kβ和/或PI3Kδ显著增强了细胞凋亡诱导效果，相比之下，单独抑制PI3Kα则没有这种效果。相比之下，癌细胞系在PI3K被抑制后不会发生细胞凋亡，除了PIK3CA突变的细胞系。在这些细胞系中，单独抑制PI3Kα可以显著诱导细胞凋亡，同时抑制其他PI3K亚型并没有增强这种效果。从机制上讲，PI3Kα在TRS细胞中主要介导Akt/mTOR信号通路，而当PI3Kα被抑制时，PI3Kβ和PI3Kδ会补偿Akt/mTOR信号通路。在小鼠异种移植模型中，同时抑制PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kδ比单独抑制任何一种对TRS细胞更有效。这些发现表明，PI3Kα是主导亚型，而PI3Kβ和PI3Kδ与PI3Kα在细胞存活中起协同作用，这似乎是TRS细胞的特征。因此，三重亚型抑制可能是一种有效的TRS治疗方法。

意义：PI3Kα是调节细胞存活的主要亚型，而PI3Kβ和PI3Kδ则补充PI3Kα的功能，这表明联合抑制I类PI3K亚型可能是TRS的一种潜在治疗策略。

引言

肉瘤是一种起源于结缔组织间充质细胞的罕见恶性肿瘤，目前已报告了超过170种不同的组织亚型（1）。据估计，2025年美国新诊断出的肉瘤病例超过17,000例，尽管采用了包括手术、放疗和化疗在内的积极治疗方法，仍有超过7,000人死亡（2）。大约20%的肉瘤被归类为转位相关肉瘤（TRS），这些肉瘤含有由染色体转位产生的致癌融合基因（3）。TRS中的大多数融合基因，如SS18::SSX、EWSR1::FLI1和PAX3::FOXO1，分别导致滑膜肉瘤（SS）、尤文肉瘤和肺泡横纹肌肉瘤（ARMS），它们通过广泛的基因转录调控驱动肿瘤发生（4-7）。然而，这些融合基因产物是分子治疗的挑战性靶点，因为这些蛋白质缺乏适合小分子结合的表面位点（3, 8）。目前尚未找到针对这些TRS的有效治疗靶点，除了融合基因产物之外的其他靶点。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）根据其底物特异性和氨基酸序列相似性被分为I类至III类。I类PI3K是研究最多的类别，进一步分为IA类（包括PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kδ）和IB类（仅包含PI3Kγ）。这些I类PI3K亚型形成一个异二聚体，由催化亚基（p110α、p110β、p110δ和p110γ）和调节亚基（p85、p55和p101）组成（9）。I类PI3K信号通路经常通过激活p110α（由PIK3CA编码）和上游受体酪氨酸激酶（RTK）的基因突变或PTEN的功能丧失在癌细胞中被激活，PTEN是一种与I类PI3K相互作用的磷酸酶，从而促进细胞存活、增殖和迁移（9）。这些发现促使了许多PI3K抑制剂的开发；然而，初步临床试验测试广谱PI3K抑制剂用于实体瘤的结果令人失望（10）。随后，开发了几种针对特定I类PI3K亚型的抑制剂，其中PI3Kα特异性抑制剂alpelisib获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，用于PIK3CA突变的HR+HER2?乳腺癌患者。针对前列腺癌和具有PTEN功能丧失突变的脑肿瘤，开发了如TGX-221这样的PI3Kβ特异性抑制剂，尽管目前还没有任何PI3Kβ特异性抑制剂在美国获得批准用于癌症患者。由于PI3Kδ主要在血细胞中表达，并在多个过程中起关键作用，特别是在B细胞抗原受体（BCR）的下游信号通路中，因此开发了几种PI3Kδ抑制剂，其中一些抑制剂（包括idelalisib）已被批准用于B细胞恶性肿瘤，如慢性淋巴细胞白血病（CLL）、小淋巴细胞淋巴瘤（SLL）和滤泡性淋巴瘤（FL；参考文献11）。因此，PIK3CA突变的癌症、PTEN缺陷的癌症和B细胞恶性肿瘤依赖于PI3K信号通路，其中PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kδ分别作为主导亚型。这些发现表明，主导的PI3K亚型会根据依赖PI3K信号的癌症的遗传背景和起源谱系而有所不同。尽管PI3K抑制剂对肉瘤患者的临床疗效尚不清楚，但我们之前报告过，我们团队开发的广谱PI3K抑制剂ZSTK474在四个参与Ib期临床试验的肉瘤患者中的三个患者中产生了长期的疾病稳定效果（NCT01280487和NCT01682473；参考文献12, 13）。为了探索对PI3K抑制剂敏感的肉瘤亚型，我们之前建立了一个包含来自不同肉瘤来源的细胞系和患者来源细胞（PDC）的肉瘤面板，并发现广谱PI3K抑制剂对来自TRS（如SS、尤文肉瘤和ARMS）的细胞具有显著的抗肿瘤效果（14, 15）。然而，在肉瘤中，尤其是TRS中起关键作用的I类PI3K亚型仍不清楚。在这项研究中，我们使用特异性抑制剂以及siRNA和CRISPR/Cas9系统进行的基因敲低来研究单个I类PI3K亚型在TRS细胞中的信号传导、增殖和存活中的作用。我们证明了PI3Kα在PI3K信号传导以及TRS细胞的增殖、存活和细胞周期进展中起主要作用。相比之下，PI3Kβ和PI3Kδ的作用较小但显著，可以补偿PI3Kα的作用，并维持TRS细胞在肿瘤增殖和存活中的稳定性。我们的结果证明了通过广谱I类PI3K抑制剂同时抑制三种亚型对TRS的治疗是有效的。

材料与方法

细胞系和细胞培养

本研究中使用的细胞系如先前所述获得（14, 15），并通过短串联重复序列分析进行了验证。对于本研究中使用的所有TRS细胞系，我们使用Integrative Genomics Viewer检查RNA测序（RNA-seq）数据，确认了预期的融合转录本的存在，证明测序读段在融合基因的正确外显子边界处被分割。在用于小鼠之前，所有用于动物模型的细胞系都由中央实验医学和生命科学研究所进行了支原体检测，未检测到支原体污染。其余细胞系未进行支原体污染检测。所有细胞系均在含有5%（v/v）胎牛血清和1 μg/mL卡那霉素的RPMI-1640培养基中，在含5% CO2的湿润空气中于37°C下培养。

药物

用于体外实验的alpelisib、TGX-221和idelalisib购自Selleck Chemicals。用于体内实验的alpelisib、AZD6482和idelalisib购自MedChemExpress。ZSTK474由Ohara Pharmaceutical, Co., Ltd.提供。这些化合物在DMSO（Sigma-Aldrich）中溶解用于体外实验。

RNA-seq

使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）从每个细胞系中提取总RNA。经过2100 bioanalyzer（Agilent Technologies）的质量控制步骤后，根据制造商的说明使用TruSeq Stranded mRNA Prep Kit（Illumina）构建文库，并使用HiSeq2000或HiSeq2500测序仪（Illumina）进行测序。SU-DHL-4细胞（GSM6285348）、SU-DHL-6细胞（GSM6285350，RRID: CVCL_2206）、SS（GSM8378222、GSM8378226、GSM8378227、GSM8378248和GSM8378286）、尤文肉瘤（GSM8332627-GSM8332631）、乳腺癌（GSM8141778-GSM8141782）和弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL；GSM5402206-GSM5402210）的RNA-seq FASTQ文件来自Gene Expression Omnibus（GEO，RRID: SCR_005012）数据库。使用FASTP（版本0.23.4，RRID: SCR_016962）去除低质量碱基和序列适配器。使用STAR（版本2.7.11a，RRID: SCR_004463）将清理后的配对末端读段与参考人类基因组（GRCh38/hg38）对齐。使用SAMtools（版本1.18，RRID: SCR_002105）将得到的SAM文件转换为BAM文件。使用HTseq（版本2.0.4，RRID: SCR_005514）量化基因表达。

