单瓶包装粘合剂的生物相容性、炎症反应及抗菌特性对牙龈成纤维细胞和人类牙髓干细胞的影响

《Scientific Reports》：Biocompatibility, inflammatory response, and antimicrobial properties of single-bottle adhesives on gingival fibroblast and human dental pulp stem cells

　　摘要
本研究的目的是通过在不同时间点（1分钟、1小时和6小时）测量细胞存活率，来评估通用粘合剂对牙龈成纤维细胞和人类牙髓干细胞增殖的影响。在6小时后测量TNF-α水平，以评估材料引发的任何炎症反应或细胞因子释放。使用琼脂扩散试验，在24小时后评估了这些粘合剂对乳酸菌和变形链球菌的抗菌性能。测试的单一瓶装粘合剂包括：Huge Bond（Huge Dental，美国）、Single Bond Universal（3M，美国）和G-Premio BOND（GC，日本）。Huge Bond和Single Bond在6小时后显示出细胞存活率的显著下降，其中Single Bond的下降最为明显（p < 0.0001）。Huge Bond表现出最高的TNF-α表达水平，其次是Single Bond和G-Premio。Huge Bond在对抗这两种细菌方面表现出优越的性能（p = 0.0001）。如果未完全聚合，甲基丙烯酸酯单体通常具有细胞毒性，因为它们能够渗出并损害牙髓细胞和牙龈成纤维细胞。所有三种材料都具有初始的抗菌活性，这在Huge Bond和G-Premio中尤为明显。

引言
作为微创牙科的一部分，牙科粘合剂正在开发出更好的多用途配方，以实现修复材料与牙齿结构之间的强效、持久结合，并具备额外的抗菌特性，以解决修复边缘继发性龋齿和生物膜积聚这一持续存在的临床问题。根据销售方式和所需临床程序的数量，牙科粘合剂分为八代。自1955年问世以来，牙科粘合剂技术已经从第四代和第五代的酸蚀和冲洗系统发展到第六代到第八代的自酸蚀系统。主要目标是减少用于牙科填充的瓶装数量和工艺步骤，以缩短操作时间并增强修复体与牙齿之间的粘附力。随着对微创牙科修复和美观要求的增加，粘合剂牙科迅速发展起来。然而，关于不同牙科粘合剂组的细胞毒性效应及其安全使用仍存在争议。通用粘合剂属于第八代单瓶装多模式粘合剂，允许医生使用自酸蚀、选择性酸蚀或全酸蚀程序直接粘合复合树脂和一些间接陶瓷修复体。由于牙科粘合剂会直接或间接接触生物组织（包括牙齿和口腔软组织），因此生物相容性是最关键的属性之一。研究表明，修复树脂和粘合剂的成分（如2-羟基乙基甲基丙烯酸酯（HEMA）和三乙二醇二甲基丙烯酸酯（TEGDMA）可以渗透牙本质小管并达到对牙髓细胞有害的数量。实际上，在牙科粘合剂部分聚合后，会留下一定比例的残留单体。转化程度是指在聚合过程中树脂单体中的碳双键（C = C）分解为碳单键（C-C）的程度。许多变量会影响光固化聚合过程，例如光源、粘合剂层的粘度和厚度、温度、空气抑制、溶剂的存在、光引发剂的类型和混合物、共引发剂、稳定剂和抑制剂，以及单体和填料的类型和数量。

