将AOS（油菜素内酯）和EBR（赤霉素）协同应用于种子包衣中，能够通过增强油菜素内酯信号传导和光合作用性能来提高棉苗的活力

《Industrial Crops and Products》：Synergistic seed coating with AOS and EBR enhances cotton seedling vigor by amplifying brassinosteroid signaling and photosynthetic performance

　　郭玉玲|杨涵|古拉姆·坎姆贝尔|范立强|刘乐|莫游|张丽明|李中兴|杨作仁
中国农业科学院棉花研究所棉花生物育种与综合利用国家重点实验室，河南省安阳市455000

**摘要**
健壮的幼苗发育对于提高棉花的抗逆性和最大化产量潜力至关重要。然而，目前促进早期幼苗生长的策略在多样性和有效性方面都存在局限。在这项研究中，我们通过将海藻酸盐寡糖（AOS）与24-表油菜素内酯（EBR）结合，开发了一种新型种子包衣方法来增强幼苗活力。初步筛选确定1000 mg L?1 AOS是提高幼苗高度和根面积的最佳浓度。进一步优化表明，将1000 mg L?1 AOS与0.48 mg L?1 EBR结合使用会产生协同效应，其效果超过了单独使用任何一种包衣剂。与未处理对照组相比，这种复合包衣显著增加了57.1%的植株高度、68.1%的叶面积和59.3%的根面积。从机制上讲，复合包衣并未使内源性EBR水平超过单独使用EBR时的水平，但显著增强了油菜素信号传导。这通过强烈下调BR生物合成基因（GhCPD、GhDWF4）和上调BR响应基因（GhEXPA4、GhXTH1）得到证实。因此，复合包衣显著增强了关键光合作用相关基因的表达，使得GhRBCS1B、GhPSBS、GhPSBH和GhLHCB4.2的转录水平显著升高。此外，复合包衣还分别使净光合率、初始Rubisco活性和叶绿素a含量增加了1.3%、2.6%和3.8%。这些发现表明，复合包衣通过放大BR信号传导，增强了EBR在种子包衣中的效果，从而在一定程度上提高了光合作用能力。这种协同策略为促进棉花早期幼苗的健壮生长提供了一种有前景且高效的方法。

**1. 引言**
幼苗期是作物生命周期中特别脆弱的阶段，是决定后续生长活力、抗逆性和产量潜力的关键时期（Go等人，2024；郭等人，2023b；薛等人，2017）。在棉花中，幼苗经常受到多种非生物和生物胁迫的影响。幼苗活力直接受到根系发育、叶片光合作用和生物量积累的影响——这些因素增强了植物对生物和非生物胁迫（包括寒冷、盐碱以及病虫害）的适应性（Kamburova等人，2022；Sikder等人，2020；Wang等人，2020）。近年来，极端气候事件和不良农艺措施加剧了棉花幼苗期的胁迫，导致弱苗或矮化苗的普遍发生，从而严重限制了产量潜力和经济效益（Tschurr等人，2023；Wang等人，2023；Zhang等人，2022a；Zhang等人，2022b）。因此，开发有效的策略来增强棉花早期幼苗活力具有重要的农艺和经济意义。

传统的建立健壮幼苗的方法通常包括灌溉和施肥管理等农艺干预措施，以及通过种子预处理使用植物生长调节剂（PGRs）（Rehman等人，2015）。然而，这些方法往往只能提供短暂的好处，并且容易受到环境变化的影响。作为一种替代方案，结合PGRs的种子包衣技术因其实用性和有效性而受到关注。这些系统增强了活性化合物的稳定性，并允许发芽幼苗逐渐、可控地吸收（Pedrini等人，2017）。通过在种子表面封装控释制剂中的PGRs，种子包衣实现了靶向和持续释放，从而优化了激素信号传导，促进了均匀且健壮的幼苗发育。24-表油菜素内酯（EBR）作为一种植物生长调节剂，在农业实践中被广泛使用。通过模拟内源性油菜素（BRs）的生理功能，EBR在纳摩尔到微摩尔浓度范围内调节植物生长和胁迫响应（Dobrikova等人，2014）。外源施用EBR已被证明可以增强光合作用性能、刺激细胞伸长和分裂，并改善养分吸收和运输，从而促进植物生长和发育（Tanveer等人，2019）。例如，在番茄叶片上施用10 nM EBR可以显著增加叶绿素含量和光合效率，尤其是在与过氧化氢（H2O2）共同施用时（Nazir等人，2019）。在油菜中，叶片施用EBR可以提高PSII光化学效率和气体交换参数，从而提高39.5%的光合性能（Siddiqui等人，2018）。还有报道指出EBR可以调节磷和钾的吸收，促进根系发育（Cheng等人，2021）。尽管取得了这些有希望的结果，但通过种子包衣在棉花中施用EBR的研究尚未展开，这凸显了农艺实践和植物生理学研究中的关键空白。此外，单一激素处理的有效性常常受到反馈调节和信号放大限制。

