CqGSA1通过协同调节脱落酸和赤霉素的作用，在钠碱胁迫下促进藜麦种子的萌发

《Industrial Crops and Products》：CqGSA1 enhances quinoa seed germination under sodium-alkali stress through the synergistic regulation of abscisic acid and gibberellin

　　周善民|史盼盼
山西师范大学生命科学学院，太原，中国

**摘要**
为了研究藜麦对盐胁迫和盐碱复合胁迫的响应机制，本研究通过表型生理检测、转录组测序、加权基因共表达网络分析（WGCNA）和基因功能验证，系统分析了其耐盐和耐碱性的分子调控网络。结果表明，NaCl和NaCl+NaHCO3胁迫均抑制藜麦种子萌发，并破坏Na?/K?平衡，而复合胁迫由于离子间的协同作用和高pH值表现出更强的抑制效应。胁迫显著重塑了藜麦的基因表达模式，差异表达的基因聚类到涉及信号响应和代谢维持等核心功能的模块中。WGCNA筛选出耐盐碱性的核心共表达模块，并确定了枢纽基因CqGSA1。功能验证证实CqGSA1是藜麦耐盐性的正向调节因子，它通过协调ABA-GA激素平衡和维持离子平衡来增强耐盐性。其表达受到盐胁迫和ABA/GA3信号通路的双重调控，使其成为连接盐胁迫下激素信号与种子萌发的关键节点。本研究发现了藜麦耐盐性的新分子靶点，为该作物的大规模工业应用奠定了坚实基础。

**1. 引言**
藜麦（Chenopodium quinoa Willd.）因其全面的营养成分和出色的耐逆性而被视为一种具有巨大潜力的多功能生物质原料（Filho等人，2017年）。其种子富含天然大分子，如淀粉、储存蛋白和皂苷，在生物降解包装膜、生物复合材料、纳米载体和绿色表面活性剂等工业应用中具有显著优势（Abugoch James，2009年；Pathan和Siddiqui，2022年）。藜麦淀粉颗粒细腻，具有优异的成膜性能，经过物理或化学改性后可用于制备高透明度和柔韧性的生物降解薄膜（Ren等人，2023年）。藜麦蛋白具有均衡的氨基酸组成和良好的凝胶化特性，适合作为生物基载体和复合薄膜基底（Vera等人，2020年）。种子中的皂苷具有天然的表面活性，可用于环保乳化系统和生物基界面材料（El Hazzam等人，2020年；Jurek等人，2019年）。然而，藜麦基生物材料的大规模应用高度依赖于稳定和可持续的原材料供应（Jurek等人，2019年）。全球范围内盐碱化耕地的广泛存在为藜麦种植提供了广阔的空间。然而，藜麦在种子萌发阶段对盐胁迫和碱胁迫非常敏感。高盐环境会显著降低萌发率，延缓萌发过程，并直接影响种子中淀粉和蛋白质等储存物质的合成和积累（Mi?o等人，2025年；Yan、Nie、Cui和Sun，2022年）。先前的研究表明，盐碱胁迫不仅会降低藜麦的出苗率和生物量，还会改变种子内部成分的比例和结构特性（Gómez-Caravaca等人，2012年），从而导致随后制备的生物基材料的机械性能、阻隔性能和降解行为出现显著波动，严重限制了其工业化应用（Aloisi等人，2016年；Panuccio等人，2014年）。此外，植物种子萌发是一个由多种信号调控的复杂过程，其中脱落酸（ABA）和赤霉素（GA）之间的拮抗平衡是核心调控机制（Collin和Daszkowska-Golec，2025年；Shu等人，2016年；Xing等人，2023年）。在盐碱胁迫下，植物会积累大量ABA以诱导种子休眠并抑制萌发；相反，GA促进胚乳分解和下胚轴伸长，从而推动萌发过程（He等人，2022年）。ABA和GA的生物合成和信号转导的动态平衡对于决定胁迫下的种子萌发性能至关重要（L. Chen等人，2021年；Shu等人，2017年）。因此，通过外源调控或生理预处理策略提高藜麦在盐碱胁迫下的萌发效率和种子活力对于稳定原材料产量和保证种子质量至关重要。改善盐碱胁迫下的种子萌发不仅可以扩大藜麦在边际土地的种植范围，提高原材料供应的可持续性，还能最大限度地保留种子中天然大分子的结构和功能特性，为高性能和均匀的生物基材料的发展提供稳定的原材料基础（Hussain等人，2018年；Qian等人，2024年）。总之，本研究以藜麦为研究对象，系统分析了单一盐胁迫和复合盐碱胁迫对藜麦种子萌发和离子平衡的影响。结合加权基因共表达网络分析（WGCNA）筛选出与盐碱胁迫下藜麦种子萌发相关的核心共表达模块和枢纽基因。通过拟南芥中的异源过表达验证了关键枢纽基因CqGSA1的功能，并阐明了其在盐碱胁迫下调控藜麦种子萌发的分子机制——即调节ABA-GA生物合成和信号转导的平衡以及维持Na?/K?平衡。本研究旨在揭示藜麦种子萌发过程中的盐碱耐受性分子机制，为其耐逆性改良提供遗传资源，从而稳定原材料供应并支持基于藜麦的生物基材料的可持续应用。