全外显子测序

使用DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen）从每个细胞系中提取基因组DNA。根据制造商的说明使用SureSelect XT Human All Exon V7 Kit（Agilent Technologies）制备外显子DNA文库，并使用HiSeq2000或HiSeq2500测序仪进行测序。随后，使用Cutadapt v4.1（RRID: SCR_011841）去除低质量碱基和序列适配器。使用Burrows–Wheeler Aligner（v0.7.17）将清理后的读段与参考人类基因组（GRCh38/hg38）对齐。使用Genomic Analysis Toolkit（GATK v4.3.0.0，RRID: SCR_001876）去除重复读段。使用GATK v.4.3.0.0的HaplotypeCaller调用单核苷酸变异和插入/缺失变异。移除了质量较低的变异（变异深度<10、基因型质量<50和变异等位基因频率<0.1）以及未列入Cancer Somatic Mutation Catalogue中的变异。

免疫印迹

免疫印迹按照先前描述的方法（16）使用补充表S1中列出的的一抗进行。简而言之，细胞先用PBS洗涤，然后用含有50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）裂解，该缓冲液还含有50 mmol/L NaCl、50 mmol/L NaF、30 mmol/L sodium pyrophosphate、50 mmol/L Na3VO4、5 mmol/L EDTA、100 KIU/mL aprotinin、1 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride、0.5% Nonidet P-40和0.1% sodium dodecyl sulfate。异种移植肿瘤在Precellys 24（Bertin Technologies）裂解缓冲液中均质化。然后，每条泳道加入10 μg的裂解液，通过SDS-PAGE分离，并转移到硝酸纤维素膜上。用Intercept Blocking Buffer（LI-COR）封闭后，膜在4°C下过夜与一抗孵育，随后在室温下与标记有Alexa Fluor 680或Alexa Fluor 800的二抗孵育1小时。使用Odyssey Infrared Imaging System（LI-COR）检测信号。

细胞生长测定

使用sulforhodamine B（SRB）测定评估药物疗效，通过测量药物处理后的总细胞蛋白变化。简而言之，细胞接种在96孔板中，并用指定的药物培养48小时。然后向每个孔中加入50 μL 50%（w/v）的三氯乙酸，培养板在4°C下孵育1小时。用清水冲洗五次，然后向每个孔中加入50 μL 0.4%（w/v）的SRB钠盐溶液（溶解在1%（v/v）的乙酸中）。在室温下孵育10分钟后，用1%（v/v）的乙酸冲洗五次，然后在室温下完全风干。每个孔中的干燥SRB用150 μL 10 mmol/L Tris缓冲液溶解，使用微孔板读取器（Benchmark Plus，Bio-Rad Laboratories）测量525 nm处的吸光度。计算出使净蛋白增加减少50%所需的药物浓度[50%生长抑制（GI50）]。

siRNA转染

从Thermo Fisher Scientific购买针对PIK3CA（s10520和s10521）、PIK3CB（s10524和s10525）和PIK3CD（s10529和s10530）的特异性siRNA以及阴性对照siRNA（4390843）。细胞接种在六孔板中，并使用RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）按照制造商的说明转染44 nmol/L的siRNA。转染后的细胞培养72小时，然后用裂解缓冲液裂解用于免疫印迹。在siRNA和药物的联合实验中，细胞先转染每种siRNA，24小时后，细胞再与指定的药物共同培养48小时，然后用裂解缓冲液裂解用于免疫印迹。

荧光时间延迟成像

为了评估PI3K抑制剂对细胞增殖和细胞死亡的影响，进行了荧光时间延迟成像。细胞接种在96孔或384孔黑色板（Revvity）中，分别加入500 nmol/L的SiR-DNA（Cytoskeleton, Inc.）和30 nmol/L的SYTOX Green（Thermo Fisher Scientific）。细胞接种24小时后，向每个孔中加入指定的药物，然后使用活细胞高通量成像系统（Operetta CLS，Revvity）以×10的放大倍数每小时获取一次荧光图像。定量图像分析是使用专用软件（Harmony 4.9，Revvity）进行的。为了分割细胞核，将“Find Nuclei”构建块应用于SiR-DNA通道，并使用“Calculate Morphology Properties”构建块计算基本的形态学属性（即面积、圆度、宽度和长度）。然后应用“Select Population”构建块根据计算出的形态学属性去除边缘对象和错误分割的对象。为了检测凋亡细胞，计算了选定的细胞核区域中SiR-DNA荧光强度的方差系数（CV），即碎片化指数。为了检测死亡细胞，使用“Find Nuclei”构建块在SYTOX Green通道中检测和计数SYTOX Green阳性的细胞。使用Annexin V–FITC/碘化丙啶染色来检测凋亡。

为了测量PI3K抑制剂处理后凋亡的诱导情况，按照制造商的说明进行了Annexin V-FITC/PI（Miltenyi Biotec）染色。Aska-SS细胞被接种在24孔板中并培养24小时。在用指定药物处理48小时后，用胰蛋白酶分离细胞。用1×结合缓冲液洗涤后，加入Annexin V-FITC并孵育15分钟。加入碘化丙啶（PI）后，使用BD FACSMelody（BD Biosciences）和FlowJo软件（BD Biosciences，RRID: SCR_008520）分析染色细胞。通过流式细胞术进行细胞增殖测定。

为了测量细胞增殖，进行了CellTracer Yellow（Thermo Fisher Scientific）稀释试验。细胞被接种在12孔板中并培养24小时。然后在37°C下用2.5 μmol/L的CellTrace Yellow孵育20分钟，并用指定的药物培养6天。收集的细胞在4°C下用SYTOX AADvanced（Thermo Fisher Scientific）染色15分钟以检测死亡细胞。使用BD FACSMelody和FlowJo软件评估CellTrace Yellow的稀释度。从分析中排除了SYTOX AADvanced阳性的细胞。通过流式细胞术进行细胞周期分析。

细胞周期分析是使用Vybrant DyeCycle Violet（Thermo Fisher Scientific）进行的。细胞被接种在12孔板中并培养24小时。然后用指定的药物培养48小时。细胞分离并收集后，加入1 mL含有1 μL Vybrant DyeCycle Violet和SYTOX AADvanced的完全培养基，在37°C下孵育30分钟。使用BD FACSmelody和FlowJo软件分析染色细胞。从分析中排除了SYTOX AADvanced阳性的细胞。进行磷酸蛋白质组学分析。

为了探索由PI3Kβ/δ调控的通路，进行了磷酸蛋白质组学分析。细胞被接种在六孔板中并培养24小时。向每个孔中加入1 μmol/L的Alpelisib或ZSTK474，然后孵育1小时。用含有12 mmol/L脱氧胆酸钠、12 mmol/L月桂酰肌氨酸钠、50 mmol/L Tris-Cl、10 mmol/L三（2-羧乙基）膦（TCEP）和磷酸酶抑制剂的Phase Transfer Surfactant缓冲液洗涤细胞。在100°C下用10 mmol/L TCEP还原10分钟后，在室温下用25 mmol/L碘乙酰胺烷基化45分钟，然后在S-Trap柱（ProtiFi）上用Trypsin/Lys-C Mix（Promega）在47°C下消化蛋白质样品2小时。随后，根据制造商的说明使用High-Select TiO2 Phosphopeptide Enrichment Kit（Thermo Fisher Scientific）纯化磷酸肽。将得到的肽从凝胶片段中提取出来，并使用Orbitrap Fusion Lumos质谱仪（Thermo Fisher Scientific）结合UltiMate 3000 RSLC nano-flow HPLC（Thermo Fisher Scientific）进行分析。肽用μ-Precolumn（0.3 mm内径 × 5 mm，Thermo Fisher Scientific）富集，并在AURORA柱（0.075 mm内径 × 250 mm，1.6 μm，Ion Opticks Pty Ltd.）上使用两步梯度分离：2%至40%的乙腈110分钟，然后在0.1%甲酸存在下40%至95%的乙腈5分钟。FAIMS Pro（Thermo Fisher Scientific）的气相分离补偿电压设置为?80、?60和?40 V。Orbitrap Fusion Lumos的分析参数如下：全扫描分辨率50,000；扫描范围（m/z）350至1,500；全扫描的最大注射时间50毫秒；全扫描的AGC目标4 × 10^5；数据依赖的MS/MS采集的循环时间2秒；MS/MS的激活类型HCD；MS/MS的检测器离子阱；MS/MS的最大注射时间35毫秒；MS/MS的AGC目标1 × 10^4。MS/MS谱在SwissProt中的Homo sapiens蛋白质序列数据库中使用Proteome Discoverer 3.1软件（Thermo Fisher Scientific，RRID: SCR_014477）进行搜索，其中肽识别过滤器的设置为“假发现率<1%”。使用Proteome Discoverer 3.1软件中的Minora Feature Detector、Feature Mapper和Precursor Ions Quantifier节点的默认参数进行蛋白质的无标记相对定量分析。使用Metascape（RRID: SCR_016620）进行基因本体（GO）分析，以识别ZSTK474比alpelisib更富集的通路。丰度变化超过两倍的磷酸肽接受了GO分析。为了识别在ZSTK474处理后活性变化更大的激酶，进行了KSEA（https://casecpb.shinyapps.io/ksea/）。