牙本质粘合剂产生负面效应的一个潜在原因是树脂单体的泄漏。Wegehaupt等人将粘合剂的细胞毒性与他们在传统粘合剂中观察到的较高转化程度联系起来，与自酸蚀粘合剂相比。牙科粘合剂的细胞毒性可能导致口腔黏膜的过敏反应、炎症或坏死，如果这些粘合剂接触到关键的牙本质或发生牙龈组织损伤时，后果更为严重。因此，必须通过体外实验评估牙科粘合剂的细胞毒性以确保安全。然而，根据酸蚀系统和单体释放的关系，某些牙科粘合剂组是否比其他组更容易引起细胞毒性仍存在争议。由于不同研究采用不同的方法，并且有多种因素可能影响细胞毒性测试的结果，这一问题更加复杂。此外，关于通用牙科粘合剂（UDA）潜在毒性的文献信息也存在矛盾。在牙科研究中，由于其应用于靠近牙髓和牙龈组织的深层龈下边界，其生物相容性应该是关键考虑因素。与选定的单一瓶装通用粘合剂相比，这些粘合剂的生物相容性和抗菌特性尚未得到充分评估。尚未发现有关Huge Bond与其他通用粘合剂细胞毒性比较的研究，而使用牙本质屏障系统的研究表明，酸蚀和冲洗粘合剂的细胞毒性更强。由于研究中方法学的一致性不足，研究牙科粘合剂类型与毒性之间联系的工作仍受到阻碍。该研究使用牙龈成纤维细胞和牙髓干细胞作为体外测试平台，以评估三种牙科材料（Huge Bond、Single Bond和G-Premio）的抗菌性能和生物相容性。研究旨在评估：(1) 细胞增殖：这些材料对人类牙髓干细胞和牙龈成纤维细胞增殖的影响；(2) 炎症反应：在处理6小时后测量细胞中的TNF-α水平，以评估材料引发的任何炎症反应或细胞因子释放；(3) 抗菌活性：使用琼脂扩散试验评估这些材料对常见口腔病原体（乳酸菌和变形链球菌）的抗菌效果。假设的零假设是三种测试的通用粘合剂在细胞毒性和抗菌活性方面没有差异。

材料与方法
本研究中使用的牙科粘合剂及其制造商信息见表1。这三种产品——Huge Bond（Huge Dental，美国）、Single Bond Universal（3M，美国）和G-Premio BOND（GC，日本）是用于修复牙科的粘合剂系统，它们被设计为“通用”或“单瓶装”粘合剂，意味着可以用于不同的模式：选择性酸蚀、完全酸蚀或自酸蚀。

研究设置
本研究在埃及开罗的Global Research Labs进行，其设施和技术环境为工作的成功完成提供了有力支持。

细胞分离与培养
**人类牙龈成纤维细胞（HGFs）的分离与培养**
从牙龈切除术中分离的牙龈组织或牙科手术后丢弃的组织中获取人类牙龈成纤维细胞。用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）彻底冲洗组织以去除血液或 debris 后，用无菌手术刀将其切成小块（2毫米）。然后，将组织在37°C下用分散酶和胶原酶（I型）酶混合物进行酶消化，同时轻轻搅拌一小时。消化完成后，通过无菌筛网过滤组织以去除未消化的碎片。通过离心将成纤维细胞从细胞悬浮液中分离出来，然后将其重新悬浮在α-MEM培养基中（目录编号：12571063；Gibco，Thermo Fisher），该培养基添加了10-20%的胎牛血清（FBS；Gibco，Thermo Fisher，目录编号：26140079）和L-谷氨酰胺（目录编号：25030081；Gibco，Thermo Fisher）以及抗生素（青霉素和链霉素，目录编号：15140122；Gibco，Thermo Fisher）。接种后，细胞在37°C和5% CO?环境中培养。每隔三天更换一次培养基，使细胞增殖并附着在培养容器表面上。为了保持细胞的增殖能力，在细胞达到汇合期后进行传代和亚培养。成纤维细胞具有独特的纺锤形形态，使用CD34和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）进行鉴定。