为了解决这些限制并实现更持久的幼苗活力和抗逆性改进，综合策略（如将EBR与其他植物激素或预处理剂结合）可能提供更大的效果（Cui等人，2024）。在潜在的候选物质中，海藻酸盐寡糖（AOS）因其已知的生物刺激特性和对植物激素网络的调节作用而特别有前景（郭等人，2023b；Li等人，2025）。AOS是一种低分子量碳水化合物，来源于海藻酸盐的酶解，海藻酸盐是褐藻（如Saccharina japonica）细胞壁中丰富的多糖（Wang等人，2021）。结构上，AOS由β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古洛糖醛酸（G）残基通过1→4糖苷键交替连接而成，其生物活性通常随M/G比例而变化（Liu等人，2019）。AOS被认为是一种具有多种生理和农艺功能的新生物刺激剂。它通过增强生长素生物合成及其极性运输来促进种子萌发和根系发育（Zhang等人，2014）。研究表明，AOS叶片施用可以改善多种作物的耐旱性（Liu等人，2013）。此外，AOS还可以调节内源性激素水平。最近的研究表明，它通过激活茉莉酸（JA）信号通路来促进草莓中花青素的积累（Liu等人，2024）。在盐胁迫下，叶片施用900 mg·L?1 AOS显著增加了脱落酸（ABA）和BRs的水平，从而减少了盐诱导的细胞壁损伤（Du等人，2024）。然而，AOS和EBR之间的潜在协同机制尚未得到充分探索，它们在种子包衣递送系统中的相互作用效应也尚未研究，这在我们对激素相互作用及其在提高幼苗表现中的实际应用的理解上留下了关键空白。

多种PGRs的联合应用可能通过激素相互作用和互补的生理机制产生叠加或协同效应，从而克服单一剂处理的局限性（Ahanger等人，2020；Jia等人，2023）。此外，将PGRs纳入种子包衣制剂中可以实现生物活性化合物的控制和靶向释放，从而提高处理的有效性和持久性。在这项研究中，我们假设将AOS与EBR结合在种子包衣系统中可以增强BR信号传导效率，从而促进棉花早期幼苗的活力。本研究旨在：（1）评估基于种子包衣的AOS和EBR联合应用对棉花幼苗早期生长和发育特征的影响；（2）确定AOS和EBR的最佳组合浓度；（3）探索其背后的生理机制。这项工作的发现有望为开发创新种子包衣技术以改善棉花幼苗活力和早期建立做出贡献。

**2. 材料与方法**
2.1. 植物材料和生长条件
使用的棉花品种是中棉113，该品种在中国广泛种植，由中国农业科学院棉花研究所提供。实验在气候控制室中进行，温度保持在26 ± 2°C，相对湿度为60–70%，光照周期为14小时/10小时（光照/黑暗）。宽谱LED灯提供补充光照，光合光子通量密度（PPFD）为500 μmol m?2 s?1。每种处理的种子播种在塑料盆中（20 cm × 10.6 cm × 12 cm；长×宽×深），每个盆都有排水孔以防止积水。生长介质由2:1（体积比）的泥炭土和粗蛭石混合而成。土壤分析显示pH值为6.5，总氮含量为0.9 ± 0.11 g kg?1，有效磷含量为18.6 ± 1.2 mg kg?1，有效钾含量为82.3 ± 5.9 mg kg?1。
2.2. 实验处理
种子包衣制剂是根据传统种子包衣方法开发的，并针对本实验进行了适当的修改和优化（Pedrini等人，2017；Xie和Xu，2008；Zhang等人，2022a；Zhang等人，2022b）。选择均匀健康的棉花种子进行包衣。如图1A所示，种子包衣制剂包括2%的分散剂、0.1%的润湿剂、8%的增稠剂、1%的抗冻剂、5%的成膜剂、0.5%的消泡剂、适当浓度的AOS和EBR，以及蒸馏水，最终体积为100%。混合物充分混合均匀。该制剂由中国农业大学植物生长调节剂工程研究中心开发。每100克种子用3毫升制剂进行包衣，然后在25°C下风干，以备后续实验使用。