为了生成PIK3CB-或PIK3CD敲除细胞，首先使用慢病毒载体（lentiCas9-Blast，Addgene）在细胞中稳定表达Cas9。从Integrated DNA Technologies购买了针对PIK3CB的CRISPR RNA（crRNA）（5′-GUGAUUGUGGGAAAAUCUCUguuuuagcuaugcu-3′）和转激活CRISPR RNA（tracrRNA；5′-AAACAUAGCAGAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAGUGGCACCGAUGGUCGGU-3′）。通过将单个crRNA与tracrRNA以1:1摩尔比混合，然后在95°C下加热5分钟并在室温下退火5到10分钟来制备crRNA:tracrRNA双链。从VectorBuilder, Inc.购买了PIK3CD的gRNA载体。PIK3CD的目标序列是5′-TCTTCACGCGGTCGCCTCA-3′或5′-AGA GCGGCTCATACTGGGCG-3′。表达Cas9的细胞被接种在六孔板中，并根据制造商的说明使用Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific）转染22 nmol/L的crRNA:tracrRNA或1.3 μg/mL的gRNA载体。使用有限稀释法获得转染细胞的单克隆并扩增。通过免疫印迹测量蛋白质表达并使用Sanger测序分析gRNAs靶向的基因组DNA区域的序列来验证PIK3CB和/或PIK3CD的敲除。小鼠异种移植模型。

Aska-SS或SYO-1（RRID: CVCL_7146）细胞被皮下注射到雌性BALB/c裸鼠的背部。当肿瘤体积达到100至300 mm3时，小鼠被随机分为对照组、alpelisib组、idelalisib组或联合治疗组。化合物溶解在溶剂[10% DMSO + 30% PEG400（FUJIFILM Wako Pure Chemicals）+ 1% Tween-80（Sigma-Aldrich）+ 59%水中。alpelisib（10或20 mg/kg）和idelalisib（30 mg/kg）通过口服给药，而AZD6482（20 mg/kg）通过腹腔注射给药。对于所有药物，在SYO-1异种移植模型中每天给药一次，共15天，在Aska-SS模型中给药21天，但在给药第一天后的第5、6、12、13、19和20天不给药。通过使用卡尺测量皮下肿瘤的质量（L）和宽度（W）来每周两次监测肿瘤体积（TV），公式为：TV = (L × W2)/2。对于免疫印迹，在SYO-1异种移植模型的第15天或Aska-SS异种移植模型的第21天给药后4小时从小鼠身上切除肿瘤样本。实验方案得到了日本癌症研究基金会机构动物实验委员会的批准。统计分析使用Excel（Microsoft）和EZR软件进行，采用单因素重复测量ANOVA和Bonferroni事后检验、单因素ANOVA和Dunnett事后检验或Kruskal–Wallis检验和Steel事后检验。P < 0.05被认为是统计学上显著的。

我们首先通过全外显子测序研究了包括23个细胞系（其中11个TRS细胞系[六个SS细胞系，两个Ewing肉瘤细胞系，一个ARMS细胞系和两个肺泡软组织肉瘤（ASPS）细胞系]的肉瘤细胞系中I类PI3K亚型（PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD和PIK3CG）、PTEN、KRAS和RTKs的突变状态。我们发现了两个报道的功能获得（GOF）热点突变，包括Yamato-SS中的PIK3CA H1047R和SW684中的PIK3CD E1021K；然而，这些GOF突变在TRS和非TRS细胞中似乎都不常见。相比之下，我们在23个细胞系中的4个（A-673 TRS细胞和GCT、SW872和SW982非TRS细胞）中发现了BRAF V600E突变，在SW1353细胞中发现了KRAS G12C突变，在HT-1080和RD细胞中发现了NRAS Q61K和Q61H突变（所有来自非TRS），这表明RAS/RAF通路的激活在肉瘤细胞中更为常见（表1；补充表S2）。我们进一步使用cBioPortal数据库研究了SS、Ewing肉瘤、ARMS和乳腺癌临床样本中这些基因的改变。我们发现PIK3CA和ERBB2的突变或扩增分别存在于大约40%和11%的乳腺癌中，而在TRS中，所有检查的PI3K亚型和PI3K相关基因的改变频率低于5%（补充图S1）。表1. 肉瘤细胞系中的融合基因和PI3K相关基因的突变。亚型

接下来，我们分别通过RNA-seq和免疫印迹研究了肉瘤细胞系中I类PI3K亚型、PTEN和RTKs的mRNA和蛋白质表达。先前的研究表明PI3Kα和PI3Kβ在所有肉瘤细胞系中普遍表达，而PI3Kδ和PI3Kγ在白细胞中选择性表达（9）。因此，我们使用MKN1胃癌细胞系（19）和SU-DHL-4和SU-DHL-6 DLBCL细胞系（20）作为PI3Kα/β和PI3Kδ/γ的阳性对照。在检查的细胞系中，每个I类PI3K亚型和PTEN的mRNA和蛋白质水平高度相关，较高的mRNA水平对应较高的蛋白质水平（补充图S2）。虽然在所有检查的肉瘤细胞系中包括TRS细胞中都检测到PI3Kα（p110α）和PI3Kβ（p110β）的表达，并且其水平与MKN1细胞相当，但PI3Kδ（p110δ）在大多数细胞系中的表达水平略低于淋巴瘤细胞系。相反，PI3Kγ（p110γ）在所有肉瘤细胞系中几乎检测不到（图1A和B）。关于PTEN，大多数肉瘤细胞系包括TRS细胞显示出显著的PTEN蛋白质表达；然而，GCT、SW872、MES-SA和SK-UT-1不表达这种蛋白质（图1B）。关于RTKs，EGFR、ERBB2、IGFR和IGF1R在所有检查的肉瘤细胞系中都有广泛的mRNA表达，而ERBB3、ERBB4、KIT和VEGFR在特定的肉瘤细胞系中表达，例如ERBB3在SJCRH30和RD细胞中；ERBB4在A-673细胞中；KIT在Yamato-SS、Saos-2和RD-ES细胞中；VEGFR在ASPS-1细胞中。特别是PDGFRA在SS亚型中表现出特异性表达，并且在所有六个SS细胞系中都表达（补充图S3A）。为了检查临床样本中是否观察到类似的表达模式，我们使用GEO数据库中的RNA-seq数据分析了SS、Ewing肉瘤、乳腺癌和DLBCL的这些基因的表达。与细胞系数据一致，PIK3CA和PIK3CB在SS和Ewing肉瘤中的表达水平与在乳腺癌中的表达水平相当。在SS和Ewing肉瘤中可以检测到PIK3CD的表达，尽管其水平低于DLBCL。在Ewing肉瘤中观察到PIK3CG的表达，但在SS中几乎检测不到。在RTKs中，EGFR和PDGFRA在SS中倾向于表现出较高的表达，ERBB4和KIT在Ewing肉瘤中，ERBB2和ERBB3在乳腺癌中（补充图S3B）。图1. 在I类PI3K亚型中，PI3Kα在TRS中是主导亚型。A. 通过RNA-seq确定了所指示的肉瘤细胞系、胃癌细胞系和弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系中PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG和PTEN的表达情况。B. 免疫印迹显示了所指示细胞系中p110α、p110β、p110δ和PTEN的表达情况，使用 Tubulin 作为加载对照。C. 在所指示的TRS细胞系中，展示了alpelisib、TGX-221、idelalisib和ZSTK474的浓度-反应曲线。D. 点图显示了alpelisib、TGX-221、idelalisib和ZSTK474在TRS细胞系中的GI50值差异，GI50值是根据C部分和补充图S5中的生长曲线计算得出的。统计分析采用单因素重复测量ANOVA，并进行了Bonferroni事后检验。*，P < 0.05。E. 在用alpelisib、TGX-221和idelalisib处理48小时的Aska-SS和SYO-1细胞中，显示了相应蛋白质的免疫印迹，使用Tubulin作为加载对照。F. 在转染了针对PIK3CA、PIK3CB和PIK3CD的siRNAs的Aska-SS细胞中，显示了相应蛋白质的免疫印迹，使用Tubulin作为加载对照。