**2. 结果**
**2.1. 盐胁迫和盐碱复合胁迫显著抑制种子萌发并破坏离子平衡**
为了明确盐胁迫（NaCl）和复合盐碱胁迫（NaCl+NaHCO3）对种子萌发的不同影响，将种子分别置于对照（CK）、NaCl和NaCl+NaHCO3处理组。连续24小时监测表型和生理指标。表型观察显示，在胁迫条件下种子萌发显著减少，其中NaCl+NaHCO3组的抑制效应最明显（图1A）。萌发率的时间过程分析进一步量化了这一差异：对照组种子在处理开始后4小时开始萌发，24小时时萌发率超过90%；而NaCl处理组的萌发被延迟至6小时，24小时时最大萌发率仅约为30%；NaCl+NaHCO3组在处理后10小时内几乎没有萌发，实验结束时萌发率仅为约5%（图1B）。关键萌发参数的统计分析证实了胁迫类型的剂量依赖性抑制效应：对照组最终的萌发率（图1C）、萌发活力（图1D）和种子活力指数（图1E）均显著高于胁迫组。值得注意的是，与单独的NaCl胁迫相比，NaCl+NaHCO3胁迫对这些指标的抑制更为严重。例如，NaCl胁迫使最终萌发率相对于对照组降低了约35%，而复合盐碱胁迫则降低了超过90%。

**2.2. 藜麦在NaCl和NaCl+NaHCO3胁迫下的转录组响应特征**
为了探究这些表型差异的分子机制，我们在处理后5小时、10小时和20小时对种子进行了转录组测序分析。基因表达密度分布显示，所有处理组的基因表达水平（log??(FPKM)）呈现典型的单峰分布。然而，胁迫处理显著改变了分布曲线，表明胁迫显著重塑了藜麦的整体基因表达模式。基于样本相关性的层次聚类显示，同一处理内的生物重复样本紧密聚集，皮尔逊相关系数保持较高水平，证实了转录组数据的可重复性和可靠性。同时，样本根据处理类型（CK、NaCl、NaCl+NaHCO3）和时间点（5小时、10小时、20小时）形成了不同的分支。NaCl+NaHCO3复合胁迫组与对照组和单一NaCl胁迫组的分离更为明显，表明复合胁迫引发了更为独特的转录响应（图2B）。主成分分析（PCA）进一步验证了这些趋势：前两个主成分（PC1和PC2）分别解释了约45%和20%的转录组变异。样本沿PC1轴明显分为三个主要组：对照组、NaCl胁迫组和NaCl+NaHCO3复合胁迫组。PC2轴主要反映了时间点的差异，表明胁迫类型是转录组变异的主要驱动因素（图2C）。差异表达基因（DEGs）的热图分析显示，胁迫处理引起了显著的基因表达变化，具有特定的处理模式：与对照组相比，单一NaCl胁迫下的DEGs数量相对较少，表达变化较为温和；而NaCl+NaHCO3复合胁迫下的DEGs数量显著增加，上调和下调基因的分布范围更广。此外，一些基因模块仅在复合胁迫下表现出显著的表达变化，表明这些基因可能参与了藜麦对高pH值和离子胁迫的特异性响应（图2D）。

**2.3. 藜麦在NaCl和NaCl+NaHCO3胁迫下的基因聚类模式和功能富集特征**
为了进一步阐明NaCl和NaCl+NaHCO3胁迫下差异表达基因（DEGs）的动态表达模式和核心功能，我们对鉴定出的DEGs进行了表达模式亚聚类，并对每个亚簇内的基因进行了KEGG通路富集分析。根据基因表达的时间动态，将DEGs分为四个核心亚簇（图3A–C）：subcluster_1包含1681个基因，在CK条件下初始上调，随后在10小时至20小时之间迅速下降；subcluster_3仅包含266个基因，在CK条件下表达迅速下调，而在胁迫条件下迅速上调；subcluster_4包含899个基因，在整个胁迫期间持续中等程度上调。这些结果揭示了藜麦在盐碱胁迫下的分子机制，为后续鉴定耐盐基因和调控途径提供了依据。在盐碱胁迫下的基因表达模式和通路富集特征（A–C）差异表达基因（DEGs）的表达模式聚类。(A) subcluster_1（1681个基因）、(B) subcluster_3（266个基因）和(C) subcluster_4（899个基因）的基因表达趋势。灰线代表单个基因的对数2(FPKM)表达值，蓝线表示子簇平均表达趋势，红色水平线表示零表达基线。样本按处理（CK、NaCl、NaCl+NaHCO3）和时间点（5小时、10小时、20小时）排序。(D–F) 气泡图显示了subcluster DEGs的KEGG通路富集分析。气泡大小表示在通路中富集的基因数量；颜色表示富集显著性（p.adjust，红色表示高显著性）。x轴表示富集因子（富集因子 = 通路中差异表达基因的数量 / 通路中基因的总数）。KEGG通路富集分析揭示了每个子簇中基因的功能特异性（图3D–F）：subcluster_1基因在包括MAPK信号传导、植物激素信号传导（特别是赤霉素信号传导）、黄酮类生物合成和吲哚生物碱合成在内的通路中显著富集。富集显著性和基因数量都很高，表明这些基因主要参与种子萌发过程中的快速响应过程，如激素信号感知和转导以及次级代谢调节。subcluster_3基因在包括光合作用、线粒体修复、叶酸生物合成和ABA合成在内的通路中特异性富集。结合其稳定的表达模式，这些基因可能在维持细胞基础代谢和修复胁迫损伤、促进种子内ABA合成和休眠方面起核心作用；subcluster_4基因在与类固醇和二萜类代谢、脂肪酸延长、淀粉和蔗糖代谢以及苯丙素生物合成相关的通路中广泛富集。同时富集在防御通路中，如谷胱甘肽代谢和植物-病原体相互作用，表明这些基因主导了藜麦的碳代谢重编程和长期防御反应。总之，藜麦在NaCl和NaCl+NaHCO3胁迫下的DEGs表现出不同的子簇表达模式。不同子簇中的基因执行核心功能，包括信号响应、基础代谢维持和代谢重编程。其中，参与赤霉素信号转导和ABA生物合成的基因值得进一步关注，而与代谢相关的基因子簇在整个响应过程中占主导地位。这些发现为阐明藜麦耐盐和耐碱性的层次调节机制提供了核心分子证据。