**图1. 棉花种子包衣和萌发过程的示意图。**
(A) 种子包衣混合物包含所有所需成分，包括植物生长调节剂，充分混合后均匀涂在种子表面，并在25°C下风干。
(B) 在萌发过程中，与小麦和玉米不同，棉花种子表现出地上萌发，使种皮抬离土壤表面，从而促进植物生长调节剂从包衣中持续释放。AOS：海藻酸盐寡糖；EBR：24-表油菜素内酯。

采用完全随机区组设计，每种处理8个盆，每个盆播种20粒种子，播种深度为1.5厘米。初步剂量-反应筛选（500、1000、2000、4000和6000 mg L?1 AOS）确定1000 mg L?1 AOS为最佳浓度。为了优化AOS和EBR的组合，测试了1000 mg L?1 AOS与0.0048、0.048、0.48和4.8 mg L?1 EBR的组合，其中1000 mg L?1 AOS + 0.48 mg L?1 EBR的组合表现最佳。基于此，选择了五种处理：CK（无包衣）、空白包衣（不含PGRs的包衣）、单独AOS包衣（1000 mg L?1 AOS）、单独EBR包衣（0.48 mg L?1 EBR）和复合包衣（1000 mg L?1 AOS + 0.48 mg L?1 EBR）。
2.3. 植株高度、叶面积和表型特征的评估
萌发后9天，定期灌溉并测量植株高度。每种处理选择至少10株生长均匀、健康的幼苗进行同时评估。将精度为0.1厘米的尺子垂直固定在每个盆中，“0”刻度对准生长基质表面。从基部到顶端分生组织进行测量。使用DSLR相机记录表型特征。分离的子叶平放在黑色布背景下进行成像，使用ImageJ软件（https://imagej.net/ij/）量化叶面积。
2.4. 预测根面积的测定
根系特征的评估遵循Guo等人（Guo等人，2023a）的方法。将根系浸入水中以松软土壤，然后用软毛刷轻轻清洁。使用PlantIT网络工具（V0.1.1，https://plantit.cyverse.org）分析根表面面积。上传图像，并将参数设置为25.00毫米的刻度和5.00的掩蔽阈值。系统处理图像并输出详细的形态数据。
2.5. qRT-PCR分析
从叶片组织中提取总RNA并逆转录为cDNA。使用TransStart Top Green qPCR SuperMix（TransGen Biotech，北京，中国）在Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR系统上进行定量RT-PCR。热程序为：95°C 5分钟，然后是40个循环，每个循环包括95°C 15秒、60°C 15秒和72°C 20秒。Histone 3（GenBank: AF024716）作为内参。相对表达水平使用2ΔΔCT方法计算。每个基因包括四个生物学重复。本研究中检测的标记基因及其引物序列和其他相关信息列在表S1中。
2.6. 光合率、初始Rubisco活性和叶绿素含量
使用便携式光合作用系统（LI-6800；LI-COR Biosciences，美国林肯）测量净光合率。光照2小时后，在气候室中10:00至12:00之间进行测量。条件标准化为叶片温度25°C和光强度1200 μmol m?2 s?1。使用商业核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶测定试剂盒（Grace Biotechnology，苏州，中国）评估初始Rubisco活性。使用乙醇:丙酮:水混合物（4.5:4.5:1，体积比）在黑暗中提取1克叶片组织中的叶绿素，直至完全脱色，然后通过分光光度法测量吸光度。
2.7. EBR和植物激素含量的测定
萌发后9天采集叶片样本进行植物激素分析。通过液相色谱-质谱（LC–MS）定量EBR含量。每种处理收集50毫克叶片组织（四个重复），并加入内标和提取溶剂。在4°C下以14,000 rpm离心5分钟后，将下层相的1.2 mL液体在氮气保护下蒸发，并重新溶解于甲醇中，用于LC–MS分析（Thermo Fisher Scientific）。由于brassinolide和24-epibrassinolide仅在C-24立体中心上有所不同，因此将两者一起进行测量。内源性ABA、zeatin (ZR)、gibberellic acid (GA?) 和 indole-3-acetic acid (IAA) 的水平是通过间接ELISA方法测定的。新鲜组织（0.5 g）与含有1 mmol L?1 butylated hydroxytoluene (BHT)作为抗氧化剂的80%甲醇5 mL一起在液氮中研磨。混合物在4°C下避光过夜（8小时），然后以4000 rpm离心15分钟。上清液在氮气保护下干燥，并重新溶解于含有0.1% Tween-20和0.1% gelatin的2 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，用于ELISA分析。小鼠单克隆抗体和IgG-HRP由中国农业大学植物生长调节剂工程研究中心提供。