图1. 在I类PI3K亚型中，PI3Kα是TRS中的主要亚型。A. 通过RNA-seq确定了所指示的肉瘤细胞系、胃癌细胞系和弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系中PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG和PTEN的表达情况。B. 免疫印迹显示了所指示细胞系中p110α、p110β、p110δ和PTEN的表达情况，使用Tubulin作为加载对照。C. 在所指示的TRS细胞系中，展示了alpelisib、TGX-221、idelalisib和ZSTK474的浓度-反应曲线。D. 点图显示了alpelisib、TGX-221、idelalisib和ZSTK474在TRS细胞系中的GI50值差异，GI50值是根据C部分和补充图S5中的生长曲线计算得出的。统计分析采用单因素重复测量ANOVA，并进行了Bonferroni事后检验。*，P < 0.05。E. 在用alpelisib、TGX-221和idelalisib处理48小时的Aska-SS和SYO-1细胞中，显示了相应蛋白质的免疫印迹，使用Tubulin作为加载对照。F. 在转染了针对PIK3CA、PIK3CB和PIK3CD的siRNAs的Aska-SS细胞中，显示了相应蛋白质的免疫印迹，使用Tubulin作为加载对照。

抑制PI3Kα（而非PI3Kβ或PI3Kδ）会损害TRS细胞中的PI3K信号传导、存活和生长。

接下来，我们研究了在TRS细胞系中常见的三种I类PI3K亚型（PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kδ）的作用。为此，我们使用了针对PI3Kα的alpelisib、针对PI3Kβ的TGX-221和针对PI3Kδ的idelalisib，以及广谱I类PI3K抑制剂ZSTK474。根据我们团队和其他人的已发表数据，这些抑制剂在生化水平上对各自的靶标亚型表现出特异性且相当的激酶抑制活性（补充图S4A；参考文献21-24）。由于PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kδ分别是PI3KCA突变癌症、PTEN缺陷癌症和B细胞淋巴瘤中PI3K信号传导和细胞生长的主要亚型（25-30），我们使用了具有PIK3CA热点突变（E545K；参考文献19）的MKN1胃癌细胞、具有PTEN缺失的PC-3前列腺癌细胞（19）和SU-DHL-4 B细胞淋巴瘤细胞（20）作为阳性对照，以确认每种亚型选择性抑制剂是否在细胞水平上选择性地靶向其对应的亚型和癌细胞类型。正如预期的那样，在这些亚型选择性抑制剂中，alpelisib最有效地降低了MKN-1细胞中包括Akt和S6在内的PI3K信号分子的磷酸化，而TGX-221和idelalisib在PC-3和SU-DHL-4细胞中最为有效，其有效浓度约为1 μmol/L，这三种抑制剂之间的浓度相似（补充图S4B）。除了抑制PI3K信号传导外，alpelisib、TGX-221和idelalisib在MKN1、PC-3和SU-DHL-4细胞中也表现出最强的抗增殖效应（补充图S4C）。这些结果表明，这些PI3K抑制剂在细胞水平上按预期在相似的浓度范围内选择性地抑制了各自的靶标亚型。然后，我们检查了这些PI3K抑制剂对TRS细胞的影响。在亚型选择性抑制剂中，alpelisib对TRS细胞系（包括SS、Ewing肉瘤和ARMS细胞）的PI3K下游信号传导和细胞生长的抑制作用最强（图1C-E；补充图S5）。使用针对每种I类PI3K亚型的催化亚单位的特异性siRNAs也得到了类似的结果；即，用PIK3CA的特异性siRNAs处理后Akt的磷酸化减少，而用PIK3CB或PIK3CD的siRNAs处理则未能减少这种磷酸化（图1F）。与抑制PI3K信号传导同时，alpelisib或siRNAs对PI3Kα的抑制增加了PARP和caspase-3的切割，表明诱导了细胞凋亡，而PI3Kβ和PI3Kδ的抑制则没有这种效应（图1E和F）。这些结果表明，在I类PI3K亚型中，PI3Kα主要参与TRS细胞中的PI3K信号传导和存活。同时抑制PI3Kα与PI3Kβ和/或PI3Kδ可协同诱导细胞凋亡，并损害TRS细胞的增殖和细胞周期进展。

在图1C-E和补充图S5中比较了亚型选择性抑制剂和广谱I类PI3K抑制剂ZSTK474的抗肿瘤效应，发现ZSTK474的处理产生了显著更强的抗肿瘤效应，包括在SS细胞系Aska-SS和SYO-1中下调PI3K下游信号并诱导与BIM和PUMA上调相关的细胞凋亡（15）。这些数据促使我们研究同时抑制多种I类PI3K亚型是否比单独抑制一种PI3K亚型更能增强TRS细胞中的抗肿瘤效应和细胞凋亡诱导。为此，我们使用时间延迟成像技术监测了用单一或多种亚型选择性抑制剂处理后活细胞和死细胞的时间变化。为此，用低毒性的DNA染料SiR-DNA对细胞核进行染色，而死细胞则通过SYTOX Green染色来识别，后者表明与细胞活力丧失相关的膜通透性。单独使用alpelisib抑制PI3Kα略微减少了Aska-SS、SYO-1和SJCRH30细胞中的活细胞数量并增加了死细胞数量，这与二甲基亚砜（DMSO）的效果相反；而分别使用TGX-221和idelalisib单独抑制PI3Kβ和PI3Kδ则没有这种效果（图2A-D；补充图S6A和S6B）。相比之下，当alpelisib与TGX-221和/或idelalisib联合使用时，活细胞数量显著减少，而死细胞数量显著增加（图2A-D；补充图S6A和S6B）。为了评估细胞凋亡的进展，我们计算了每个细胞核感兴趣区域内的SiR-DNA强度的碎片化指数（CV）。健康的细胞核具有较低的CV，而经历凋亡的碎片化细胞核则具有较高的CV（31）。除了SYTOX阳性细胞数量的增加外，单独使用alpelisib处理显著增加了碎片化指数，而TGX-221或idelalisib单独处理则没有这种效果。然而，TGX-221和/或idelalisib与alpelisib联合使用显著增加了碎片化指数（图2A-D；补充图S6A和S6B）。Annexin V/PI染色也显示，alpelisib处理增加了凋亡细胞的数量，而TGX-221和/或idelalisib与alpelisib联合使用进一步增强了凋亡诱导（图2E和F）。接下来，我们研究了这些亚型选择性抑制剂对携带PIK3CA E545K突变的MKN1细胞的影响。如前所述，alpelisib在MKN1细胞上的抗肿瘤效应与ZSTK474相当（补充图S4B和S4C）。此外，时间延迟成像清楚地显示，单独使用alpelisib具有强烈的抗癌效果，但TGX-221和/或idelalisib与alpelisib联合使用并未增强alpelisib的效果（补充图S6C和S6D）。