2.4. 基于WGCNA鉴定藜麦对盐碱胁迫响应的核心共表达模块和枢纽基因
为了在系统层面解码藜麦在NaCl和NaCl+NaHCO3胁迫下的协同基因调控模式，并鉴定控制盐碱耐受性表型的核心基因集，我们基于全基因组表达矩阵进行了加权基因共表达网络（WGCNA）分析。整合先前的生理表型数据，我们鉴定了与胁迫响应和离子稳态相关的核心模块和枢纽基因。通过全基因组基因的层次聚类和使用动态树切割进行模块划分，鉴定出多个具有不同表达模式的共表达模块。不同颜色的条带清晰地划分了每个模块，而同一模块内的基因在层次聚类树中表现出高聚类密度，表明相似的表达调控模式（图4A）。模块与胁迫处理时间之间的相关性分析显示了对胁迫类型和持续时间的不同特异性：一些模块与NaCl+NaHCO3联合胁迫（特别是在5小时时）显著正相关，与对照组负相关；而其他模块与单独的NaCl胁迫或晚期胁迫阶段（20小时）有特定关联，表明不同模块在不同胁迫类型和响应阶段介导转录调控（图4B）。

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图4. 基因共表达模块和枢纽基因（A-F）藜麦胁迫响应的加权基因共表达网络（WGCNA）分析。(A) 基于全基因组表达谱的层次聚类树，下方的彩色条带代表由WGCNA划分的共表达模块，不同颜色表示不同的模块。(B) 热图显示共表达模块与处理/时间特征之间的相关性，颜色渐变表示皮尔逊相关系数（红色表示正相关，蓝色表示负相关）。(C) 共表达模块与关键生理特征（例如，发芽率、种子面积和根长）之间的相关性热图。单元格值表示相关系数和显著性P值。(D) 每个共表达模块内基因的表达模式热图。行代表基因，列代表样本（按处理和时间点排序），颜色表示log2(FPKM)表达值。(E) 模块显著性条形图显示模块与目标盐耐受性特征之间的整体相关性；绿色条形高度表示显著性水平。(F) 关键模块中核心基因的共表达网络；红色节点代表枢纽基因，灰色线条表示基因之间的共表达相互作用。

进一步分析共表达模块与关键生理特征（发芽率、种子面积和根长）的关联，鉴定出一个与盐耐受性高度相关的核心模块（ME turquoise）：该模块与发芽率显著正相关，与Na+/K+比率显著负相关，而其他模块与生理特征的相关性较低（图4C）。跨模块的基因表达模式热图验证了这些关联：核心模块中的基因在对照组中持续高表达，在NaCl胁迫下显著下调，并在NaCl+NaHCO3联合胁迫下进一步显著下调——这一趋势与发芽率的变化完全一致。非核心模块显示出与胁迫响应无关的组成性表达模式或特定的时间表达模式（图4D）。使用ME turquoise对模块显著性进行定量分析进一步确认了该核心模块的生物学相关性，其显著性值显著高于所有其他模块，表明该模块内的基因与藜麦发芽表型之间有最强的整体关联（图4E）。该模块包含总共4861个基因。对核心模块内共表达网络的拓扑分析鉴定了具有最高模块内连接性的枢纽基因。这些基因在网络中占据中心位置，其中AUR62008293（盐碱条件下种子发芽1，GSA1）与模块内的许多基因具有共表达相互作用（图4F）。

