《Frontiers in Molecular Neuroscience》：Human iPSC-derived motor neurons as a platform for elucidating TDP-43-related amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: a mini review
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TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）是与肌萎缩侧索硬化（ALS）相关的主要致病性RNA结合蛋白。TDP-43的杂合突变导致家族性ALS，即ALS10型。生理条件下，TDP-43主要定位于细胞核。不仅携带TARDBP基因突变的ALS患者，大多数散发性ALS
TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）是与肌萎缩侧索硬化（ALS）相关的主要致病性RNA结合蛋白。TDP-43的杂合突变导致家族性ALS，即ALS10型。生理条件下，TDP-43主要定位于细胞核。不仅携带TARDBP基因突变的ALS患者，大多数散发性ALS患者均表现出TDP-43病理特征，其定义为核内清除与胞质聚集。在TDP-43敲低模型和尸检分析中已证实，STMN2和UNC13A等基因中隐秘外显子的 inclusion 是TDP-43功能缺失的标志性事件。然而，在ALS中TDP-43的水平及定位如何从健康状态转变为病理状态尚不明确。由诱导多能干细胞（iPSCs）衍生的运动神经元已广泛应用于ALS研究，并为探究疾病早期机制提供了前景广阔的平台，但在构建能够忠实重现ALS发病过程的模型方面仍存在挑战。本综述总结了TDP-43相关iPSC衍生运动神经元模型的最新进展，并讨论了阐明ALS发病机制的未来方向。研究人员提出，对TDP-43动态变化的纵向分析及共培养体系将对更好地模拟ALS早期发病机制至关重要。
1 引言
肌萎缩侧索硬化（ALS）是一种进行性神经退行性疾病，以上、下运动神经元变性为特征。约10%的ALS病例为家族性，目前已鉴定出30余个致病基因，其余约90%为散发性。TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）由TARDBP基因编码，是RNA加工过程中的核心RNA结合蛋白。生理状态下，TDP-43主要定位于细胞核；而在ALS中，其发生错误定位至胞质并形成病理性聚集体，常伴随磷酸化修饰。磷酸化TDP-43（尤其是Ser409/410位点）是ALS中最具重复性和广泛应用的病理标志物。尽管已有研究报道泛素化、SUMO化、乙酰化和瓜氨酸化等其他翻译后修饰，但多项实验研究已将TDP-43磷酸化与胞质聚集、细胞毒性及神经退行性变联系起来。异常的TDP-43错误定位与聚集主要见于神经元胞质、营养不良性神经突和胶质细胞胞质。在实验模型中，错误定位或聚集的TDP-43还与应激颗粒、线粒体及内质网相关联，提示多个亚细胞区室参与TDP-43介导的神经退行性变。这种TDP-43病理改变见于约97%的ALS病例（包括散发型），凸显其在ALS发病中的核心地位。与之相符的是，TARDBP基因的杂合突变可导致家族性ALS（即ALS10型），进一步强调了TDP-43在疾病发生中的重要性。值得注意的是，携带TARDBP突变的患者表现出的TDP-43病理特征与散发性ALS相似，提示针对TARDBP突变驱动的疾病机制研究可为包括散发型在内的绝大多数ALS病例提供发病机制线索。有趣的是，约半数额颞叶痴呆（FTD）病例中也观察到TDP-43病理，FTD是一种以行为或语言进行性恶化为特征的年轻型痴呆主要病因，且TARDBP突变可引起FTD，支持ALS与FTD属于重叠性TDP-43蛋白病的概念。