**人类牙髓干细胞（DPSCs）的分离**
使用三颗根部清晰可见的智齿来分离DPSCs。除了1%的DEMSO保存液外，样本还悬浮在含有抗生素（青霉素、链霉素和抗真菌剂）的PBS（pH 7.4）中。样本到达实验室后，用无菌镊子和手术刀仔细去除牙齿上的“目标区域”。然后用磷酸盐缓冲盐水清洗样本以去除血液。将组织浸入1%青霉素/链霉素溶液中一分钟以消除微生物。用镊子和无菌剪刀将根组织切成小块。随后，在含有0.1 U/ml胶原酶II（Sigma-Aldrich，德国）的溶液中于37°C下消化一小时。胶原酶（Invitrogen Life Technologies，美国）在含有1毫升Dulbecco改良Eagle培养基（Gibco，ThermoScientific）和10%热灭活胎牛血清（FBS）及营养混合物F-12（DMEM/F12）的溶液中被失活。将上清液丢弃后，将沉淀物重新悬浮在含有10% FBS的1毫升DMEM/F12中。T25培养瓶中接种经过消化处理的牙本质毛囊组织，培养基中含有10%胎牛血清（FBS）（Gibco，Thermosientific，德国）和1%青霉素G钠（10,000 IU）、链霉素（10 mg）和两性霉素B（25 mg）（PSA）（根据Invitrogen Life Technologies）。培养瓶在37°C和5% CO?环境中培养。当单个细胞附着在塑料表面后，每隔两天更换培养基以去除非粘附细胞。经过第三次传代后，塑料粘附细胞的汇合度达到约80%。使用CD105和CD34验证成纤维细胞的独特纺锤形形态。

**通过流式细胞术对DPSCs和HGFs的多参数表征**
DPSC细胞用CD105-FITC和CD45-FITC染色，而HGF细胞用α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和CD34染色。调整细胞浓度至10^6/ml后，将其悬浮在PBS中。离心800xg 10分钟后丢弃细胞上清液，并对细胞沉淀物进行两次PBS洗涤。每个管中分别加入五微升用于DPSCs的CD105和CD45单克隆抗体以及用于HGFs的α-SMA和CD34单克隆抗体，以防止大量细胞产生强烈的自发荧光信号。在4°C下孵育45分钟后，清洗细胞并重新配制在结合缓冲液中。根据流式细胞术分析处理后的数据，利用Navios软件和NAVIOS EX 10色流式细胞仪（Beckman Coulter Life Sciences，美国）对细胞进行分选（图1、2、3、4）。

用于染色DPSCs的抗体包括：
1. CD105单克隆抗体（MEM-226），FITC，目录编号：MA1-19594，Thermofisher Scientific，美国；
2. CD45单克隆抗体（30-F11），FITC，eBioscience，ThermoFisher Scientific，美国；
3. CD34单克隆抗体，eBioscience，目录编号：PA5-85917；
4. α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体（1A4），目录编号：14–9760-82，eBioscience，ThermoFisher Scientific。

图1显示96.8%的细胞中CD105“MSC特异性膜标志物”表达强烈，CD45“造血特异性膜标志物”表达较弱，表明细胞为纯DPSCs。
图2显示91.9%的细胞中α-SMA“牙龈成纤维细胞特异性膜标志物”表达强烈，CD34“造血特异性膜标志物”表达较弱，表明细胞为纯HGFs。

**使用MTT试验评估HGFs和DPSCs在三个时间点的生物相容性**
使用MTT试验研究细胞活力。HGFs和DPSCs细胞在实验前一天使用标准的胰蛋白酶/EDTA方法进行准备。实验使用96孔培养板进行细胞接种。每个孔接种200微升Dulbecco培养基，含有8×10^3个细胞。将10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素G钠（10,000 IU）、链霉素（10 mg）和两性霉素B（25 mg）加入到改良Eagle培养基（DMEM）（Gibco，Thermoscientific，德国）中。为了使细胞附着，培养板在37°C和5% CO2的条件下孵育24小时。第二天，向细胞中补充以下化合物的稳定浓度：G-Premio（GC）、Huge Bond和Single Bond。此外，对照细胞仅使用载体溶剂（0.1% DMSO）。细胞分别在37°C和5% CO2的条件下培养1分钟、1小时和6小时。实验结束时，使用Vybrant? MTT细胞增殖测定试剂盒（商品编号M6494，Thermo Fisher，德国）进行细胞毒性测定。用新的培养基替换原来的100微升培养基，每个孔加入20微升4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯四唑溴化物（MTT）溶液（1 mg/mL，Invitrogen，ThermoScientific，德国）。培养板在37°C和5% CO2的条件下孵育4小时。最后，在 retiried MTT溶液后，向每个孔加入100微升十二烷基硫酸钠盐酸盐（SDS-HCl）。使用分光光度计（ELx 800；Bio-Tek Instruments Inc.，Winooski，VT，美国）在570 nm处测量光密度，以评估细胞活力。