研究表明，WGCNA分析成功鉴定了藜麦对盐碱胁迫响应的核心共表达模块。该模块与种子发芽和离子稳态密切相关，并鉴定出一个关键枢纽基因AUR62008293（GSA1），可能调节盐碱耐受性过程。这为解码藜麦耐盐碱条件的分子调控网络和鉴定候选功能基因提供了重要基础。

2.5. CqGSA1过表达增强藜麦在盐碱条件下的种子发芽耐受性
为了验证藜麦CqGSA1在植物耐盐碱响应中的作用，我们在拟南芥野生型（Col-0）中过表达了CqGSA1，并获得了两个独立系（35S-CqGSA1#1和35S-CqGSA1#2）。我们系统地比较了野生型和过表达系在对照（CK）、NaCl胁迫以及NaCl+NaHCO3联合胁迫条件下的发芽和生理参数。在对照条件下，野生型和过表达系在发芽率、相对发芽率、发芽活力、发芽指数或种子活力方面没有显著差异，表明CqGSA1过表达不影响拟南芥的正常种子发芽（图5A–E）。在NaCl胁迫下，野生型的发芽相关参数显著下降，而过表达系的发芽率、活力和种子活力显著高于野生型。在NaCl+NaHCO3联合胁迫下，野生型的发芽能力受到更严重的抑制。相比之下，过表达系的发芽水平保持较高，发芽率和种子活力显著优于野生型。这表明CqGSA1过表达显著增强了拟南芥在单一盐胁迫和联合盐碱胁迫下的种子发芽能力。脱落酸（ABA）和赤霉素（GA3）是调节种子发芽的关键激素。在对照条件下，野生型和过表达系之间的ABA和GA3浓度没有显著差异（图5F，G）。在NaCl胁迫下，野生型的ABA浓度显著增加，而GA3浓度显著下降；相比之下，过表达系的ABA浓度显著低于野生型，GA3浓度显著升高。在NaCl+NaHCO3联合胁迫下，这些激素差异进一步扩大：野生型的ABA浓度显著增加，而GA3浓度进一步下降；相比之下，过表达系的ABA水平较低，GA3水平较高，表明CqGSA1过表达通过调节ABA/GA3平衡缓解了胁迫引起的种子发芽抑制。

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图5. 藜麦CqGSA1过表达增强拟南芥对NaCl和NaCl+NaHCO3胁迫的耐受性
(A) 拟南芥野生型（Col-0）和两个独立的CqGSA1过表达系（35S-CqGSA1#1，35S-CqGSA1#2）在对照（CK，蒸馏水）、NaCl胁迫（100 mmol/L NaCl）和NaCl+NaHCO3联合胁迫（75 mmol/L NaCl + 25 mmol/L NaHCO3，pH 8.5）下的表现。种子发芽率（A）；相对发芽率（B）；发芽活力（C）；发芽指数（D）；种子活力（E）；脱落酸（ABA）浓度（F）；赤霉素（GA3）浓度（G）；(H) Na+含量；(I) Na+/K+比率；(J) Na+积累（mg）。不同的小写字母表示同一处理下不同系之间的显著差异（P < 0.05，单因素ANOVA，Duncan's多重范围测试）。数据以平均值±标准误差表示（n = 3）。

离子稳态失衡是抑制植物生长的关键因素。在对照条件下，野生型和过表达系之间的Na+含量、Na+/K+比率或Na+积累没有显著差异（图5H–J）。在NaCl胁迫下，野生型的Na+含量、Na+/K+比率和Na+积累显著升高，而过表达系的这些参数显著低于野生型。在NaCl+NaHCO3联合胁迫下，野生型的Na+积累进一步加剧，而过表达系的Na+含量和Na+/K+比率增加显著低于野生型。这表明CqGSA1过表达有效减少了Na+积累，维持了离子稳态，从而增强了拟南芥对盐胁迫的耐受性。总之，藜麦CqGSA1的过表达通过调节植物激素平衡（降低ABA，维持GA3）和离子稳态（减少Na+积累）显著增强了拟南芥对NaCl和NaCl+NaHCO3胁迫的耐受性。这种耐受性的提高在联合盐碱胁迫下尤为明显，表明CqGSA1是藜麦盐碱胁迫响应中的关键调节基因。

2.6. CqGSA1协调ABA-GA平衡并重塑胁迫下的发芽调控网络
种子发芽的核心调控机制在于脱落酸（ABA）和赤霉素（GA）之间的拮抗平衡。为了阐明CqGSA1增强拟南芥耐盐和耐碱性的分子基础，我们重点分析了ABA和GA信号通路中关键基因的表达模式。我们发现CqGSA1通过双重调节这两个通路显著缓解了胁迫对种子发芽的抑制作用。在胁迫条件下，参与GA合成的GA3ox2基因的表达显著高于野生型（图6A）。此外，在对照（CK）条件下，GA信号的关键负调节因子RGL2和GA响应基因（GASA6、EXP2）在野生型（Col-0）和CqGSA1过表达系之间的表达水平没有显著差异（图6B–D）。