同时抑制PI3Kα与PI3Kβ和/或PI3Kδ在TRS细胞中产生了协同的抗肿瘤效应和细胞凋亡诱导。A-D，在用SiR-DNA和SYTOX Green染色后，分别用alpelisib、TGX-221和idelalisib单独或联合处理48小时的Aska-SS（A和B）和SYO-1（C和D）细胞中进行荧光时间延迟成像分析。对于Aska-SS细胞，药物添加浓度为1 μmol/L；对于SYO-1细胞，添加浓度为8 μmol/L。展示了48小时时Aska-SS（A）和SYO-1细胞（C）的代表性图像。通过定量图像分析计算了活细胞生长率（左上）、碎片化指数（右上）以及Aska-SS（B）和SYO-1细胞（D）中死细胞占总细胞的比例（下）。数据以平均值±标准差（n = 5）表示。E，在用alpelisib、TGX-221和idelalisib单独或联合处理48小时后，用Annexin V–FITC/PI染色的Aska-SS细胞的代表性流式细胞术图。F，总结了E中Annexin V–FITC阳性细胞的比例（%）。数据以平均值±标准差（n = 3）表示。统计分析采用单因素ANOVA，并进行了Dunnett事后检验。n.s.，不显著；*，P < 0.05；**，P < 0.01。

接下来，我们研究了亚型选择性PI3K抑制剂单独或联合使用对TRS细胞增殖和细胞周期进展的影响。为了评估细胞增殖，我们使用了一种荧光染料来追踪细胞的增殖情况。通过染料稀释来测量增殖，每次分裂后荧光信号减半。将染色的细胞与或不与亚型选择性抑制剂一起孵育6天，然后通过流式细胞术测量细胞内的剩余荧光强度。在Aska-SS、SYO-1和SJCRH30细胞中，与载体对照、单独使用TGX-221或idelalisib相比，使用alpelisib处理后，具有更高荧光强度的细胞显著积累（图3A和B；补充图S7A和S7B）。这表明PI3Kα主要参与TRS细胞的增殖。正如预期的那样，TGX-221和/或idelalisib与alpelisib联合使用后的荧光强度显著高于单独使用alpelisib（图3A和B；补充图S7A和S7B）。相反，仅用alpelisib处理的MKN1细胞表现出更高的荧光强度，而单独使用TGX-221和idelalisib则没有这种效果（补充图S7A和S7B）。除了抑制增殖外，使用alpelisib还显著增加了Aska-SS、SYO-1、SJCRH30和MKN1细胞中的G1期积累，而单独使用TGX-221或idelalisib对TRS细胞中的G1期积累影响不大（图3C和D；补充图S7C和S7D）。此外，TGX-221和/或idelalisib与alpelisib联合使用增加了TRS细胞中的G1期细胞群体，而在MKN1细胞中则没有这种效果（图3C和D；补充图S7C和S7D）。这些结果表明，在TRS细胞（包括Aska-SS、SYO-1和SJCRH30细胞）中，PI3Kα在促进细胞增殖、细胞周期进展和细胞存活方面起主要作用，而当PI3Kα不可用时，PI3Kβ和PI3Kδ可以补偿这些功能。图3。查看大图下载幻灯片。

同时抑制PI3Kα与PI3Kβ和/或PI3Kδ会损害TRS细胞的增殖和细胞周期进展。A，代表性的流式细胞术直方图显示了用CellTracer Yellow染色后的Aska-SS或SYO-1细胞在单独使用alpelisib、TGX-221和idelalisib或联合使用这些药物后的增殖情况。对于Aska-SS细胞，药物添加浓度为4 μmol/L；对于SYO-1细胞，药物添加浓度为8 μmol/L。通过培养6天后使用CellTracer Yellow稀释液来检测增殖情况，无论是否添加了药物。B，总结了A中所示的细胞增殖测定中CellTracer Yellow的中位荧光强度（MFI）。数据以平均值±标准差（n = 4）表示。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）并进行了Dunnett事后检验。***，P < 0.001。C，代表性的流式细胞术直方图显示了用alpelisib、TGX-221和idelalisib单独使用或联合使用48小时后Aska-SS（上）和SYO-1细胞（下）的细胞周期分布（G1、S和G2/M）。对于Aska-SS细胞，药物添加浓度为4 μmol/L；对于SYO-1细胞，药物添加浓度为8 μmol/L。D，总结了C中所示的细胞周期分布（G1、S和G2/M）。数据以平均值±标准差（n = 4）表示。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）并进行了Dunnett事后检验。n.s，无显著性；**，P < 0.01；***，P < 0.001。图3。查看大图下载幻灯片。

同时抑制PI3Kα与PI3Kβ和/或PI3Kδ会损害TRS细胞的增殖和细胞周期进展。A，代表性的流式细胞术直方图显示了用CellTracer Yellow染色后的Aska-SS或SYO-1细胞在单独使用alpelisib、TGX-221和idelalisib或联合使用这些药物后的增殖情况。对于Aska-SS细胞，药物添加浓度为4 μmol/L；对于SYO-1细胞，药物添加浓度为8 μmol/L。通过培养6天后使用CellTracer Yellow稀释液来检测增殖情况，无论是否添加了药物。B，总结了A中所示的细胞增殖测定中CellTracer Yellow的中位荧光强度（MFI）。数据以平均值±标准差（n = 4）表示。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）并进行了Dunnett事后检验。***，P < 0.001。C，代表性的流式细胞术直方图显示了用alpelisib、TGX-221和idelalisib单独使用或联合使用48小时后Aska-SS（上）和SYO-1细胞（下）的细胞周期分布（G1、S和G2/M）。对于Aska-SS细胞，药物添加浓度为4 μmol/L；对于SYO-1细胞，药物添加浓度为8 μmol/L。D，总结了C中所示的细胞周期分布（G1、S和G2/M）。数据以平均值±标准差（n = 4）表示。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）并进行了Dunnett事后检验。n.s，无显著性；**，P < 0.01；***，P < 0.001。关闭模态。

同时抑制PI3Kα与PI3Kβ和/或PI3Kδ可以增强对多种非肉瘤癌细胞的生长抑制作用，但不会诱导细胞凋亡。

接下来，我们测试了IA类PI3K亚型在TRS细胞的增殖和存活中的协同作用是否在不同类型的癌细胞中都存在。为此，我们使用了JFCR39细胞系面板（19），该面板包含来自九种不同组织的39个癌细胞系。这些细胞系被分为三组：PIK3CA突变型（PTEN野生型和KRAS野生型，四个细胞系）、PTEN缺陷型（PIK3CA野生型和KRAS野生型，五个细胞系）以及其他类型（22个细胞系；图4A）。有八个细胞系未进行测试。通过时间延迟成像测量了单独或联合使用一种或多种亚型特异性抑制剂处理后的活细胞和死细胞的百分比。单独使用alpelisib处理时，与PTEN缺陷型和其他细胞系相比，alpelisib显著抑制了PIK3CA突变型细胞的生长。TGX-221和idelalisib在大多数测试的细胞系中仅显示出较弱的效果，尽管在PTEN缺陷型细胞系中比其他组稍有效（图4B；补充图S8A）。在单独使用一种药物与联合使用多种药物的处理比较中，如MKN1这样的PIK3CA突变型细胞对alpelisib非常敏感，而联合使用多种PI3K亚型抑制剂或泛PI3K抑制剂ZSTK474则没有增强效果。在PTEN缺陷型细胞系中，尽管所有亚型特异性抑制剂单独使用时仅显示出中等效果，但TGX-221和/或idelalisib与alpelisib的联合使用显著增强了单独使用的效果。在其他非肉瘤细胞系中，虽然alpelisib在单独使用的亚型特异性抑制剂中显示出最高的效力，但联合使用alpelisib和ZSTK474的效力甚至更高（图4C；补充图S8B）。同样，TRS细胞也对alpelisib表现出高度敏感性，并且当同时抑制PI3Kα与PI3Kβ和/或PI3Kδ时观察到了增强的效果（图4D）。这些结果表明，在PIK3CA突变型细胞中，主要是PI3Kα起作用，而在其他非肉瘤癌细胞（包括PTEN缺陷型细胞）中，PI3Kα与PI3Kβ和/或PI3Kδ协同调节细胞增殖，类似于TRS细胞。图4。查看大图下载幻灯片。