2.8 统计分析
所有数据均记录在Excel 2021（Microsoft Corp., Redmond, USA）中。统计分析使用SPSS 22.0（SPSS Inc., Chicago, USA）进行，采用单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）。处理组之间的显著差异通过最小显著差异（LSD）检验在P < 0.05时确定。图表使用Origin 2021（OriginLab Co., Northampton, USA）生成。

3. 结果
3.1 AOS种子包衣可促进棉花幼苗的根部和茎部生长
为了确定AOS种子包衣的最佳浓度，我们测试了一系列浓度。表型观察显示，随着AOS浓度的增加，地上部分生长最初增加随后下降（图2A, B）。与对照组（CK）相比，1000 mg L?1、2000 mg L?1和4000 mg L?1的AOS种子包衣分别使幼苗高度增加了21.3%、19.3%和15.6%（图2C）。此外，最佳AOS浓度还增强了根系发育并显著增加了根的大小（图2D）。根表面积使用PlantIT（v0.1.1；https://plantit.cyverse.org）进行量化，该软件提供了详细的根形态分析。统计分析显示，含有500 mg L?1、1000 mg L?1、2000 mg L?1和4000 mg L?1 AOS的种子包衣显著增加了预测的根面积，其中1000 mg L?1的种子包衣效果最为显著——比CK增加了120%（图2E）。
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图2. 最佳AOS种子包衣浓度促进棉花幼苗生长。(A) 用不同浓度的AOS处理的种子在土壤中生长11天后。展示了代表性的幼苗。(B) 选出了茎部进行展示，(C) 测量了植物高度。(D) 小心挖掘根部以便观察，(E) 量化了预测的根面积。条形图表示平均值±标准差，茎部特征有10个重复实验，根部特征有4个重复实验。不同字母表示P < 0.05时的显著差异（LSD检验）。

3.2 EBR和AOS的最佳浓度用于种子包衣
接下来，我们评估了与AOS种子包衣结合使用的最佳EBR浓度。棉花种子首先涂上固定的1000 mg L?1 AOS浓度，然后涂上不同浓度的EBR。组合包衣比单独使用AOS或EBR包衣更有效地促进了地上部分的生长（图3A）。与CK相比，单独使用0.048 mg L?1、0.48 mg L?1和4.8 mg L?1 EBR的包衣分别使植物高度增加了21.7%、26.3%和47.7%（图3B和3C）。0.48 mg L?1 EBR和1000 mg L?1 AOS的组合包衣效果最佳，使植物高度相对于CK增加了57.1%，相对于单独使用0.48 mg L?1 EBR包衣和1000 mg L?1 AOS包衣分别增加了24.4%和25.6%。
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图3. 筛选EBR和AOS的最佳浓度用于种子包衣。(A) 棉花种子涂上不同组合的EBR和AOS。播种后11天观察幼苗表型。(B) 在不同处理下量化植物高度。(C) 展示代表性的茎部。条形图表示平均值±标准差，有10个重复实验。不同字母表示P < 0.05时的显著差异（LSD检验）。AOS，藻酸盐寡糖；EBR，24-epibrassinolide。