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图6. 藜麦CqGSA1过表达调节拟南芥在胁迫下的ABA-GA3基因
(H) 拟南芥野生型（Col-0）和CqGSA1过表达系（35S-CqGSA1#1，35S-CqGSA1#2）中胁迫响应相关基因的相对表达水平：(A) GA3ox2；(B) RGL2；(C) GASA6；(D) EXP2；(E) ABI5；(F) EM1；(G) ABI3；(H) EM6。Actin2用作参考基因。条形图中的不同小写字母表示相同处理下系之间的显著差异（P < 0.05，单因素ANOVA，Duncan's多重范围测试）。数据以平均值±标准误差表示（n = 3）。

在NaCl胁迫下，过表达系的RGL2表达显著低于野生型植物，而GA响应基因GASA6和EXP2的表达显著升高。这表明CqGSA1通过抑制RGL2来缓解GA信号抑制，从而激活下游的发芽促进通路。在NaCl+NaHCO3联合胁迫下，这种调控效应进一步放大：RGL2的表达显著下调，而GASA6和EXP2的表达显著上调。这表明在更严重的联合胁迫下，CqGSA1在激活GA信号中的作用变得更加关键，直接驱动了胁迫下的种子发芽能力增强。ABA是种子发芽的核心抑制激素，其信号传导依赖于ABI5和ABI3等关键转录因子。这些因子通过激活下游响应基因（例如EM1）来维持种子休眠并抑制发芽。在对照条件下，野生型和过表达系之间的ABA信号通路基因表达没有显著差异（图6E–G）。在NaCl胁迫下，过表达系中ABI5、ABI3和EM1的表达水平显著低于野生型，表明CqGSA1通过抑制ABA信号传导的核心组分减弱了ABA对萌发的抑制作用。在NaCl+NaHCO3联合胁迫下，ABA信号基因的下调趋势更加明显。过表达系中ABI5、ABI3和EM1的表达水平远低于野生型，这与野生型ABA含量显著升高而过表达系ABA含量显著降低的生理表型完全一致。这表明CqGSA1在转录水平上抑制ABA信号传导，从而缓解了胁迫引起的休眠效应。总体而言，CqGSA1不仅调节单一激素途径，还通过同时增强GA信号传导和减弱ABA信号传导来根本性地重塑ABA-GA的拮抗平衡。这种双重调节使过表达系在促进萌发的同时有效降低ABA信号强度，从而克服NaCl和NaCl+NaHCO3胁迫下的休眠抑制。因此，它们的萌发能力显著优于野生型植物。这种调节模式与观察到的生理表型高度一致：在胁迫条件下，过表达系的ABA含量显著降低，GA?含量显著升高。这些激素变化直接源于CqGSA1对ABA和GA信号传导途径的转录调控。

2.7. ABA和GA通过协同作用调节CqGSA1，影响藜麦种子在盐碱条件下的萌发。通过VIGS技术生成了CqGSA1沉默系（VIGS-CqGSA1），其CqGSA1的相对表达水平降低到对照（VIGS-CK）的约20%（图7A），证实了基因沉默的有效性和稳定性。在正常条件下，VIGS-CK和VIGS-CqGSA1之间的种子萌发率、种子活力以及ABA和GA?含量没有显著差异（图7B–E），表明CqGSA1的沉默并未影响种子的基本生理稳态。在盐碱胁迫后，两系的萌发率和活力均下降，ABA含量增加，GA?含量减少。此外，VIGS-CqGSA1的萌发率、活力和GA?含量显著低于对照，表明CqGSA1是藜麦种子耐盐碱性的正向调节因子，其缺失会加剧胁迫引起的萌发抑制和ABA/GA3的激素失衡。NaCl+NaHCO3胁迫显著抑制了种子萌发和活力，并破坏了ABA/GA?的稳态（图7F–I）。

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图7. ABA和GA通过协同作用调节CqGSA1，影响藜麦种子在盐碱条件下的萌发
(A) 不同处理下VIGS-CK和VIGS-CqGSA1的种子萌发率；
(B) 不同处理下VIGS-CK和VIGS-CqGSA1的种子活力；
(C) 不同处理下VIGS-CK和VIGS-CqGSA1种子中的ABA含量；
(D) 不同处理下VIGS-CK和VIGS-CqGSA1种子中的GA?含量；使用双因素方差分析和独立样本t检验进行分析（n=3）。
(E) 不同处理下的种子萌发率（CK、NaCl+NaHCO3、NaCl+NaHCO3+FLU、NaCl+NaHCO3+PAC、NaCl+NaHCO3+FLU+PAC）；
(F) 不同处理下的种子活力；
(G) 不同处理下的种子ABA含量；
(H) 不同处理下的种子GA?含量；使用单因素方差分析和Duncan多重范围检验（n=3）。不同小写字母表示组间差异显著（p<0.05）。FLU：氟啶酮（10 μM）；PAC：戊唑醇（50 μM）。
FLU（ABA生物合成抑制剂）处理降低了ABA含量，恢复了GA?水平，并显著减轻了胁迫损伤，而PAC（GA生物合成抑制剂）保持了高ABA和低GA?水平，并加剧了抑制作用。FLU和PAC的共同处理部分抵消了FLU的缓解效果。NaCl+NaHCO3胁迫显著抑制了CqGSA1的表达（图7J），FLU强烈诱导了其表达，而PAC抑制了其表达；FLU+PAC共同处理下的CqGSA1表达水平介于两者之间，表明其表达受到盐碱胁迫和ABA/GA3信号的协同调节。结合表达模式，CqGSA1响应ABA/GA?平衡的变化，并作为连接激素信号与耐盐萌发的关键节点，通过维持激素稳态来正向调节藜麦种子在盐碱条件下的耐盐性。