通过ELISA测定HGFs和DPSCs在处理Huge Bond、Single Bond和G-Premio 6小时后的肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）来量化TNF-α的表达量。按照制造商的说明，使用Human TNF-α（肿瘤坏死因子α）ELISA试剂盒（Elabscience Biotechnology，商品编号E-EL-H0109，美国）进行测试。使用微孔板读取器（TECAN microplate ELIZA reader，TECAN life sciences，美国）在450 nm处测量吸光度。通过标准曲线计算酶浓度，并适当分析结果。（图3，图4）

使用琼脂扩散实验评估Huge Bond、Single Bond和G-Premio的抗菌效果。首先在脑心浸出液琼脂（BHI）培养基中培养乳杆菌（ATCC10241）和变形链球菌（ATCC 25175）整晚，然后稀释至标准接种密度。用无菌拭子将接种物均匀涂布在琼脂板上，再用无菌打孔器在琼脂板上打孔。为了确保化合物与琼脂表面直接接触，向每个孔中加入50微升每种粘合剂，稀释比例为1:10的无菌蒸馏水。为了促进细菌生长和粘合剂扩散，培养板在37°C下孵育24小时。通过测量孵育后的抑制区大小来评估粘合剂对乳杆菌和变形链球菌的抗菌活性。通过将抑制区直径与常规抗生素或对照组的直径进行比较来评估每种粘合剂的抗菌效果。（图4）

所有统计分析使用GraphPad Prism 9（GraphPad Software，San Diego，CA，美国）进行。分析前，检查数据的方差同质性和正态性。在单因素方差分析（ANOVA）后，使用Tukey的事后多重比较检验来确定处理条件之间的显著性差异。p值小于0.05被视为统计学上显著，所有数据以平均值±标准差表示。Prism的集成可视化功能用于创建图表，确保所有定量结果的格式一致且描绘精确。

在Huge Bond、Single Bond和G-Premio存在的情况下，分别在一分钟、一小时和六小时的间隔时间点评估DPSCs的增殖潜能和生物相容性。六小时后，与未经处理的DMEM对照组相比，Huge Bond和Single Bond的细胞活力显著下降，其中Single Bond的下降幅度最大。（图5；表2：DPSCs的细胞活力）1分钟内，各种处理方法与DMEM之间没有显著差异，表明所有材料对细胞活力的短期影响相似。一小时后，Huge Bond的细胞活力显著下降（78.1%），而Single Bond和G-Premio相对较好（分别为89.9%和92.9%）。Huge Bond与DMEM之间的差异具有统计学意义（p = 0.01），表明Huge Bond在暴露1小时后有轻微的负面效应。六小时后观察到最显著的效果，Huge Bond（59%）和Single Bond（64.7%）的细胞活力显著低于DMEM（100%）。相比之下，G-Premio（69.3%）的细胞活力较好，但与DMEM相比仍有显著差异（p < 0.0001）。这些结果表明，Huge Bond和Single Bond随着时间的推移对DPSCs有显著的负面影响，而G-Premio的生物相容性相对较高。

在三种不同培养基中培养后，分别在1分钟、1小时和6小时的时间点，比较了Huge Bond、Single Bond和G-Premio对DPSCs细胞活力的影响。（表2）

在1分钟、1小时和6小时的时间点，比较了不同牙科材料（Huge Bond、Single Bond、G-Premio）和培养基（DMEM）处理后牙髓干细胞（DPSCs）的细胞活力百分比。数据表明，不同处理方法之间的细胞活力存在显著差异，尤其是在后期时间点。同样在1分钟、1小时和6小时的时间点，也测试了HGFs的细胞活力。Huge Bond和Single Bond都显著降低了HGFs的细胞活力，其中Huge Bond的降低幅度最大。（表3；图6）