同时抑制PI3Kα与PI3Kβ和/或PI3Kδ可以增强对多种非肉瘤癌细胞的生长抑制作用，但不会诱导细胞凋亡。A，本研究中使用的细胞系列表及其PIK3CA、PTEN和KRAS的突变状态。红色显示的细胞系被归类为PIK3CA突变型组（PTEN野生型和KRAS野生型），蓝色显示的细胞系被归类为PTEN缺陷型组（PIK3CA野生型和KRAS野生型）。B，箱形图显示了用指定药物在8 μmol/L浓度下处理48小时后的非肉瘤细胞的生长率（%），比较了PIK3CA突变型、PTEN缺陷型和其他细胞系。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）并进行了Dunnett事后检验。n.s，无显著性；***，P < 0.001。C和D，箱形图显示了在48小时后的非肉瘤细胞（C）和TRS细胞（D）的生长率（%），比较了指定的药物处理效果。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）并进行了Dunnett事后检验。n.s，无显著性；*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001。E和F，点图显示了在48小时后的非肉瘤细胞（E）和TRS细胞（F）的SYTOX阳性率（%），比较了指定的药物处理效果。图4。查看大图下载幻灯片。

关于细胞存活，除了MKN1之外，很少有测试的癌细胞系显示出超过20%的SYTOX阳性细胞死亡（图4E；补充图S8C）。MKN1细胞在抑制PI3Kα后表现出细胞死亡，但同时抑制多种PI3K亚型时没有观察到增强效果。相比之下，在TRS细胞中，抑制PI3Kα仅引起轻微的细胞死亡，但当同时抑制PI3Kα与PI3Kβ和/或PI3Kδ时，效果显著增强（图4F）。这些结果表明，PI3K信号通路仅在TRS细胞和一些PIK3CA突变型细胞中调节细胞存活。鉴于PI3Kα是PIK3CA突变型细胞中的主要亚型，因此特别是在TRS细胞中观察到了IA类PI3K亚型之间的协同调节作用。磷酸组学分析显示，与alpelisib相比，ZSTK474对PI3K下游的Akt/mTOR信号通路的抑制作用更强。

为了无偏地研究同时抑制PI3Kα与PI3Kβ和/或PI3Kδ对细胞生长抑制和细胞凋亡诱导的协同机制，我们对用1 μmol/L alpelisib、1 μmol/L ZSTK474或溶剂对照处理1小时的Aska-SS细胞进行了全局磷酸组学分析。在三个样本中，共鉴定出15,593个来自4,246种独特蛋白质的磷酸肽。在用alpelisib或ZSTK474处理后，分别有1,874个和1,922个磷酸肽的丰度增加了2倍以上，而767个和1,727个磷酸肽的丰度减少了2倍以上（图5A）。通路富集分析显示，alpelisib处理影响了mTOR和IGF1R通路，而ZSTK474处理影响了mTOR、MET和PIP3通路（图5B）。相应地，激酶-底物富集分析（KSEA）显示，alpelisib或ZSTK474处理减少了AKT1和mTOR底物的磷酸化（图5A和C）。为了探讨ZSTK474处理与alpelisib相比对哪些通路的影响更大，我们确定了934个在ZSTK474处理下变化超过2倍的磷酸肽，而在3,649个在ZSTK474处理下变化超过2倍的磷酸肽中（图5D）。通路富集分析显示，ZSTK474对mTOR通路的影响大于alpelisib（图5E）。这一发现得到了KSEA的支持，KSEA显示ZSTK474比alpelisib更强烈地减少了mTOR和Akt1底物的磷酸化（图5D和F）。一致地，免疫印迹显示，alpelisib处理减少了Akt（T308和S473）、PRAS40（T246和T183）、S6（S235/236）和4EBP1（T37/46）的磷酸化，而ZSTK474处理导致这些PI3K/mTOR下游分子的磷酸化进一步减少（图5G）。这些结果表明，泛PI3K抑制剂ZSTK474比PI3Kα特异性抑制剂alpelisib更强烈地抑制Akt/mTOR信号通路，可能是因为alpelisib允许残留的PI3Kβ和PI3Kδ活性，而ZSTK474完全抑制了PI3K活性。图5。查看大图下载幻灯片。

磷酸组学分析显示，泛PI3K抑制剂ZSTK474比PI3Kα特异性抑制剂alpelisib更强烈地抑制Akt/mTOR信号通路。A，DMSO处理的Aska-SS细胞与alpelisib处理的Aska-SS细胞（上）或DMSO处理的Aska-SS细胞与ZSTK474处理的Aska-SS细胞（下）的磷酸肽MA图。药物添加浓度为1 μmol/L，处理时间为1小时。虚线表示变化两倍的边界。Akt/mTOR信号通路中的磷酸肽用红色突出显示。其中，代表性的Akt/mTOR信号通路中的磷酸肽被标出。B，GO分析显示了在DMSO处理与alpelisib处理（上）或DMSO处理与ZSTK474处理（下）之间丰度变化超过两倍的磷酸蛋白。C，KSEA显示了在DMSO处理的Aska-SS细胞与alpelisib处理的Aska-SS细胞（上）或DMSO处理的Aska-SS细胞与ZSTK474处理的Aska-SS细胞（下）中激活或失活的激酶。正的激酶Z分数表示在alpelisib或ZSTK474处理的Aska-SS细胞中激酶被激活，而负的激酶Z分数表示在alpelisib或ZSTK474处理的Aska-SS细胞中激酶被失活。P值使用KSEA算法计算。*，P < 0.05。D，DMSO处理与ZSTK474处理之间信号变化超过两倍的磷酸肽的MA图，在alpelisib处理的Aska-SS细胞与ZSTK474处理的Aska-SS细胞中。虚线表示变化两倍的边界。Akt/mTOR信号通路中的磷酸肽用红色突出显示。其中，代表性的Akt/mTOR信号通路中的磷酸肽被标出。E，GO分析显示了在alpelisib处理与ZSTK474处理之间丰度变化超过两倍的磷酸蛋白。F，KSEA显示了在alpelisib处理的Aska-SS细胞与ZSTK474处理的Aska-SS细胞中激活或失活的激酶。P值使用KSEA算法计算。*，P < 0.05。G，用1 μmol/L alpelisib或ZSTK474处理1小时的Aska-SS细胞中指定蛋白质的免疫印迹。图5中使用了微管蛋白作为加载对照。放大查看下载幻灯片。磷酸蛋白质组学分析显示，ZSTK474作为一种泛PI3K抑制剂，其抑制Akt/mTOR信号传导的效果比PI3Kα特异性抑制剂alpelisib更显著。A项显示了DMSO处理的Aska-SS细胞与alpelisib处理的Aska-SS细胞（上图）或DMSO处理的Aska-SS细胞与ZSTK474处理的Aska-SS细胞（下图）中磷酸肽的MA图。药物以1 μmol/L的浓度添加1小时。虚线表示变化两倍的边界。Akt/mTOR信号传导中的磷酸肽用红色图表突出显示，其中标出了代表性的磷酸肽。B项是对DMSO处理与alpelisib处理之间（上图）或DMSO处理与ZSTK474处理之间（下图）磷酸蛋白丰度变化超过两倍的GO分析结果。C项通过KSEA方法显示了DMSO处理的Aska-SS细胞与alpelisib处理的Aska-SS细胞（上图）或DMSO处理的Aska-SS细胞与ZSTK474处理的Aska-SS细胞（下图）中激活或失活的激酶。正的激酶Z分数表明在alpelisib或ZSTK474处理的Aska-SS细胞中该激酶被激活，而负的激酶Z分数则表明该激酶被失活。P值使用KSEA算法计算得出，*表示P < 0.05。D项显示了alpelisib处理的Aska-SS细胞与ZSTK474处理的Aska-SS细胞之间磷酸肽信号变化超过两倍的MA图，虚线表示变化两倍的边界，Akt/mTOR信号传导中的磷酸肽用红色图表突出显示，其中标出了代表性的磷酸肽。E项是对DMSO处理与ZSTK474处理之间磷酸蛋白丰度变化超过两倍的磷酸蛋白进行的GO分析。F项通过KSEA方法显示了alpelisib处理的Aska-SS细胞与ZSTK474处理的Aska-SS细胞中激活或失活的激酶。P值使用KSEA算法计算得出，*表示P < 0.05。G项显示了在1 μmol/L浓度下alpelisib或ZSTK474处理1小时后Aska-SS细胞中目标蛋白的免疫印迹实验结果，微管蛋白作为加载对照。