3. 结论
本研究表明，NaCl和盐碱联合胁迫显著抑制了藜麦种子的萌发，并破坏了Na?/K?离子稳态。离子和高pH的协同效应导致比单一盐胁迫更强的抑制作用。WGCNA筛选鉴定出一个与耐盐碱性状高度相关的核心模块，确定了枢纽基因CqGSA1。功能验证表明，CqGSA1过表达通过调节ABA/GA?平衡和减少Na?积累增强了拟南芥的耐盐碱性。此外，CqGSA1作为藜麦耐盐性的正向调节因子，其表达受到盐胁迫和ABA/GA?信号的协同调节。作为关键节点，它连接激素信号和耐盐萌发，改善了藜麦在盐碱条件下的萌发，并为后续的工业应用提供了更好的基础。

4. 讨论
本研究系统分析了藜麦在NaCl单一盐胁迫和NaCl+NaHCO3联合盐碱胁迫下的响应模式和分子调控机制。结果表明，这两种胁迫均显著抑制了藜麦种子的萌发，并破坏了Na+/K+离子稳态，联合胁迫的抑制作用远强于单一盐胁迫。这一发现与非生物胁迫研究的一般结论一致。在对照条件下，藜麦种子24小时内的萌发率超过90%（图1B）。在NaCl胁迫下，萌发率降至约30%，而在盐碱联合胁迫下，萌发率降至5%。Na+/K+比率在NaCl胁迫下增加了约0.5倍，在联合胁迫下增加了两倍以上（图1E-F）。这直接证明了离子胁迫和高pH的协同效应加剧了对种子萌发的损害（Song等人，2024年）。离子稳态的破坏是抑制藜麦萌发的核心生理因素，突显了藜麦种子在萌发阶段对盐碱联合胁迫的高度敏感性。转录组和KEGG功能富集分析显示，藜麦在盐碱胁迫下的差异表达基因分为四个核心亚群（图3D-F）。其中，编码激素信号相关基因的亚群1和3在GA信号转导和ABA合成途径中表现出显著富集（He等人，2022年）。这些途径与MAPK信号传导和碳代谢重编程等途径一起，构成了调控藜麦耐盐碱性的核心调控途径。这与经典的种子萌发激素调控机制一致，反映了植物非生物胁迫响应途径的保守性（Sharma和Majee，2023年；Shu等人，2016年）。通过WGCNA共表达网络分析识别的ME turquoise模块与藜麦萌发率呈高度正相关，与Na+/K+比率呈高度负相关。该模块中的枢纽基因CqGSA1是藜麦盐碱胁迫调控网络中的关键节点（图4）。拟南芥异源过表达实验证实，该基因显著增强了藜麦种子在盐碱胁迫下的萌发能力。过表达系保持了较低的ABA浓度和较高的GA?水平（图5），Na?积累和Na+/K+比率显著低于野生型植物。然而，在沉默系统中则出现了相反的结果。这种双重调控机制同时调节ABA-GA激素平衡和离子稳态（图7），形成了增强耐盐性的核心机制（Chang等人，2024年；Luo等人，2024年）。与大多数仅调节单一途径的耐盐基因不同，这表明该基因具有全面而高效的调控功能（图6）。高pH和盐胁迫可以协同抑制种子萌发，细胞内pH稳态对植物耐碱性胁迫至关重要（Wang等人，2025年）。本研究显示，敲除CqGSA1显著降低了藜麦在盐碱胁迫下的萌发率，表明该基因在种子萌发过程中正向调节耐盐性。我们推测它通过参与pH感应和调节质子泵活性来维持细胞内pH稳态（Fang等人，2021年），其功能丧失导致细胞内pH失衡，抑制了与萌发相关的代谢过程，从而降低了藜麦在盐碱胁迫下的萌发能力。

在本研究中，使用藜麦鉴定并验证了CqGSA1基因。该基因是藜麦耐盐性遗传改良的关键靶点，为培育耐盐品种和苋科作物的工业应用提供了新的遗传资源（H. C. Chen等人，2018年）。尽管水稻和大豆等作物中也存在GSA1家族的同源基因，但它们的功能模式存在显著差异。这种差异不仅反映了CqGSA1在藜麦中的功能独特性，还表明该基因在藜麦适应其原生盐碱环境的过程中经历了适应性进化。本研究通过拟南芥异源过表达和沉默实验验证了CqGSA1在调控藜麦盐碱胁迫下种子萌发中的正向调节作用。该基因受到ABA-GA的协同调节，但涉及ABA-GA合成、信号转导和离子运输的具体分子相互作用网络需要进一步阐明（Gazzarrini和Tsai，2015年）。未来的研究应重点筛选CqGSA1的上游和下游相互作用蛋白，通过藜麦中的体内基因编辑实验验证其功能，并通过田间试验评估其在耐盐碱藜麦育种中的实际应用。这将为开发新的耐盐藜麦品种提供直接的理论和技术支持（He等人，2022年）。此外，本研究揭示的ABA-GA平衡和离子稳态协同调节藜麦种子萌发的机制为提高耐盐性提供了宝贵的遗传资源，增强了藜麦在盐碱土壤中的存活率，并进一步支持了藜麦基生物材料的可持续应用。