在1分钟、1小时和6小时的时间点，比较了不同牙科材料（Huge Bond、Single Bond、G-Premio）处理后人类牙龈成纤维细胞（HGFs）的细胞活力百分比。所有组之间的统计差异表明，不同材料的生物相容性存在变化。

Huge Bond、Single Bond和G-Premio处理后，DPSCs和HGFs中的TNF-α表达和抗菌活性进行了分析。（表4；图7a）Huge Bond处理后，DPSCs中的TNF-α水平有显著变化。Huge Bond的TNF-α表达最高，其次是Single Bond和G-Premio，后两者的表达增加相对较低。六小时后，Huge Bond导致TNF-α表达显著增加（17.6 ± 0.72），与DMEM对照组（2.25 ± 0.23）相比具有统计学意义。Single Bond也显著提高了TNF-α表达（13.5 ± 0.73），而G-Premio（10.5 ± 1.22）在测试材料中表达最低。这些结果表明，Huge Bond和Single Bond在DPSCs中引发的炎症反应比G-Premio更明显。

通过测量每种材料对乳杆菌的抑制区大小，评估了Huge Bond、Single Bond和G-Premio的抗菌活性。（图8a）Huge Bond产生的抑制区最大（5.93 ± 0.51 mm），其次是G-Premio（5.50 ± 0.44 mm）和Single Bond（4.47 ± 0.73 mm）。统计显著性（p = 0.0001）表明Huge Bond在抑制乳杆菌生长方面比Single Bond和G-Premio更有效。在抗变形链球菌（Table 5；图8b）的实验中，Huge Bond同样表现出最强的抗菌效果。所有三种材料都表现出一定的抗菌活性，但Huge Bond的效果最为显著。