3.3 AOS和EBR组合种子包衣对棉花幼苗生长的协同效应
为了评估AOS和EBR组合种子包衣的协同效应，我们比较了单独应用和组合应用的处理效果。空白包衣（不含植物生长调节剂）对幼苗生长没有影响，而1000 mg L?1 AOS和0.48 mg L?1 EBR单独使用都促进了地上部分的生长。组合包衣产生了更显著的效果（图4A）。与CK相比，单独使用AOS和EBR时，叶面积分别显著增加了29.6%和42.4%，而组合包衣进一步分别增加了29.8%和18.1%（图4B, C）。同样，组合包衣使植物高度增加了最多，分别超过了单独使用AOS和EBR16.0%和12.8%（图4D, E）。根系发育分析显示，空白包衣没有变化，而单独使用AOS和EBR分别使预测的根面积增加了54.1%和19.5%（图4F, G）。AOS对根部的作用比EBR更强，但组合使用带来了最显著的改善——相对于CK增加了59.3%（图4G）。
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图4. AOS、EBR及其组合对棉花幼苗生长的影响。(A) 单独和组合使用AOS和EBR的表型表现。(B) 叶子表型。(C) 叶面积测量。(D) 代表性的茎部图像。(E) 植物高度测量。(F) 根部可视化。(G) 预测的根面积量化。条形图表示平均值±标准差（n = 12用于叶面积，n = 30用于植物高度，n = 4用于根部特征）。不同字母表示P < 0.05时的显著差异（LSD检验）。AOS，藻酸盐寡糖；EBR，24-epibrassinolide。

3.4 AOS和EBR组合种子包衣通过调节光合作用和植物激素增强幼苗生长
AOS和EBR组合种子包衣进一步增强了BR信号传导。与单独使用相比，空白包衣和单独使用AOS均未显著影响根部的EBR水平，而0.48 mg L?1 EBR单独使用和组合包衣分别使根部的EBR含量增加了12.7%和10.2%（图5A）。在叶子中，单独使用0.48 mg L?1 EBR和组合包衣使EBR积累分别增加了134.7%和128.9%（图5B），尽管这两种处理之间的差异没有统计学意义。升高的EBR水平激活了BR信号通路。BR生物合成基因GhCPD和GhDWF4在单独使用EBR和组合包衣下分别下调了43.8%和72.0%，GhCPD的表达分别下降了33.2%和55.4%（图5C, D）。同时，BR响应基因GhEXPA4和GhXTH1在单独使用0.48 mg L?1 EBR包衣下显著上调，分别增加了309.2%和138.1%。然而，组合包衣产生了最大的诱导效果——GhEXPA4和GhXTH1相对于CK分别增加了617.9%和189.6%，相对于单独使用EBR分别增加了75.4%和21.6%（图5E, F）。
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图5. AOS和EBR组合种子包衣通过调节光合作用和植物激素增强BR信号传导。(A) 根部和叶子中的EBR含量，通过LC–MS量化，该技术可以检测到brassinolide和24-epibrassinolide，因为它们的立体化学结构相似。(C–F) BR信号相关基因的相对表达。条形图表示平均值±标准差，有4个重复实验。不同字母表示P < 0.05时的显著差异（LSD检验）。AOS，藻酸盐寡糖；EBR，24-epibrassinolide。