5. 材料与方法
5.1. 材料和实验程序
所用材料为藜麦（Chenopodium quinoa Willd.）品种“BL1”和拟南芥（Col-0），选择籽粒饱满、无病虫害且大小均匀的种子。实验前，种子用75%（v/v）乙醇表面消毒30秒，用无菌蒸馏水冲洗三次，风干后储存备用。根据盐碱土地的实际状况和藜麦的耐盐碱性，设置了三个处理组（Qian等人，2024年；Xia等人，2025年）：
- 对照组（CK）：在蒸馏水中培养；
- NaCl胁迫组：在100 mmol/L NaCl溶液中培养；
- NaCl+NaHCO3联合胁迫组：在75 mmol/L NaCl + 25 mmol/L NaHCO3溶液中培养，用1 mol/L NaOH调节pH至8.5以模拟盐碱联合条件。每个藜麦种子处理包含三个生物学重复。每个培养皿中放置两层无菌滤纸，每个培养皿加入5 mL相应的处理液，并均匀分布50粒灭菌种子。拟南芥种子在相同的处理条件下培养在1/2 MS固体培养基上。培养条件为：25°C/20°C（昼夜），光照16小时/黑暗8小时，光照强度200 μmol·m?2·s?1，相对湿度70%。培养期间每天补充等量的处理液以保持滤纸湿润。

5.2. 异源表达载体的构建和转化
对于拟南芥材料，使用藜麦cDNA作为模板扩增了CqGSA1的全长编码序列，并构建了p35S::CqGSA1过表达载体。使用野生型拟南芥作为受体，通过农杆菌介导的转化将p35S::CqGSA1载体转入拟南芥。经过潮霉素（50 mg·L?1）筛选和PCR鉴定后，获得了两个独立的T3代纯合过表达系（35S-CqGSA1#1和35S-CqGSA1#2）。

5.3. Na?和K?含量的测定
处理后24小时，收集每个处理组的种子，用去离子水冲洗三次，在105°C下热烫30分钟，70°C下干燥至恒重，研磨并通过0.5毫米筛网过滤。称取0.1克粉末，加入10 mL去离子水，在沸水浴中提取30分钟，冷却后过滤并稀释至100 mL。使用火焰光谱仪（FP640，上海精科）测定Na?和K?含量。计算Na+/K+比率及Na?积累量（Na?积累量 = Na?含量 × 样品干重）。

5.4. RNA测序
选择与萌发实验相同批次的藜麦种子。在对照（CK）、100 mmol/L NaCl和75 mmol/L NaCl + 25 mmol/L NaHCO3（pH 8.5）处理后，分别在5小时、10小时和20小时收集种子。每个时间组合有三个生物学重复。使用Trizol试剂（Invitrogen）提取总RNA。在用DNase I（TaKaRa）消化去除基因组DNA后，使用Nanodrop 2000和Agilent 2100 Bioanalyzer评估RNA的纯度和完整性（RIN ≥ 8.0）。随后进行转录组测序和数据预处理。合格的RNA用于构建链特异性cDNA文库，并在Illumina NovaSeq 6000平台上进行双端测序（150 bp）。原始测序数据通过Trimmomatic软件过滤，以去除低质量读段（Q<20）和接头序列，得到干净的读段。这些干净的读段使用HISAT2与藜麦参考基因组（Chenopodium quinoa v2.0）对齐。基因读段计数通过HTSeq-count进行量化，并使用FPKM值对基因表达水平进行归一化。利用R语言将基因表达水平（log??(FPKM)以密度分布图的形式可视化。基于全基因FPKM值计算样本间的皮尔逊相关系数，然后进行层次聚类和热图生成。使用R语言的prcomp函数进行主成分分析（PCA），以可视化样本间的转录组差异。使用DESeq2软件筛选差异表达基因（DEGs），筛选标准为|log?FC| ≥ 1且FDR < 0.05。使用pheatmap包可视化DEGs的表达模式。

5.5 表达模式聚类和功能富集分析
使用DESeq2 R包对从转录组测序中获得的基因表达矩阵进行差异表达分析。以对照组（CK）为参考，在NaCl和NaCl+NaHCO3处理后3小时、6小时和20小时分别鉴定差异表达基因（DEGs）。筛选阈值为|log?FC| ≥ 1且FDR < 0.05。所有DEGs的FPKM表达值经过Z-score归一化，以消除样本特异性表达差异。使用R包Mfuzz进行模糊c均值聚类，分析DEGs的时间动态表达模式。聚类过程中使用模糊参数m = 1.25，将DEGs分为3个核心表达亚群。使用ggplot2包生成每个亚群的基因表达趋势图，其中灰线代表单个基因的表达趋势，蓝线表示亚群平均表达趋势，红色水平线表示零表达基线。