近期ALS研究进展表明，Stathmin-2（STMN2）和UNC-13同源物UNC13A等基因中的隐秘外显子 inclusion 是TDP-43核耗竭所致功能缺失的标志。STMN2调控正常轴突生长与再生，其隐秘外显子 inclusion 会诱导提前多聚腺苷酸化并产生截短转录本，导致全长STMN2表达下降，该现象已在ALS患者尸检脊髓组织中被证实。抑制STMN2隐秘外显子 inclusion 可挽救STMN2表达并改善TDP-43耗竭诱导的表型（包括神经突生长和轴突再生缺陷），提示STMN2可能在ALS发病中发挥重要作用。UNC13A调控突触囊泡启动与神经递质释放，其隐秘外显子 inclusion 会诱导无义介导的mRNA降解，从而降低UNC13A表达；此外，ALS/FTD相关的UNC13A风险变异会增加隐秘外显子 inclusion，凸显了TDP-43功能缺失与ALS/FTD发病机制之间的强机制关联。重要的是，尸检样本中隐秘外显子 inclusion 的存在有力支持了TDP-43功能缺失（尤其在疾病晚期阶段）在ALS发病中的作用。基于此，靶向STMN2的剪接转换反义寡核苷酸临床试验目前正在ALS患者中开展。然而，在ALS从生理状态向病理状态转变的过程中，TDP-43水平与亚细胞定位如何变化仍不清楚。
尽管转基因与敲入小鼠模型已被开发，但重现进行性TDP-43病理及早期疾病机制仍具挑战。此外，RNA结合蛋白常表现出物种特异性的RNA结合谱，限制了啮齿类模型完全捕获人类特异性RNA调控机制的能力。为克服这些局限，人诱导多能干细胞（iPSCs）衍生的运动神经元模型为在人类背景下研究早期疾病机制提供了前景广阔的平台。利用ALS患者iPSC衍生运动神经元（iPSMNs）的药物筛选研究已鉴定出候选化合物，其中数项已进入临床试验。此外，Answer ALS等大规模多组学资源加速了患者来源iPSMNs中疾病相关分子特征的识别。尽管如此，构建能精准重现ALS发病过程的模型仍面临重大挑战，因为培养条件可对疾病表型产生显著影响。本综述将总结TDP-43相关iPSC衍生运动神经元模型的最新进展，并讨论阐明ALS发病机制的未来方向。
2 TARDBP突变iPSC衍生运动神经元模型的表型概述
为深入理解TDP-43相关致病机制，研究人员回顾了采用携带TARDBP突变（包括N290S、G287S、G298S、A315T、M337V、Q343R、G348C、A382T、I383T和I383V）的iPSMN模型的研究。这些突变均位于C端结构域（亦称富含甘氨酸或类朊病毒结构域），该结构域参与相分离与TDP-43聚集。多数ALS相关TARDBP突变位于此区域，本综述纳入的突变为ALS患者中报道的TARDBP突变的子集。
不同研究中TDP-43蛋白表达的变化并不一致。多项研究报道总TDP-43或不溶性TDP-43表达升高，而TDP-43定位在不同研究中也存在差异，但胞质TDP-43增加的现象较常被观察到。有研究曾报道核内TDP-43增加。磷酸化TDP-43的胞质聚集是ALS的病理标志，但在iPSMNs中虽可检测到磷酸化TDP-43，却未一致重现类似终末期ALS病理的显著胞质聚集。
TARDBP突变iPSMNs的神经元表型也呈现显著异质性。部分研究报道神经元过度兴奋，另一些则观察到低兴奋性，这些差异并未始终与TDP-43表达或定位的改变相关联，提示TARDBP突变差异或培养条件不同可能影响神经元表型。两项研究检测了突触形态，发现TARDBP突变与突触斑点数量或大小增加相关，提示TARDBP可能参与突触功能与可塑性调控。此外，仅两项研究记录了STMN2表达降低或STMN2隐秘外显子 inclusion，且这些变化并不一定伴随明显的TDP-43核丢失。与STMN2相比，TARDBP突变iPSMNs中UNC13A失调的证据仍有限。
重要的是，表型在不同用于插入TARDBP突变的健康iPSC系中存在差异。一项研究使用两种不同健康iPSC系进行TARDBP突变敲入，发现胞质TDP-43增加与STMN2隐秘外显子 inclusion 仅在其中一个系中被观察到，而神经元放电变化在两个系中呈相反趋势，表明构建突变插入模型时需谨慎考虑健康iPSC系的遗传背景。
仅两项研究纳入了与星形胶质细胞的共培养，结果显示共培养可促进突触成熟或神经元活性。其中一项研究表明，单培养条件下观察到的TARDBP突变iPSMNs易损性可被野生型或TARDBP突变型星形胶质细胞共培养所挽救，提示通过星形胶质细胞共培养增强神经元功能或细胞活力可能掩盖细微的突变相关表型。