3.5 AOS和EBR组合种子包衣通过调节光合作用和植物激素实现强健的幼苗
AOS和EBR组合种子包衣通过调节光合作用和植物激素显著增强了棉花幼苗的关键生理过程（图6）。首先，光合作用表现得到了改善。与光合作用相关的标记基因（GhRBCS1B、GhPSBS和GhPSBH）的表达在单独使用AOS或EBR时显著上调，而组合包衣的效果最为显著——分别增加了295.2%、825.5%和127.6%（图S1A–C）。GhLHCB4.2的表达在单独处理下没有变化，但在组合包衣下显著增加（图S1D）。相应地，组合包衣使净光合速率分别相对于CK、单独使用AOS和EBR增加了8.6%、2.3%和1.3%（图S2A）。对于初始Rubisco活性和叶绿素a含量，组合包衣产生了最高的值，分别相对于CK增加了55.0%和6.9%（图S2B, C），而对叶绿素b没有显著影响（图S2D）。此外，与单独使用EBR相比，组合包衣进一步分别增加了初始Rubisco活性和叶绿素a含量2.6%和3.8%。其次，组合包衣显著改变了叶子中的植物激素平衡。与CK相比，单独使用0.48 mg L?1 EBR使GA?含量增加了12.0%，而组合包衣进一步增加了12.7%（图S3A）。同样，IAA水平在组合包衣下增加了31.1%（图S3B）。相比之下，ZR水平保持不变。然而，与CK相比，组合包衣显著降低了ABA水平37.2%（图S3C, D）。尽管组合包衣显著影响了GA?、IAA和ABA，但其趋势与单独使用EBR的处理一致，表明AOS和EBR在调节内源性植物激素方面没有协同作用。
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图6. AOS和EBR组合种子包衣通过调节光合作用和植物激素促进幼苗的旺盛生长。协同包衣增强了BR信号传导，导致叶绿素a含量、Rubisco活性和净光合速率的增加。它还通过提高GA?和IAA水平以及降低ABA含量来调节内源性激素。热图显示了所有测量参数的平均值（n ≥ 4）。AOS，藻酸盐寡糖；EBR，24-epibrassinolide；GA?，gibberellin A?；IAA，indole-3-acetic acid；ZR，zeatin riboside；ABA，abscisic acid。

