《PLOS One》：The inhibitors of miR-224-5p, miR-339-5p, and miR-1198-5p improve auditory function by promoting the expression of neuritin in hearing loss mice
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背景：感音神经性聋（sensorineural hearing loss, SNHL)是听力损害的主要类型，目前缺乏有效的预防或治疗药物。研究人员前期研究揭示，在听力损失中神经营养因子神经突起因子(Neuritin, CPG15, NRN1)的表达降低。经重组
背景：感音神经性聋（sensorineural hearing loss, SNHL)是听力损害的主要类型，目前缺乏有效的预防或治疗药物。研究人员前期研究揭示，在听力损失中神经营养因子神经突起因子(Neuritin, CPG15, NRN1)的表达降低。经重组人Neuritin蛋白治疗后，毛细胞数量显著增加。然而，听力损失中Neuritin表达降低的分子机制尚不清楚。研究表明，Neuritin表达受微小RNA(microRNAs, miRNAs)调控。本研究旨在筛选并验证调控Neuritin表达的关键miRNA，并评估这些miRNA作为SNHL治疗靶点的可行性。方法：本研究利用SNHL小鼠模型，采用高通量测序和生物信息学分析筛选调控耳蜗组织中神经丝蛋白表达的miRNA。随后，研究人员开展体内实验验证候选miRNA对神经丝蛋白的调控作用，并评估相应miRNA抑制剂对SNHL的改善效果。结果：经过筛选和鉴定，获得三个特异性抑制神经丝蛋白表达的miRNA，即miR-224-5p、miR-339-5p和miR-1198-5p。体内实验结果表明，上述三种miRNA的抑制剂对SNHL小鼠模型具有显著的改善作用。结论：miR-224-5p、miR-339-5p和miR-1198-5p可通过调控神经丝蛋白的表达参与SNHL的发病机制。靶向这些miRNA或其抑制剂可为SNHL的预防和治疗提供新的分子靶点和策略。
听力损失是全球最常见且增长迅速的公共卫生问题之一。据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)最新数据，全球约有5亿人患有某种形式的听力损害，占世界人口的5%以上，预计到2050年这一数字将超过25亿。感音神经性聋(sensorineural hearing loss, SNHL)是听力损失的主要类型，约占所有听力损害病例的90%。SNHL的主要病因包括衰老、遗传突变、噪声暴露、耳毒性药物使用以及某些慢性全身性疾病。当耳蜗毛细胞(hair cells, HCs)、听神经或听觉传导通路发生结构或功能损伤时，异常的声音感知和神经信号传递导致听觉敏感性降低或完全丧失。目前临床治疗主要依赖听力学康复手段，如助听器和人工耳蜗植入，但这些干预措施存在显著局限性，无法实现受损听觉细胞的结构修复或功能再生。鉴于哺乳动物耳蜗毛细胞在损伤或退化后表现出有限的再生能力，保存现有毛细胞的存活和功能可行性变得至关重要。
Neuritin是一种关键的神经可塑性和神经元发育调控因子，其主要功能包括促进神经突起生长、维持神经元存活和抑制神经元死亡。研究人员前期研究表明，Neuritin在正常耳蜗组织中广泛表达，但药物损伤后其表达显著降低。外源性重组Neuritin蛋白不仅能保护神经支配、减少药物诱导的毛细胞损伤，还能促进支持细胞前体的增殖并诱导耳蜗支持细胞向毛细胞转分化。然而，听力损失背景下Neuritin表达下调的分子机制尚不清楚。miRNA是一类非编码RNA，已在人类基因调控中发挥重要作用，超过三分之一的人类基因受其调控。多种miRNA参与耳蜗的生长和成熟，miRNA表达的失调与听力障碍的发生密切相关。因此，研究人员假设特定miRNA可能通过靶向调控Neuritin表达参与SNHL的发病机制，并可能作为听力损失早期诊断和靶向治疗的潜在分子标志物。