IA类PI3K亚型在TRS细胞中协同调节Akt/mTOR信号传导，从而影响细胞存活和肿瘤生长。

为了验证我们的假设，即ZSTK474同时抑制所有三种IA类PI3K亚型比单独使用alpelisib抑制PI3Kα更能有效抑制Akt/mTOR信号传导，我们通过使用各种抑制剂组合、siRNA以及CRISPR/Cas9基因敲除技术，评估了TRS细胞在同时抑制IA类PI3K亚型后的Akt/mTOR信号传导状态。alpelisib对PI3Kα的 pharmacologic 抑制作用降低了Akt在T308和S473处的磷酸化水平，以及S6在S235/236处的磷酸化水平；而同时抑制PI3Kα（alpelisib）与PI3Kβ（TGX-221）和/或PI3Kδ（idelalisib）进一步降低了这些PI3K/mTOR下游因子的磷酸化水平（图6A）。然而，TGX-221和idelalisib的组合处理略微降低了Akt和S6的磷酸化水平（图6A）。与Akt/mTOR信号传导的下调一致，alpelisib与TGX-221和/或idelalisib联合处理显著诱导了PARP和caspase-3的切割，并在Aska-SS和SYO-1细胞中诱导了BIM或PUMA的表达，表明与单独使用alpelisib相比，凋亡作用增强（图6B）。在其他TRS细胞系（包括RD-Ewing肉瘤和SJCRH30细胞）中也获得了类似的结果（补充图S9）。此外，使用PI3K亚型特异性抑制剂和siRNA的组合处理也得到了相似的结果（图6C）。为了进一步研究PI3Kβ和PI3Kδ在TRS细胞信号传导和细胞存活中的补偿作用，我们使用CRISPR/Cas9系统敲除了SYO-1细胞中的PIK3CB和/或PIK3CD。与仅使用alpelisib相比，缺乏PIK3CB和/或PIK3CD的SYO-1细胞中Akt的磷酸化显著降低，导致凋亡强烈诱导（图6D）。综上所述，在IA类PI3K亚型中，PI3Kα主要传递PI3K信号，从而促进TRS细胞的存活和增殖，而PI3Kβ和PI3Kδ则与PI3Kα起互补作用。因此，需要抑制所有三种亚型才能在这些肉瘤细胞中实现有效的抗肿瘤效果。

图6显示，同时抑制PI3Kα与PI3Kβ和/或PI3Kδ显著抑制Akt/mTOR信号传导。A和B项显示了在1 μmol/L浓度下单独或联合使用alpelisib、TGX-221和idelalisib处理3小时（A）或48小时（B）的Aska-SS和SYO-1细胞中目标蛋白的免疫印迹结果，微管蛋白作为加载对照。C项显示了在转染了针对PIK3CA、PIK3CB或PIK3CD的siRNA后，用1 μmol/L浓度的alpelisib、TGX-221和idelalisib处理48小时的Aska-SS细胞中目标蛋白的免疫印迹结果，微管蛋白作为加载对照。D项显示了在PIK3CB和/或PIK3CD敲除的SYO-1细胞中用1 μmol/L浓度的alpelisib处理48小时后的目标蛋白免疫印迹结果，微管蛋白作为加载对照。

为了在体内模型中验证上述体外发现，我们研究了同时抑制IA类PI3K亚型是否也能在异种移植模型中有效。由于TGX-221不溶于水，因此使用了其水溶性类似物AZD6482作为PI3Kβ特异性抑制剂。由于ZSTK474和其他PI3K亚型抑制剂在小鼠体内的药代动力学特征不同，难以控制这些差异，因此我们采用了联合使用PI3K亚型抑制剂的方法进行比较。alpelisib的给药略微抑制了Aska-SS异种移植瘤的生长，而AZD6482和idelalisib对肿瘤生长影响甚微（图7A）。重要的是，alpelisib、AZD6482和idelalisib的组合处理显著抑制了Aska-SS和SYO-1异种移植瘤的生长（图7A；补充图S10A）。支持这些发现的是，单独使用alpelisib略微诱导了凋亡，而三种药物的联合使用显著增强了凋亡诱导，这通过Aska-SS和SYO-1异种移植瘤中的PARP切割得到证实（图7B；补充图S10B）。任何处理方式均未观察到显著的体重下降（图7C；补充图S10C）。这些结果表明，同时抑制所有IA类PI3K亚型在体内和体外都能显著增强抗肿瘤效果。