4. 讨论
旺盛的幼苗发育增强了作物对生物胁迫（例如病原体感染和害虫攻击）和非生物胁迫（例如干旱、盐度和极端温度）的抵抗力，同时也为器官分化、产量形成和品质提升奠定了关键的生理基础（Bernaola和Stout, 2021；Guo等人，2023a；Guo等人，2023b；Joubert等人，2024；Ponce-Figueroa等人，2024）。与小麦和玉米等谷物作物典型的地下（胚芽鞘基）萌发不同，棉花表现出地上萌发，其中下胚轴的伸长将子叶推到土壤表面以上（图1B）。这种独特的发育模式为种子包衣剂的控制和逐渐释放提供了独特的时空窗口。因此，我们开发了一种新的种子包衣配方，结合了藻酸盐寡糖（AOS）和24-epibrassinolide（EBR），通过同步和持续的释放，协同增强了它们的生物活性，从而促进了早期幼苗的活力和生理健壮性。包衣基质确保了AOS和EBR在萌发和早期生长过程中的均匀附着和可控释放——这些优势是简单的非包衣应用（例如直接浸泡或喷洒而不使用成膜剂）无法可靠实现的，因为这些方法会导致活性化合物的保留不良、分布不均和快速损失。先前的研究表明，将种子浸泡在AOS中可以通过调节光合作用效率和根部养分吸收来促进大麦幼苗的生长（Yang等人，2021）。在本研究中，不同浓度的AOS包衣显著促进了棉花幼苗的茎部和根部生长，其中1000 mg L?1的AOS表现出最显著的效果（图2）。此外，据报道EBR可以改善种子萌发、幼苗生长和抗氧化能力（Semida和Rady，2014；Sharma等人，2016；Yang等人，2025）。基于1000 mg L?1 AOS包衣的最佳表现，我们筛选了最有效的EBR浓度。1000 mg L?1 AOS和0.48 mg L?1 EBR的组合包衣显示出协同效应，显著优于单独使用任何一种处理（图3）。在农业实践中，植物性状通常受多种相互作用因素的调节，单一生长调节剂的效果往往是有限的（Garnier和Navas，2012；Rademacher，2015）。因此，结合多种植物生长调节剂可以通过激素间的相互作用和互补的生理机制产生叠加或协同效应，可能克服单一剂处理的局限性（Ahanger等人，2020；Jia等人，2023）。与此概念一致，1000 mg L?1 AOS和0.48 mg L?1 EBR的组合包衣显著增强了叶面积、植物高度和根表面积，其改善效果超过了单独处理（图4）。这种增强效果超出了简单的叠加预期，表明AOS可能增强了幼苗对EBR的生物响应性，而不仅仅是提供独立的生长促进效果。外源施用的EBR容易被植物吸收（Janeczko和Swaczynová，2010；Marková等人，2023）。在本研究中，棉花幼苗的生长受到种子包衣在早期生长阶段释放的EBR的影响（图5A和B）。尽管单独使用EBR和组合包衣都提高了组织中的BR水平，但在这两种处理之间没有检测到EBR积累的显著差异。BR信号激活会启动一个负反馈循环，从而下调与BR生物合成相关的基因（Mathur等人，1998年；Percio等人，2025年）。然而，在联合涂层处理下，BR生物合成基因GhCPD和GhDWF4的转录抑制作用显著增强（图5C和D）。鉴于BR生物合成基因在通路激活时受到负反馈调节，这些基因的增强抑制表明BR信号强度更高，而不是激素含量本身增加。在联合涂层处理下，GhEXPA4和GhXTH1的显著上调进一步揭示了其机制（图5E和F）。这些基因编码参与细胞壁松弛和重塑的蛋白质，这是下胚轴伸长和叶片扩展的关键过程（Zhang等人，2024年）。值得注意的是，AOS本身在结构上与细胞壁多糖相关，并且已有报道指出它会影响其他系统中的细胞壁代谢（Du等人，2024年）。因此，可以合理假设AOS可能增强细胞壁的可塑性，从而使BR诱导的转录程序更有效地转化为细胞扩展。在这个框架下，EBR提供激素生长信号，而AOS增强了组织执行该信号的物理和结构适应性。这种功能互补性可以解释为什么联合处理能够产生更强的BR响应基因诱导和更优的形态结果。EBR已被证明在应激和非应激条件下都能产生广泛的生理效应，它是叶绿体发育、光系统稳定性和碳同化的已知调节因子（Ali等人，2008年；Dobrikova等人，2014年；Yue等人，2019年）。与这一已知作用一致，联合涂层处理上调了关键的光合作用相关基因，包括GhRBCS1B、GhPSBS、GhPSBH和GhLHCB4.2（图6）。此外，联合涂层显著提高了光合作用相关指标，包括净光合速率和初始Rubisco活性，优于单独使用任何一种涂层。然而，尽管单独使用EBR与联合涂层在初始统计上没有差异，但联合涂层在所有指标上均表现出一致的上升趋势，这可能表明存在叠加效应。由于EBR作为关键激素的强烈促进作用，单独使用EBR与联合涂层在光合作用上没有显示出统计学上的显著差异。因此，未来需要更大样本量的研究来更稳健地验证联合涂层的协同效应。内源性植物激素的分析显示，在联合涂层处理下，GA?和IAA水平升高，ABA水平降低（图S3）。这些激素变化与先前研究一致，这些研究表明外源EBR可以调节植物激素的平衡（Talaat，2020年）。然而，在联合涂层处理下，AOS和EBR对激素变化没有表现出协同效应。不过，数据初步表明AOS和EBR对特定激素有不同的主要影响。例如，AOS主要提高棉花幼苗中的GA?和IAA水平（图S3A和B），而EBR主要有助于降低ABA水平（图S3D）。总体而言，AOS和EBR的协同作用通过放大BR信号并协调提高光合效率，促进了棉花幼苗的健壮生长。5. 结论本研究证明，用藻酸盐寡糖（AOS）和24-表油菜素内酯（EBR）对种子进行涂层处理可以通过增强光合效率以及促进茎、根和叶的发育来提高棉花幼苗的活力。这种双重处理通过上调BR响应基因（GhEXPA4和GhXTH1）同时下调BR生物合成相关基因（GhCPD和GhDWF4）显著增强了BR信号。它还在一定程度上提高了光合能力，表现为净光合速率、Rubisco活性和叶绿素含量的增加。此外，联合涂层通过提高GA?和IAA水平并降低ABA水平改善了植物激素的平衡，共同促进了强壮健康幼苗的建立。在所有测试的处理方法中，1000 mg L?1 AOS和0.48 mg L?1 EBR的组合效果最为显著，超过了单独使用任一成分的效果。这些发现突显了AOS和EBR协同涂层作为提高棉花幼苗活力和整体作物生产力的有前景的创新策略的潜力。作者贡献声明：Zhang Liming：概念构思；Yang Zuoren：写作-审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思；Li Zhongxian：监督、资金获取；Yang Han：实验研究；Guo Yuling：写作-审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、资金获取、概念构思；Mo You：初稿撰写；Liu Le：写作-审稿与编辑；Fan Liqiang：概念构思；Qanmber Ghulam：写作-审稿与编辑、初稿撰写。伦理要求遵守：本文不涉及任何涉及人类或动物的实验。