骨化三醇在PM2.5诱导的支气管上皮细胞凋亡和炎症中的保护作用：体外通过维生素D受体介导的Nrf2信号通路

《Current Research in Toxicology》：Protective role of calcitriol in PM2.5-induced apoptosis and inflammation in bronchial epithelial cells in vitro via vitamin D receptor-mediated Nrf2 signaling

　　

PM2.5通过诱导氧化应激、炎症反应和细胞凋亡导致肺损伤。骨化三醇通过调节维生素D受体（VDR）和Nrf2信号通路，在减轻PM2.5诱导的氧化应激和炎症中发挥保护作用。在本研究中，研究人员在人类支气管上皮BEAS-2B细胞中，研究了骨化三醇对PM2.5诱导的细胞凋亡、氧化损伤和炎症的保护作用，并特别关注VDR与Nrf2信号通路之间的交互作用。BEAS-2B细胞在暴露于PM2.5(100 μg/mL) 前，先用骨化三醇 (1, 10, 100 nM) 预处理24小时。通过流式细胞术、酶联免疫吸附试验、实时定量逆转录聚合酶链式反应和蛋白质印迹分析评估细胞凋亡、DNA损伤和炎症。通过染色质免疫沉淀试验评估VDR与抗氧化反应元件（ARE）的结合。骨化三醇通过减少p53磷酸化和下调p53和caspase-3的mRNA表达来抑制凋亡信号传导，同时也减轻了氧化DNA损伤，表现为BEAS-2B细胞中8-羟基-2'-脱氧鸟苷 (8-OHdG) 水平降低。此外，骨化三醇通过下调NF-κB活性和NF-κB p65及其下游促炎基因（包括IκB-α、TNF-α和IL-6）的mRNA表达，从而抑制炎症反应。而且，骨化三醇处理增加了VDR蛋白表达并增强了Nrf2活性。染色质免疫沉淀试验表明，骨化三醇增强了VDR与AREs的结合，从而促进了关键的Nrf2调控的细胞保护基因的转录，包括血红素氧合酶-1 (HO-1) 和NADPH醌脱氢酶1 (NQO1)。这些发现为骨化三醇的药理作用提供了机制性见解，强调了其通过VDR介导的激活Nrf2氧化还原信号通路来减轻PM2.5诱导的细胞损伤的潜力。

一、 研究背景、问题与目的

空气动力学直径小于2.5微米的细颗粒物 (PM_2.5) 暴露是导致呼吸系统疾病风险增加的重要环境因素。其致病机制主要涉及诱导支气管上皮细胞产生活性氧 (ROS)、激活炎症信号通路和促进细胞凋亡。特别是，PM_2.5可激活核因子κB (NF-κB) 通路，上调白细胞介素-6 (IL-6) 和肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 等炎症因子，并可通过激活抑癌蛋白p53和caspase-3诱导细胞凋亡和氧化DNA损伤。因此，寻找能够减轻PM_2.5所致细胞损伤的干预策略至关重要。

骨化三醇 (1,25-二羟基维生素D₃) 是维生素D的活性形式，作为维生素D受体 (VDR) 的配体，已被证明具有抗炎和潜在的抗氧化作用。核因子E2相关因子2 (Nrf2)/抗氧化反应元件 (ARE) 信号通路是细胞防御氧化应激的核心机制。先前研究表明，VDR激活可能与Nrf2信号通路存在关联，VDR-Nrf2轴被认为是氧化应激相关疾病的关键保护机制。然而，在PM< />诱导的细胞应激和炎症背景下，VDR与Nrf2之间具体的相互作用机制仍不清楚。

为此，本研究旨在探究骨化三醇对人支气管上皮BEAS-2B细胞中PM_2.5诱导的细胞凋亡、氧化DNA损伤和炎症反应的保护作用，并特别关注其通过VDR对Nrf2介导的氧化还原信号通路的调节作用。这项研究为理解骨化三醇的肺保护机制提供了新的见解，并发表于《Current Research in Toxicology》期刊。

二、 主要研究方法概述

本研究采用永生化人支气管上皮细胞系 (BEAS-2B) 作为体外模型。PM_2.5样本采用美国国家标准与技术研究院的标准参考物质SRM 2786。核心实验设计为：细胞预先用不同浓度 (1, 10, 100 nM) 的骨化三醇处理24小时后，再暴露于PM_2.5(100 μg/mL)。通过多种技术方法评估细胞损伤及保护机制：1. 使用DAPI染色和Annexin V/碘化丙啶 (PI) 双染流式细胞术，分别评估细胞形态、增殖和凋亡。2. 采用实时定量逆转录聚合酶链式反应 (qRT-PCR) 检测凋亡相关基因 (p53, CASP3) 和炎症相关基因 (NF-κB p65, IκB-α, TNF-α, IL-6) 的mRNA表达水平。3. 利用蛋白质印迹法 (Western blot) 分析VDR、Nrf2和磷酸化p53蛋白的表达。4. 通过免疫荧光技术检测氧化DNA损伤标记物8-羟基-2‘-脱氧鸟苷 (8-OHdG) 的水平，以及NF-κB p65和Nrf2的核质转位。5. 应用染色质免疫沉淀 (ChIP) 结合定量PCR (qPCR) 技术，分析VDR与Nrf2靶基因 (NQO1, HO-1) 启动子区ARE的结合情况。6. 使用Nrf2特异性抑制剂布鲁萨妥 (brusatol) 处理，以验证骨化三醇的作用是否独立于经典Nrf2通路。

