Trehalose improves cold tolerance of Pediococcus pentosaceus OL77 and enhances low-temperature oat silage fermentation

《mSphere》：Trehalose improves cold tolerance of Pediococcus pentosaceus OL77 and enhances low-temperature oat silage fermentation

　　

低温仍然是青贮发酵的主要瓶颈，尤其在寒冷地区和高海拔区域。本研究探讨了相容性溶质在增强戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus) OL77冷适应中的作用及其在亚适宜温度(5°C–15°C)下的燕麦青贮协同应用。RT-qPCR分析显示，冷休克蛋白基因CspP在5°C时表达急剧诱导，表明其在冷应激响应中的核心作用。外源海藻糖(Trehalose)和甜菜碱显著下调CspP表达，促进细菌生长，加速产酸，并增强代谢稳定性。在青贮试验中，OL77 + 海藻糖处理在所有测试温度下均提高了乳酸产量，减少了氨氮积累，并抑制了酵母菌和霉菌。随机森林模型确定了11个对青贮质量至关重要的核心变量，强调联合处理在所有温度条件下均为最有效策略。这些发现为通过相容性溶质与嗜冷乳酸菌的协同应用改善低温青贮提供了坚实的理论和实践框架，并展示了机器学习在发酵过程优化中的潜力。

该研究针对寒冷地区及高海拔区域青贮发酵面临的低温瓶颈问题展开。低温环境严重抑制乳酸菌活性，导致发酵启动缓慢、酸化不足，进而引起蛋白质降解和有害微生物滋生。尽管相容性溶质和耐冷乳酸菌在食品和发酵领域有所探索，但在青贮基质中，特别是在低温与低pH双重胁迫下的调控机制仍不明确，且传统研究多依赖终点指标，缺乏对冷应激轴机制的解析。为此，研究人员以戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus) OL77为对象，结合转录组学与青贮试验，揭示了海藻糖(Trehalose, Tr)增强菌株冷耐受性及改善燕麦青贮质量的机理。相关成果发表在《mSphere》期刊。

研究人员采用了多项关键技术方法。首先，从甘肃农业大学草业学院获取P. pentosaceus OL77菌株，并在不同温度梯度下进行生理状态标准化处理。其次，利用RT-qPCR技术量化冷休克蛋白基因CspP的表达动态，并以tufA作为内参基因。第三，建立5升聚乙烯微型青贮窖系统，在15°C、10°C和5°C三个温度条件下，设置对照(CK)、商业添加剂(SLI)、OL77单菌、海藻糖单品及OL77+海藻糖联合处理共5组实验，每组3个重复。最后，采用SPSS进行双因素方差分析与Duncan多重比较，并利用R语言构建随机森林(Random Forest)模型进行特征筛选与效应量分析。

研究结果部分显示：

1. 1.
   戊糖片球菌OL77中CspP基因的温度及相容性溶质响应模式：随着温度降低，CspP转录水平在早期(0–3 h)急剧上升，5°C时诱导最强，较25°C升高6.54倍。外源海藻糖和甜菜碱显著下调CspP表达，其中海藻糖组较对照组(CK)降低64.05%。同时，海藻糖显著提升了菌体在5°C下的OD₆₀₀值和产酸速率，终端pH较对照降低21.91%，表明其有效缓解了冷应激并促进了代谢。
2. 2.
   相容性溶质与乳酸菌添加剂的青贮营养品质分析：在所有温度下，OL77及OL77+Tr处理的干物质(DM)和粗蛋白(CP)含量维持较高水平。OL77处理在10°C和5°C下水溶性碳水化合物(WSC)含量最高，分别超出对照25.56%和22.80%。相比之下，单独使用海藻糖对营养保存效果不稳定。
3. 3.
   相容性溶质与添加剂的青贮发酵品质分析：随着温度下降，青贮pH呈上升趋势，但OL77+Tr处理在各温度下pH均维持在4.2以下。该组合显著提高了乳酸(LA)产量，降低了乙酸(AA)和氨氮(NH₃-N)含量。在5°C时，OL77+Tr组的NH₃-N含量仅为17.6 g kg^?1TN，显著低于其他处理，表明其有效抑制了蛋白质降解。
4. 4.
   青贮微生物种群对相容性溶质和LAB接种剂的反应：低温显著降低了乳酸菌数量，但OL77+Tr组始终维持最高的乳酸菌计数，且在5°C时仍达8.87 log₁₀CFU g^?1FM。此外，该处理完全抑制了霉菌和酵母菌的生长(计数为0)，表现出优异的抑菌效果。
5. 5.
   不同处理方法对青贮参数的效应量分析：随机森林模型筛选出11个核心变量，其中NH₃-N和真菌载量是最重要的判别因子。效应量热图显示，OL77+Tr在所有温度下对降低pH、NH₃-N及抑制霉菌酵母表现出最一致的良性效应。

讨论部分指出，冷休克蛋白(CspP)的快速诱导是OL77应对低温的关键机制，而海藻糖通过稳定核糖体、酶及膜功能，减轻了菌株对CspP的高度依赖，从而降低转录负荷并促进生长。虽然燕麦原料含有较高的水溶性碳水化合物(WSC)，但其附生乳酸菌数量低于发酵阈值，因此外源接种至关重要。研究发现，海藻糖不仅作为渗透保护剂，还可能作为可发酵碳源缩短酸化滞后期。单独使用海藻糖效果不稳定，仅在极低温度(5°C)下表现略优，而OL77+Tr组合则突破了低温“启动阈值”，实现了跨温度的稳定性。此外，随机森林模型证实，控制蛋白水解(氨氮)和抑制真菌增殖是评价低温青贮质量的首要目标。

结论部分总结：补充相容性溶质，特别是海藻糖，可协同增强戊糖片球菌OL77在亚适宜温度下的耐冷性和发酵性能。海藻糖通过促进细胞生长、加速产酸并稳定冷休克蛋白基因CspP的表达来缓解冷诱导胁迫。应用于燕麦青贮时，OL77+海藻糖组合在5°C–15°C范围内保持了优异的发酵品质，有效抑制了有害微生物并最小化了蛋白质降解。此外，通过特征筛选确定的温度稳健性指标集为低温青贮条件下的质量监控提供了实用基础。