综上，既往研究表明TARDBP突变iPSMN模型可稳定捕获早期功能异常，而非显著的终末期TDP-43病理。同时，不同模型中TDP-43表达、定位及神经元表型的显著异质性，凸显了改进iPSMN模型以阐明ALS患者病程进程的必要性。
3 讨论
3.1 早期TDP-43动态变化作为关键致病事件
TDP-43核丢失、神经元胞质包涵体、线团样包涵体及胶质包涵体是TDP-43病理的标志，这些特征常见于携带TARDBP突变的家族性ALS与散发性ALS。然而，TDP-43表达的时序变化（尤其是早期改变）尚未被完全阐明。研究显示TARDBP突变可增强蛋白稳定性，提示疾病进程中可能出现TDP-43表达升高。有研究曾报道TDP-43 I383V突变iPSMN模型中核内TDP-43表达增强并与神经元活性改变相关。在TDP-43敲入小鼠中也观察到核内TDP-43表达增加，支持核内TDP-43表达增强可能是TDP-43病理的早期改变之一。如前所述，多项TARDBP突变iPSMN模型研究显示TDP-43表达增加，但鲜有研究明确TDP-43在亚细胞区室的升高位置。鉴于iPSMN模型在分析早期表型方面的优势，精确评估TDP-43表达及其定位对理解TDP-43病理起始至关重要。
对TDP-43表达及相关神经元表型的纵向分析可为iPSMN模型提供重要线索。一项研究指出，TDP-43突变iPSMNs在培养两周后表现出轴突起始段延长及固有过度兴奋，此期间TDP-43表达保持不变；有趣的是，随着培养周期延长至六周，这些表型发生逆转，伴随核内TDP-43表达下降。此外，ALS尸检脊髓中观察到轴突起始段缩短，提示核内TDP-43丢失可能是疾病晚期的标志。该研究强调了考察TDP-43表达与神经元表型时序变化的重要性，此类纵向分析是iPSMN模型的核心优势，对理解ALS早期发病机制具有重要意义。
3.2 共培养体系的重要性
iPSMN模型中的共培养有望促进生理性神经元状态的建立，并更精确地阐明致病机制。星形胶质细胞在脑结构支持、功能完整性维持及稳态调控中发挥关键作用，星形胶质细胞-神经元互作对突触与神经环路调控至关重要。多项研究已采用iPSC衍生星形胶质细胞或啮齿类星形胶质细胞共培养来分析ALS发病机制。研究显示iPSMNs与大鼠星形胶质细胞共培养可促进神经元活性，且如前所述，TDP-43突变iPSMNs中TDP-43表达升高。关于何种星形胶质细胞（原代啮齿类星形胶质细胞或人iPSC衍生星形胶质细胞）更适合iPSC衍生神经元培养仍需进一步探讨，但通过星形胶质细胞共培养促进生理性神经元状态，可能更好地揭示ALS iPSMN模型中的疾病相关表型。小胶质细胞既参与对胞外TDP-43的炎症反应，也参与病理性TDP-43的清除，尽管结合iPSC衍生运动神经元与小胶质细胞的共培养体系已在其他ALS相关突变模型中建立，但基于TARDBP突变iPSC衍生运动神经元的研究仍有限。
神经肌肉接头也是ALS受累的重要组分。与iPSC衍生骨骼肌细胞共培养已被用于分析神经肌肉接头功能障碍。此外，三维类器官技术已兴起用于分析运动神经元与神经肌肉接头功能。有研究开发了一种微流控装置，连接iPSMN球状体与iPSC衍生三维骨骼肌束，形成可重现功能性神经肌肉接头的运动单位。与非ALS运动单位相比，携带TDP-43 G298S突变的ALS运动单位表现出肌肉收缩减少、运动神经元变性增加及骨骼肌细胞凋亡增加。另一项研究生成了包含生理性功能性神经肌肉接头的感觉运动类器官，结果显示ALS类器官中肌肉收缩减少，且TDP-43 G298S突变类器官中受支配的神经肌肉接头数量下降。
尽管分析ALS病理仍需进一步的方法学改进，但这些进展表明共培养方法在重现生理性运动神经元状态与神经肌肉接头方面具有潜力。
综上，人iPSC衍生运动神经元已成为研究ALS早期TDP-43相关致病机制的重要平台。尽管仍需在纵向分析与共培养体系方面进一步完善以更忠实地重现ALS病程，这些模型仍是阐明早期疾病机制及推动ALS疾病修饰疗法开发的强有力工具。