该研究发表于《PLOS One》。研究人员采用的技术方法主要包括：建立卡那霉素和呋塞米联合诱导的SNHL小鼠模型，通过圆窗膜给药进行体内干预；利用高通量小RNA测序(RNA-seq)结合DEG-seq分析筛选差异表达miRNA；运用TargetScan、miRTarBase、miRDB等7个生物信息学数据库预测靶向Neuritin的miRNA；采用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)验证候选miRNA表达水平；通过293T细胞转染miRNA模拟物结合蛋白质免疫印迹(Western blot)检测评估miRNA对Neuritin蛋白表达的影响；利用双荧光素酶报告基因检测验证miRNA与Neuritin 3'-非翻译区(3'-untranslated region, 3'-UTR)的直接结合；建立新生小鼠基底膜外植体培养体系进行体外药物干预实验；采用听觉脑干反应(auditory brainstem response, ABR)和短纯音ABR(tone burst ABR, tb-ABR)评估听觉功能；通过免疫荧光染色观察毛细胞形态和数量变化。
研究结果部分，"Neuritin在SNHL动物模型中表达下调"：研究人员成功建立卡那霉素(1000 mg/kg)联合呋塞米(500 mg/kg)诱导的SNHL小鼠模型，听功能评估显示模型组小鼠在造模后12小时和24小时出现显著波形紊乱，听阈升高至70-90 dB SPL。进一步分析发现，Neuritin在耳蜗中的表达在造模后12小时和24小时显著降低，第8天开始部分恢复，提示Neuritin表达水平与小鼠听力损失存在潜在关联。
"SNHL中与Neuritin相关的miRNA鉴定"：研究人员从对照组、12小时模型组和24小时模型组的柯蒂氏器(Organ of Corti)中提取RNA进行高通量测序。与对照组相比，12小时模型组有80个miRNA显著上调、169个下调，24小时模型组有40个上调、94个下调。通过生物信息学方法预测靶向Neuritin的miRNA，获得1533个候选分子，与测序鉴定出的24个共同上调miRNA取交集，最终筛选出15个在SNHL中高表达且可能靶向Neuritin的miRNA。经qRT-PCR验证，15个候选miRNA中9个在12小时和24小时模型组中均一致上调，包括miR-21a-3p、miR-93-3p、miR-145a-5p、miR-181a-2-3p、miR-224-5p、miR-339-5p、miR-1198-5p、miR-1247-3p和miR-1247-5p。同源性分析显示，鉴定出的miRNA在人鼠之间的序列同源性均在95%以上。
"候选miRNA对Neuritin的靶向调控"：为探索9个候选miRNA与Neuritin的功能关系，研究人员合成miRNA模拟物并分别转染至293T细胞。Western blot分析结果显示，miR-145a-5p、miR-224-5p、miR-339-5p或miR-1198-5p模拟物转染导致Neuritin蛋白水平显著降低，而miR-93-3p、miR-181a-2-3p、miR-21a-3p、miR-1247-3p或miR-1247-5p模拟物未引起Neuritin表达的明显变化。双荧光素酶报告基因检测证实，与阴性对照组相比，miR-224-5p、miR-339-5p和miR-1198-5p模拟物共转染的野生型报告基因荧光素酶活性显著降低，而相应突变型报告基因组无显著变化；miR-145a-5p模拟物转染的野生型组荧光素酶活性反而升高，提示其不与Neuritin特异性结合。因此，miR-224-5p、miR-339-5p和miR-1198-5p被确定为与Neuritin特异性相互作用的研究对象。