牙科研究应优先考虑牙科粘接剂的生物相容性，因为它们被应用于紧邻牙髓和牙龈组织的深度龈下边缘。体外研究材料的细胞相容性对于确定其临床应用潜力至关重要。本研究的目的是评估三种牙科材料“Huge Bond、Single Bond和G-Premio”对人类牙髓干细胞和人类牙龈成纤维细胞的生物相容性，并评估它们对变形链球菌（S. Mutans）和乳杆菌的抗菌特性。根据本研究的结果，原假设被拒绝。“细胞毒性”应理解为更广泛的生物学谱系——不仅包括短期活力，还包括在洗脱液和剂量依赖条件下的炎症信号传导和促再生分化能力。国际标准化组织在2009年发布的ISO 10993-5标准提供了评估用于医疗用途的材料的细胞毒性的全面标准。本研究遵循ISO 10993-5指南，并使用MTT试验来评估牙科材料的细胞毒性。MTT测试被广泛认为是评估生物材料细胞毒性的标准工具，尤其是在牙科领域。本研究选中的材料是用于修复牙科的牙科粘合剂。这些粘合剂被设计为“通用型”或“一瓶式”粘合剂，意味着它们可以用于多种模式。然而，它们的化学成分存在显著差异。它们是混合物，而不是单一分子，设计成亲水性足以湿润牙齿结构，同时又具有足够的疏水性以防止长期降解。HugeBond和G-Premio是含有功能性单体的现代通用粘合剂，而“Single Bond”在化学上指的是一种基本的共价键。根据制造商的说法，Huge Bond被描述为第八代通用粘合剂。其主要成分包括二甲基丙烯酸酯单体（通常是UDMA/TEGDMA）、用于与牙齿和金属化学结合的10-MDP、水、丙酮、填料（二氧化硅）和引发剂。它含有10-MDP，以实现与多种基材（牙齿、陶瓷、金属）的强而多用途的粘合。Single Bond Universal是第七/八代粘合剂，由10-MDP、Bis-GMA、HEMA、Vitrebond共聚物（聚烯酸）、乙醇、水和引发剂组成。它还含有10-MDP以实现粘合，以及HEMA以提高渗透性，并含有硅烷成分，使其能够直接与基于二氧化硅的陶瓷粘合。G-Premio BOND是第七/八代一瓶式通用粘合剂，由10-MDP、4-MET、MDTP、丙酮、二甲基丙烯酸酯单体和光引发剂以及二氧化硅填料组成。它是一种不含HEMA的配方，旨在减少随时间的吸水性。由于其三种功能性单体的组合，它具有高度的多功能性。这三种粘合剂的选择主要是基于对活性功能性单体差异的评估：10-MDP（三种粘合剂都含有），4-MET（仅G-Premio含有），MDTP（仅G-Premio含有）。同时，这些粘合剂都能与羟基磷灰石和金属氧化物结合。可聚合树脂的差异包括二甲基丙烯酸酯（UDMA、Bis-GMA）、HEMA（Single Bond含有），以及溶剂的选择——丙酮（G-Premio和Huge Bond含有）或乙醇（Single Bond含有）或水。所有测试的化合物都含有二氧化硅填料（SiO2），其pH值呈酸性，通常在1.5到2.7之间，这使得它们能够蚀刻牙齿表面。Huge Bond、Single Bond和G-Premio的化学成分直接影响它们的细胞毒性和抗菌性能，因为单体类型、溶剂和添加剂决定了它们对口腔细胞的毒性以及是否能够抑制细菌生长。含有细胞毒性成分的牙科材料会损害细胞完整性，导致细胞核固缩和细胞骨架结构变化。尽管存在这种潜在的有害后果，但根据本研究的结果，在 immediate 测试中，所评估的材料没有显示出细胞毒性的迹象。然而，在1小时和6小时后，不同的测试材料观察到了严重的细胞毒性效应。MTT和迁移研究的结果表明，在立即应用粘合剂时没有出现细胞损伤，表明在给定条件下这些材料是生物相容的。在这种情况下，氧化应激的作用至关重要，因为诱导较高水平活性氧（ROS）的材料通常与增加的细胞毒性和遗传毒性相关。过多的ROS会产生DNA损伤、缩短端粒并加速细胞衰老，从而导致细胞死亡。表2、3、4和5的结果表明，Huge Bond、Single Bond和G-Premio的生物相容性随时间和细胞类型而显著变化。所有材料在立即放置（一分钟内接触细胞）时都是生物相容的。Huge Bond在暴露1小时后有轻微的不良影响。Huge Bond和Single Bond对DPSCs和HGFs的影响最为显著，尤其是在长时间暴露（6小时）时。Single Bond也显著降低了细胞活力，尤其是在DPSCs中，尽管其对HGFs的影响较小。相比之下，G-Premio的影响最小，特别是对DPSCs而言。这可能是因为G-Premio不含甲基丙烯酸酯功能性单体。然而，与对照组相比，它仍然显示出细胞活力的下降。这强调了确保粘合剂充分且完全光聚合的重要性，以避免任何残留单体对深龋洞中的牙本质组织或深颈缘或近中龋洞边缘的牙龈组织产生细胞毒性作用。将细胞暴露于牙科材料中的细胞毒性成分可能会导致结构改变，包括细胞核固缩和细胞骨架紊乱。Huge Bond的细胞毒性可能归因于Bis-GMA和HEMA，在完全聚合前会渗出，从而导致牙髓细胞和成纤维细胞的细胞毒性效应。MDP的存在改善了粘合效果，但并未显著降低细胞毒性。尽管Huge Bond不含特定的抗菌剂，但其抗菌效果可能归因于蚀刻过程中的低pH值，这可以抑制细菌生长。正如本研究所示，统计学显著性（p = 0.0001）表明Huge Bond在抑制乳酸杆菌和变异链球菌生长方面明显优于Single Bond和G-Premio，尽管后两者也表现出了中等程度的抑制作用。虽然所有三种材料都表现出一定的抗菌活性，但Huge Bond在对这两种菌株的抑制作用方面表现更出色。