三、 研究结果

3.1. 骨化三醇逆转PM_2.5诱导的支气管上皮BEAS-2B细胞损伤

PM_2.5暴露导致细胞形态学改变（皱缩、变圆、脱落）和增殖减少。骨化三醇预处理显著减轻了这些形态学变化，并提高了细胞数量，表明其能保护细胞活力，减少PM_2.5诱导的细胞毒性。

3.2. 骨化三醇保护BEAS-2B细胞免受PM_2.5诱导的细胞凋亡

流式细胞术分析显示，PM_2.5暴露显著增加了早期和晚期凋亡细胞的比例。而骨化三醇预处理可剂量依赖性地显著降低PM_2.5诱导的早期和晚期细胞凋亡，证实了其抗凋亡作用。

3.3. 骨化三醇减轻PM_2.5诱导的BEAS-2B细胞凋亡信号传导和氧化DNA损伤

PM_2.5显著上调了凋亡相关基因p53和CASP3的mRNA表达，并增加了p53蛋白的磷酸化水平，骨化三醇预处理则下调了这些表达。同时，PM_2.5暴露导致氧化DNA损伤标志物8-OHdG积累，骨化三醇预处理可显著降低其水平。这表明骨化三醇通过抑制p53/caspase-3介导的凋亡信号和减少氧化DNA损伤来保护细胞。

3.4. 骨化三醇抑制PM_2.5诱导的BEAS-2B细胞炎症信号传导

PM_2.5暴露显著上调了炎症相关基因NF-κB p65、IκB-α、TNF-α和IL-6的mRNA表达。骨化三醇预处理可剂量依赖性地抑制这些基因的表达。免疫荧光分析进一步显示，骨化三醇降低了NF-κB p65的核质比，表明其抑制了NF-κB的活化与核转位。这些结果明确了骨化三醇通过下调NF-κB活性及其下游炎症基因来缓解PM_2.5诱导的炎症反应。

3.5. 骨化三醇通过调节VDR和Nrf2信号恢复PM_2.5诱导的支气管细胞损伤

蛋白质印迹分析显示，PM_2.5暴露降低了VDR和Nrf2的蛋白表达，而骨化三醇预处理可剂量依赖性地显著上调这两种蛋白的表达。免疫荧光结果表明，骨化三醇促进了Nrf2的核转位，增强了其转录活性。这说明骨化三醇能够增强VDR和Nrf2的蛋白水平及Nrf2的活性。

3.6. 维生素D受体介导PM_2.5刺激下的Nrf2-ARE转录激活

为探究骨化三醇激活抗氧化基因的转录机制，研究人员进行了ChIP-qPCR分析。结果显示，骨化三醇处理显著增强了VDR与Nrf2靶基因NQO1和HO-1启动子区ARE序列的结合。即使在使用了Nrf2抑制剂布鲁萨妥的情况下，骨化三醇仍能显著上调NQO1和HO-1的mRNA表达。这些发现表明，骨化三醇可以通过VDR依赖性的机制激活ARE驱动的抗氧化基因，且该作用不依赖于经典的Nrf2信号通路。

四、 讨论与结论总结

在讨论部分，研究人员将本研究结果置于更广泛的文献背景中进行了阐释。骨化三醇的保护作用主要通过激活VDR介导。活化的骨化三醇-VDR复合物可与类视黄醇X受体 (RXR) 异源二聚化，结合至靶基因的维生素D反应元件 (VDRE)，调控炎症和凋亡相关基因的转录。该轴可通过稳定IκB抑制NF-κB信号，从而下调促炎基因。同时，骨化三醇能通过VDR增强抗氧化防御。本研究的新证据表明，骨化三醇恢复了PM_2.5暴露下BEAS-2B细胞中VDR蛋白表达，并增强了Nrf2介导的氧化还原信号。ChIP实验证明VDR可直接结合NQO1和HO-1基因启动子的ARE区域。特别重要的是，即使在Nrf2被药理抑制的情况下，骨化三醇/VDR轴仍能上调这些抗氧化基因，提示其激活ARE驱动基因表达的作用独立于经典的Nrf2激活通路。

研究结论：本研究证明，骨化三醇通过上调VDR蛋白和激活Nrf2介导的氧化还原信号，对人支气管上皮BEAS-2B细胞中PM_2.5诱导的炎症、凋亡和氧化DNA损伤发挥保护作用。这些发现支持了VDR与Nrf2之间潜在的转录相互作用，这可能介导了骨化三醇对PM_2.5诱导的BEAS-2B细胞损伤的保护作用。本研究强调了骨化三醇通过VDR介导的Nrf2氧化还原信号激活，作为减轻PM_2.5诱导的肺损伤的潜在治疗候选物。