"miR-339-5p、miR-1198-5p和miR-224-5p抑制剂对SNHL的影响——抑制剂对庆大霉素诱导毛细胞损伤的作用"：研究人员将3日龄CBA小鼠耳蜗基底膜进行体外培养，实验组给予miR-339-5p、miR-1198-5p和miR-224-5p抑制剂混合物(1:1:1，每孔100 pmol)，阴性对照组给予等量对照抑制剂。免疫荧光染色显示，对照组顶回、中回和底回的外毛细胞数量显著减少，而miRNA抑制剂处理组毛细胞数量基本保留，各耳蜗回区损失极小。统计分析确认两组间存在显著差异，表明抑制miR-224-5p、miR-339-5p和miR-1198-5p可有效减轻庆大霉素诱导的毛细胞损伤，对基底膜毛细胞具有保护作用。
"反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide, AM)对SNHL小鼠听觉功能的影响"：为进一步探究靶向miR-339-5p、miR-1198-5p和miR-224-5p的AM对不同程度SNHL听觉功能和耳蜗毛细胞的影响，研究人员首先通过ABR测量确认经圆窗膜给药的安全性，显示小鼠基线听阈无显著改变。Neuritin表达变化检测显示，干预后1-3天实验组Neuritin蛋白水平显著高于阴性对照组，表明三种AM成功通过圆窗膜递送至耳蜗并有效上调Neuritin表达；第7-14天两组间Neuritin表达无显著差异，可能与SNHL后第7天开始内源性Neuritin表达增加有关。在低剂量模型中，造模后第1天阴性对照组听阈升高10-20 dB，而AM组维持正常范围；第3-7天阴性对照组部分阈值恢复，但AM组听力持续正常。tb-ABR显示阴性对照组在8、16和32 kHz听阈升高，AM组第1天虽有升高但幅度较阴性对照组低10-20 dB，第3-7天阴性对照组阈值仍高于正常水平，而AM组已基本恢复至接近正常值。免疫荧光染色显示，阴性对照组毛细胞损伤呈典型药物性听力损失进展，而AM干预组在各时间点顶回和中回毛细胞排列整齐且数量增加，底回毛细胞数量和结构完整性也基本恢复至接近正常水平。然而，在高剂量模型中，毛细胞损失严重，AM干预未能引起听阈或毛细胞数量的显著改善。
讨论部分，研究人员指出SNHL严重影响患者健康和生活质量，与精神障碍和阿尔茨海默病等疾病相关。由于毛细胞对听觉感知至关重要，维持其存活、功能和数量成为SNHL管理的有前景的治疗途径。前期研究表明Neuritin在SNHL中显著下调，重组Neuritin蛋白可促进毛细胞增殖，但其表达降低的分子机制不明。miRNA作为在转录后水平抑制基因表达的非编码RNA亚类，参与多种生理和病理过程，在胚胎发育、分化成熟以及出生后毛细胞存活中发挥不可或缺的作用。
本研究通过RNA-seq分析了SNHL小鼠柯蒂氏器的miRNA表达谱，鉴定出24个上调miRNA，其中15个可能直接靶向Neuritin基因。经qRT-PCR验证和293T细胞功能验证，最终确定miR-224-5p、miR-339-5p和miR-1198-5p可直接结合Neuritin的3'-UTR，导致SNHL中Neuritin表达降低。体外基底膜培养实验表明，三种miRNA抑制剂联合应用可保护柯蒂氏器免受庆大霉素诱导的毛细胞损伤。体内圆窗膜给药实验进一步证实，在低剂量SNHL模型中，AM治疗可促进中回和顶回毛细胞数量恢复并显著改善听阈，但在高剂量模型中未观察到显著改善，可能与严重损伤时毛细胞损失超出Neuritin修复能力有关。
研究结论部分：本研究阐明了SNHL中Neuritin下调的分子机制，即miR-224-5p、miR-339-5p和miR-1198-5p的靶向抑制。AM的治疗效果具有模型依赖性：在低剂量模型中显著促进毛细胞恢复和改善听阈，在高剂量模型中未显示明显改善。这些对比结果表明AM的保护作用可能限于较轻度损伤，而更严重损伤需要额外策略。尽管如此，低剂量模型中观察到的疗效突显了AM作为听力损失治疗药物的潜力。