本研究的发现 在所有测试中都是一致的，并且与其他研究的结果一致，包括Adhese Universal（Ivoclar Vivadent，瑞士沙恩）、OptiBond Universal（Kerr，美国加利福尼亚州布雷阿）和Prime & Bond Universal（Dentsply Sirona，美国北卡罗来纳州夏洛特）。这些细胞毒性的差异可能是由于特定粘合剂成分的差异，特别是化合物比例和不同单体。牙科粘合剂的成分可能含有不同量的甲基丙烯酸酯单体，包括TEGMDA、UDMA、HEMA、PENTA和Bis-GMA，这些成分可能会影响它们的危害程度。与单个单体相比，它们的联合危害性可能由于协同作用而加剧。文献表明，在甲基丙烯酸酯单体中，Bis-GMA具有最高的细胞毒性，而UDMA、HEMA和TEGMDA的细胞毒性最低。由于其相对较大的分子量，这种单体通过牙本质的能力有限；然而，它容易水解，其副产物可能导致细胞膜通透性的降低。此外，有报道称，用Bis-GMA处理的人体牙龈成纤维细胞中谷胱甘肽（GSH）耗尽并诱导了细胞凋亡。UDMA的毒性机制包括GSH耗尽、细胞周期停滞、细胞凋亡/坏死诱导以及ROS生成。关于Single Bond的细胞毒性，这归因于其中高含量的HEMA，因为HEMA容易扩散到牙本质和牙髓组织中。残留的单体会导致牙髓细胞的氧化应激和细胞凋亡，尽管它的抗菌活性较低。研究表明，HEMA可以在构成牙髓组织的细胞中引起毒性，并且能够快速扩散到牙本质中。某些报告指出，它还可以导致多种细胞类型的形态改变以及细胞凋亡和生长抑制。关于G-Premio Bond，其细胞毒性与其他通用粘合剂相似，主要是因为未聚合的单体。多种功能性单体的组合并没有消除毒性，但提高了粘合效率。虽然G-Premio由于其酸性单体（MDP、4-MET）具有轻微的抗菌效果，暂时降低了pH值并抑制了细菌代谢，但它缺乏持续的抗菌活性，除非添加了抗菌添加剂。有报道称，10-MDP会引起炎症反应并抑制人类牙髓细胞的成牙本质细胞发育。通过与类似成牙本质细胞的直接相互作用，它还可能导致矿化抑制。另一方面，Nakagawa等人声称，在含树脂的粘接材料中测试4-MET时，显示出其对牙髓细胞的生物相容性。此外，据报道，较低的pH值会使牙科粘合剂变得更加危险。有报道称，一瓶式粘合剂至少在24小时内表现出杀菌性能。因此，“细胞毒性”应被理解为一个更广泛的生物学概念——不仅包括短期存活能力，还包括在洗脱和剂量依赖条件下的炎症信号传导和促再生分化能力。此外，应考虑聚合程度和未反应单体的存在。

我们的抗菌发现与其他研究一致，这些研究指出，粘合剂系统中未聚合成分的洗脱（这些成分通常对细菌菌落有毒）或功能性单体10-MDP的酸性可能是抗菌作用的原因。此外，具有抗生物膜特性的物质可以作为优秀的龋齿毒力抑制剂，抑制变异链球菌的生长并降低致龋性。本研究可能存在某些局限性。实验的体外性质是当前研究的主要缺陷。我们在基于不同细胞毒性、遗传毒性、炎症反应和抗菌评估的各种测试中获得了类似的结果，表明所使用方法的可信度很高。结果与其他使用类似方法的研究结果相当。此外，由于缺乏牙本质屏障、 smear层和免疫反应，体外结果难以与实际牙洞中的临床情况相对应。此外，在本研究中，粘合剂未进行聚合，因此需要进一步的研究来测试这些粘合剂在新鲜聚合和长时间后的细胞毒性和抗菌性能。

**结论**
在当前研究的限制条件下，得出以下结论：每种测试的通用粘合剂对牙龈成纤维细胞和牙髓干细胞的影响取决于其化学配方。如果在固化前第一分钟内应用，所有测试的粘合剂都是生物相容的。甲基丙烯酸酯单体（Bis-GMA、HEMA和TEGMDA）如果未完全聚合，则大多与细胞毒性相关，因为它们具有渗出并损害牙髓细胞和牙龈成纤维细胞的能力。测试的通用粘合剂的抗菌活性与酸性单体有关，这一点在HugeBond和G-Premio中尤为明显。