5.6 WGCNA网络分析
基于转录组FPKM表达矩阵进行WGCNA网络分析。首先过滤掉平均FPKM < 1的低表达基因。然后应用Z-score归一化，消除样本间的表达差异。接着使用R包WGCNA中的pickSoftThreshold函数选择一个满足缩放网络拟合指数R2 ≥ 0.8的软阈值β。基于此β值计算基因邻接矩阵，并将其转换为拓扑重叠矩阵（TOM）以减少噪声；随后基于TOM矩阵对基因进行层次聚类。使用动态树切割（最小模块大小：50个基因）划分模块，并计算模块特征基因。相关性大于0.75的模块进行合并；接着，以耐盐性作为外部特征，计算模块特征基因与特征之间的皮尔逊相关系数和显著性P值。使用模块显著性（MS）筛选与耐盐性显著相关的核心模块。在核心模块内，识别满足以下条件的枢纽基因：模块成员资格（MM）> 0.8和基因显著性（GS）> 0.5，或在模块内连通性排名前1%的基因。最后，使用WGCNA包和ggplot2生成基因层次聚类树、模块-特征相关热图和其他可视化结果。使用Cytoscape软件可视化核心模块的共表达网络和枢纽基因的相互作用网络。

5.7 植物激素含量测定
从每种处理过的藜麦或拟南芥品系中取0.1克种子样本。在液氮中研磨种子，然后加入预冷的80%甲醇提取液。在4°C下避光提取12小时。离心并收集上清液。使用C18固相萃取柱纯化，然后通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS，Agilent 1290–6460）测定脱落酸（ABA）和赤霉素（GA?）的含量，采用外部标准方法进行定量。

5.8 qRT-PCR分析
使用Trizol试剂（Invitrogen）从处理48小时的拟南芥种子中提取总RNA。通过DNase I消化（TaKaRa）去除基因组DNA污染。通过1%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000（OD???/OD???比值1.8–2.0）评估RNA的完整性和纯度。使用1 μg的总RNA，按照PrimeScript? RT Reagent Kit（TaKaRa）的说明书严格遵循反应条件进行反转录生成第一链cDNA。使用SYBR? Premix Ex Taq? II（TaKaRa）试剂盒进行qRT-PCR。拟南芥Actin2（AT3G18780）作为内参基因，用于检测参与ABA和GA合成及信号转导的关键基因的相对表达水平。qRT-PCR反应体系（20 μL）包括：SYBR? Premix Ex Taq? II 10 μL，正向和反向引物各0.4 μmol/L 2 μL，cDNA模板2 μL，ddH?O 7.2 μL。反应条件为：95°C预变性30秒；40个循环，每个循环包括95°C变性5秒、60°C退火30秒、72°C延伸30秒。通过熔解曲线分析（95°C 15秒、60°C 1分钟、95°C 15秒）验证扩增特异性。每个样本重复三次。使用2^-ΔΔCt方法（Livak和Schmittgen，2001）计算相对基因表达。进行单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA），随后使用Duncan的多重范围检验（Duncan's multiple range test）评估同一处理组内不同品系间的显著差异（P < 0.05）。数据以平均值±标准误差（mean ± SE）表示，n = 3。

5.9 藜麦种子中CqGSA1基因的病毒诱导基因沉默（VIGS）
将编码藜麦GSA1基因的特定片段克隆到TRV2载体中，构建CqGSA1-VIGS重组载体，空TRV2载体作为阴性对照（VIGS-CK）。TRV2-CqGSA1载体和空TRV2载体分别转化到农杆菌GV3101菌株中。培养后，将阳性农杆菌悬浮在感染缓冲液中（10 mM MES、10 mM MgCl?、200 μM AS，pH 5.6），调整OD600值为1.0。将TRV1与TRV2-CqGSA1或空TRV2载体以1:1体积比混合，在室温下避光孵育30分钟。表面消毒的藜麦种子通过真空浸渍（0.08 MPa，15分钟）处理后，与农杆菌溶液共培养3小时。共培养后，用无菌水冲洗种子，并转移到浸有含所需处理溶液的1/2 MS液体培养基的无菌滤纸上进行发芽培养。未接种的消毒种子作为空白对照（CK）。种子发芽10小时后，使用RT-qPCR验证CqGSA1基因的沉默效率，以actin作为参考基因。

作者贡献
Shanmin Zhou负责实验设计、转录组数据分析及手稿起草。Panpan Shi负责研究方法的指导及手稿的起草。

CRediT作者贡献声明
Shanmin Zhou：撰写——原始草稿、软件使用、正式分析、数据整理。Panpan Shi：撰写——审阅与编辑、资源提供。

资助
本研究得到山西省研究生教育创新项目（2021Y494）的支持。