讨论部分提到，IA类PI3K亚型的主要功能因肿瘤类型而异：在PIK3CA突变型癌中为PI3Kα，在PTEN缺陷的前列腺癌中为PI3Kβ，在CLL、SLL和FL等血液系统恶性肿瘤中为PI3Kδ。因此，美国FDA已批准PI3Kα特异性抑制剂alpelisib和几种PI3Kδ特异性抑制剂（包括idelalisib）分别用于治疗PIK3CA突变型ER+HER2?乳腺癌和上述B细胞恶性肿瘤。在本研究中，我们明确证明了PI3Kα亚型主要在TRS细胞和携带PIK3CA突变的癌细胞中起作用；然而，与PIK3CA突变型癌细胞不同，PI3Kβ和PI3Kδ可以补充PI3Kα的功能，激活PI3K通路，这似乎是TRS细胞的特征。因此，除了抑制PI3Kα外，还需要抑制PI3Kβ和PI3Kδ才能充分抑制PI3K下游信号传导，从而抑制TRS细胞的增殖并最终诱导凋亡。这些观察结果证明，使用泛PI3K抑制剂（包括ZSTK474）同时抑制三种IA类PI3K亚型可以作为治疗TRS的有希望的策略。联合抑制IA类PI3K亚型的强烈效果可能是因为TRS细胞在PI3Kα抑制后的增殖和存活高度依赖于PI3Kβ和PI3Kδ介导的残余PI3K信号传导。所有IA类PI3K亚型的抑制导致造血祖细胞和小鼠胚胎成纤维细胞的显著生长抑制和凋亡诱导。重要的是，即使通过联合抑制PI3Kα和PI3Kδ抑制了约90%的总IA类PI3K活性，剩余的PI3Kβ活性仍能维持这些细胞的生长和存活。同样，我们的结果显示，尽管单独抑制PI3Kα几乎完全抑制了PI3K信号传导，导致Akt的磷酸化水平降低，但在TRS细胞中仅实现了部分的增殖抑制和凋亡诱导。实际上，联合抑制PI3Kα与PI3Kβ和/或PI3Kδ显著抑制了残余的PI3K信号传导，从而强烈抑制了增殖并诱导了凋亡。这突显了在PI3Kα抑制时，PI3Kβ和PI3Kδ在维持最低限度PI3K信号传导中的关键作用，这对TRS细胞的增殖和存活至关重要。PI3Kβ和PI3Kδ在PI3Kα抑制时发挥的补偿性信号传导机制尚不清楚。一种可能的机制是，PI3Kα的抑制缓解了RTK信号的负反馈，从而激活了其他IA类PI3K亚型，恢复了通过Akt和mTOR的PI3K下游信号传导，导致对PI3Kα抑制的耐药性，如在PIK3CA突变或HER2扩增的乳腺癌中报道的那样。同样，在PI3Kβ抑制后，由于RTK（如雄激素受体和雌激素受体）的负反馈得到缓解，PI3Kα的激活恢复了PI3K下游信号传导，导致对PI3Kβ抑制的耐药性。我们之前报告过，IGF1R的负反馈通过p70S6K对胰岛素受体底物1的丝氨酸磷酸化得以缓解，这在抑制IA类PI3K亚型后重新激活了PI3K下游信号传导，导致对PI3K抑制的耐药性。因此，在本研究中，TRS细胞在PI3Kα抑制后观察到的残余PI3K下游信号传导可能是由于PI3Kβ和/或PI3Kδ通过缓解RTK的负反馈而激活的，从而维持了增殖和存活。磷酸蛋白质组学分析显示，pan-PI3K抑制剂ZSTK474对Akt/mTOR通路的影响大于alpelisib，进一步支持了PI3Kα抑制导致TRS细胞中PI3K下游信号通路重新激活的假设。磷酸蛋白质组学分析的另一个发现是，编码CK2α的基因在ZSTK474的作用下比在alpelisib的作用下受到更强的抑制。已知CK2通过PTEN和Akt的磷酸化激活PI3K信号通路，并通过caspase-3的磷酸化抑制细胞凋亡（39）。先前的研究报告称，同时抑制CK2和PI3K信号通路可以协同诱导急性髓系白血病和结肠癌的细胞凋亡（40）。对于ZSTK474处理后CK2被抑制的原因有两种可能的解释：一种是CK2直接被ZSTK474抑制；然而，我们之前的研究表明ZSTK474对CK2和其他蛋白激酶的抑制作用相对较弱，因此排除了这种可能性；另一种是CK2在PI3Kβ和PI3Kδ的下游发挥作用，它们的抑制导致了CK2的抑制。如前所述，通过免疫印迹检测磷酸化的Akt发现，PI3Kβ和PI3Kδ的抑制与PI3Kα的抑制共同完全抑制了PI3K下游信号的剩余活性。这表明这三种PI3K亚型可能共同调节包括Akt和mTOR在内的经典PI3K下游信号通路。因此，PI3Kβ和PI3Kδ不太可能独立于PI3Kα调节不同的下游信号通路。需要进一步的研究来阐明CK2在PI3Kβ/δ下游信号通路中的作用及其在pan-PI3K抑制剂抗肿瘤效果中的地位。PI3Kβ/δ亚型在TRS细胞增殖和存活中的上游信号通路仍不清楚。一般来说，RTK下游信号通路在响应生长因子刺激时主要使用PI3Kα，但PI3Kβ和PI3Kδ也会被利用。在携带EWSR1::FLI1融合基因的Ewing肉瘤中，IGF1R通路被激活，这被认为是一个有前景的治疗靶点（41-43）；相反，在携带SS18::SSX融合基因的SS中，PDGFRα和c-MET通常被激活（44），而在携带EWSR1::ATF1融合基因的透明细胞肉瘤中，c-MET也被激活（45）。通常，PI3Kδ主要存在于白细胞中，并介导T细胞抗原受体（TCR）、BCR和细胞因子受体等免疫受体的信号（9）。我们和其他研究小组之前报告称，PI3Kδ在T细胞中介导TCR和细胞因子受体的信号，并调节肿瘤浸润调节性T细胞的激活和记忆T细胞的分化（16, 46）。然而，在本研究中，我们在TRS细胞中检测到了p110δ的表达，并发现PI3Kδ在PI3Kα抑制后对TRS细胞的增殖和存活有显著贡献。同样，也有报道指出PI3Kδ促进了多种实体瘤（如神经母细胞瘤（47）、肝细胞癌（48）和结肠癌（49）的增殖和存活。此外，有报道称EGFR和IGF1R等RTK是神经母细胞瘤中PI3Kδ的上游受体（47）。同样，在TRS细胞中，PI3Kδ可能在激活的RTK下游被激活。除了生长因子及其受体外，G蛋白偶联受体（GPCR）也可能参与TRS细胞中PI3K的激活上游事件，在这种情况下，PI3Kβ比PI3Kα和PI3Kδ更有可能参与。据报道，溶血磷脂酸/溶血磷脂酸受体和C-X-C基序趋化因子配体12/C-X-C基序趋化因子受体4分别通过激活PI3K/Akt通路参与骨肉瘤和恶性周围神经鞘肿瘤的增殖和存活（50）。因此，一些尚未确定的GPCR或RTK信号通路可能解释了PI3Kβ和PI3Kδ在TRS细胞中的参与，这需要在我们的未来研究中进行鉴定。在针对包括TRS在内的肉瘤的PI3K抑制剂的临床开发中，反映靶点结合和治疗效果的生物标志物非常重要。在本研究中，TRS细胞在PI3K抑制后的Akt（T308和S473）和S6（S235/236）的磷酸化水平与抗肿瘤效果密切相关。在一项Ib期临床试验中观察到，ZSTK474处理后肿瘤细胞中磷酸化Akt（S473）和S6（S235/236）的一致下调（13）。此外，包括切割的PARP、切割的caspase-3、PUMA和BIM在内的与细胞凋亡相关的蛋白质也与药物效果密切相关，这一点我们之前已有报道（14, 15）。这些分子可能作为监测肉瘤中PI3K通路抑制和治疗反应的临床相关药效学生物标志物。在PI3K抑制剂的临床应用中，毒性是一个重要的考虑因素，特别是高血糖。由于Akt2在葡萄糖代谢中起重要作用，尤其是在肝脏和骨骼肌等代谢组织中，因此评估PI3K抑制剂处理后代谢组织中Akt2的磷酸化状态非常重要。在本研究中，我们使用一种能检测所有Akt亚型（Akt1-3）的抗体检查了TRS细胞中Akt的T308和S473位点的磷酸化情况。然而，我们没有专门评估代谢组织中Akt2的磷酸化状态。我们需要在未来的研究中评估我们的PI3K抑制剂对Akt2磷酸化和血糖水平的影响。总之，TRS细胞中的PI3K信号通路以及随后的增殖和存活主要由PI3Kα调节，PI3Kβ、PI3Kδ和PI3Kγ的贡献较小。然而，当PI3Kα被抑制时，TRS细胞中的PI3K信号通路、增殖和存活高度依赖于PI3Kβ和PI3Kδ，而PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kδ的联合抑制显著增强了抗肿瘤活性，并最终诱导了细胞凋亡。尽管尚不清楚为什么这种情况仅发生在TRS细胞中，但pan-class IA PI3K抑制剂预计对TRS的有效性将优于其他类型的肿瘤（如癌和淋巴瘤）。尽管初步临床试验测试pan-PI3K抑制剂用于实体瘤的结果令人失望（10），但我们的当前发现为使用pan-PI3K抑制剂开发肉瘤疗法提供了依据。

原始全外显子测序和RNA-seq数据已存入Sequence Read Archive数据库（RRID: SCR_001370），访问号为PRJNA1242479。原始蛋白质组学数据已通过jPOST仓库存入ProteomeXchange Consortium，访问号为PXD062232。SU-DHL-4细胞（GSM6285348）、SU-DHL-6细胞（GSM6285350）、SS（GSM8378222、GSM8378226、GSM8378227、GSM8378248和GSM8378286）、Ewing肉瘤（GSM8332627-GSM8332631）、乳腺癌（GSM8141778-GSM8141782）和DLBCL（GSM5402206-GSM5402210）的RNA-seq数据来自GEO数据库。所有其他原始数据可向相应作者索取。

S. Isoyama在研究期间及研究之外获得了日本学术振兴会和金泽大学的资助；M. Hirata在研究期间及研究之外获得了日本医疗研究开发机构（AMED）和日本学术振兴会的资助；S. Dan在研究期间获得了日本AMED和日本财团的资助，以及在研究之外获得了OHARA Pharmaceutical, Co., Ltd.的资助；此外，S. Dan还拥有一项待审批和已颁发的专利。其他作者没有报告任何利益冲突。

作者贡献：
S. Isoyama：概念化、数据管理、软件使用、数据分析、资金获取、验证、研究、可视化、方法论、撰写初稿、项目管理。
N. Tamaki：数据管理、数据分析。
Y. Noguchi：数据管理、研究。
H. Shinchi：数据管理、研究。
T. Suzuki：监督、撰写初稿。
M. Hirata：资源提供、数据管理、研究。
K. Katayama：资源提供、数据管理、研究。
H. Nakagawa：资源提供、数据管理、研究。
K. Matsuda：资源提供、数据管理、研究。
S. Yaguchi：监督、撰写初稿。
K. Ueda：资源提供、数据管理、监督、方法论、撰写初稿。

致谢：
我们感谢Takuro Nakamura博士和Miwa Tanaka博士提供的有益讨论和建议。本研究部分得到了日本学术振兴会的科学研究资助[B项目编号19H03525（S. Dan）和C项目编号22K09414及25K12470（S. Isoyama）；日本AMED的“政府、学术界和私营企业合作加速有效药物发现研究资助”[GAPFREE5；项目编号JP21ak0101170（S. Dan）]；金泽大学癌症研究所的校外合作研究资助；日本财团的资助（项目编号2022003175）；以及武田科学基金会的特定研究资助（项目编号2022088348）。本文的补充数据可在Cancer Research Communications Online（https://aacrjournals.org/cancerrescommun/）上获取。