α-半乳糖神经酰胺扩增的虚拟记忆CD8+ T细胞赋予宿主针对广谱病原体的保护

《Frontiers in Immunology》：α-Galactosylceramide-expanded virtual memory CD8+ T cells confer protection against a broad range of pathogens

　　

α-半乳糖神经酰胺（α-GalCer）处理动物是研究 invariant自然杀伤T（iNKT）细胞在抗感染和抗肿瘤免疫中益处的成熟模型。研究人员此前发现，α-GalCer处理不仅扩增iNKT细胞，还扩增了一群抗原未经验的记忆样 innate 虚拟记忆CD8+ T（CD8+ TVM）细胞。鉴于CD8+ TVM细胞的旁观者保护潜力，其在α-GalCer介导的抗感染免疫中的作用仍有待深入探索。本研究中，研究人员报道α-GalCer处理赋予宿主针对系统性、肠道和肺部细菌感染以及肺部病毒感染的保护作用。这种保护在iNKT细胞减少后仍持续存在，并与CD8+ TVM细胞的持续扩增相吻合。在感染前一天过继转移α-GalCer扩增的CD8+ TVM细胞可显著降低细菌和病毒负荷。机制上，α-GalCer处理激活iNKT细胞产生白细胞介素-4（IL-4），后者随后扩增了能够产生肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）的CD8+ TVM细胞数量，但单个CD8+ TVM细胞产生这些细胞因子的能力并未增强。肺定位的CD8+ TVM细胞是α-GalCer扩增的肺部CD8+ TVM细胞的主要贡献者。在缺乏IFN-γ信号的情况下，α-GalCer扩增的CD8+ TVM细胞可以以TNF-α依赖性方式降低宿主肺部病毒滴度。综上，这些发现描述了一条免疫级联反应：α-GalCer激活的iNKT细胞通过IL-4产生调控CD8+ TVM细胞的扩增和功能；揭示了CD8+ TVM细胞作为α-GalCer介导免疫治疗效应下游效应者此前未被认识的作用；并强调了CD8+ TVM细胞在宿主防御多种病原体中的保护潜力，从而为开发针对各种感染性疾病乃至肿瘤的新型治疗策略提供了新途径。

α-半乳糖神经酰胺（α-GalCer）是一种来源于海洋海绵的糖脂，作为 invariant自然杀伤T（iNKT）细胞的天然配体，被广泛用于通过抗原递呈细胞（APCs）表面的MHC-I类样分子CD1d递呈来特异性激活iNKT细胞。激活后的iNKT细胞可快速增殖并产生广泛的T_H1、T_H2和T_H17细胞因子，进而激活树突状细胞（DCs）、自然杀伤（NK）细胞以及常规T细胞和B细胞，在连接 innate 和适应性免疫中发挥重要作用。基于这些免疫调节特性，α-GalCer已被广泛应用于增强不同场景下的免疫应答。此前研究主要关注α-GalCer与病原体或肿瘤同时给药时的早期免疫增强效应，而其在给药后较长时间的持续保护效应及扩增的虚拟记忆CD8+ T（CD8+ TVM）细胞的贡献则鲜被探究。

研究背景与问题提出：CD8+ TVM细胞是一群具有记忆表型但未经抗原经验的细胞，存在于未免疫和无菌小鼠中，甚至存在于喂养去除潜在食物抗原要素饮食的小鼠中。这类细胞高表达CD44和CD122，但低表达CD49d，后者仅在真实记忆CD8+ T（CD8+ TMEM）细胞经TCR与同源抗原结合后上调表达。CD8+ TVM细胞不仅表型上类似传统记忆CD8+ T细胞，功能上亦如此，能以抗原依赖方式产生IFN-γ，且可通过细胞因子激活而不依赖同源抗原识别，表现出"旁观者激活"特性。研究人员此前发现α-GalCer处理显著扩增CD8+ TVM细胞群体，但扩增的CD8+ TVM细胞在α-GalCer处理介导的抗感染保护中的作用尚不清楚。

研究设计与主要发现：本研究旨在探究α-GalCer扩增的CD8+ TVM细胞在抗感染保护中的作用。研究人员首先建立了系统性、肠道及肺部病原体感染模型，包括革兰阴性菌假结核耶尔森菌（Ypt）、革兰阳性菌单核细胞增生李斯特菌（Lm）和肺炎链球菌（Spn），以及甲型流感病毒（IAV）。通过时序分析发现，α-GalCer处理后iNKT细胞于第1-3天快速扩增后逐渐收缩，而CD8+ TVM细胞从第1天至第5天快速大量扩增，并持续至第14天以后。关键发现是，在第14天iNKT细胞已减少时，α-GalCer处理仍能保护小鼠对抗多种病原体感染，提示CD8+ TVM细胞可能在后期保护中发挥作用。

为直接验证CD8+ TVM细胞的保护作用，研究人员进行了两项关键实验：CD8+ T细胞耗竭实验显示，去除CD8+ T细胞后α-GalCer介导的保护消失；过继转移实验表明，将α-GalCer扩增的CD8+ TVM细胞转移至受体小鼠，可显著降低Lm血行感染负荷和IAV肺部病毒滴度，证实其直接保护功能。机制探索方面，研究人员发现α-GalCer处理显著提升了多组织中IFN-γ⁺TNF-α⁺ CD8+ T细胞比例，但这主要源于CD8+ TVM细胞数量的扩增而非单个细胞细胞因子产生能力的增强。通过使用IL-4缺陷小鼠，研究证实IL-4是α-GalCer诱导CD8+ TVM细胞扩增的关键因子，IL-4缺失几乎完全消除CD8+ TVM细胞扩增及相关保护效应。进一步利用FTY720阻断淋巴细胞迁移的实验揭示，肺和肝脏中驻留的CD8+ TVM细胞可在局部原位扩增，成为这些器官中IFN-γ⁺TNF-α⁺ CD8+ T细胞池的主要来源。特别值得注意的是，在STAT-1敲除受体小鼠中，α-GalCer扩增的CD8+ TVM细胞仍能通过TNF-α依赖性机制控制IAV感染，表明在IFN-γ信号缺失条件下TNF-α可独立发挥抗病毒作用。

研究技术与方法：本研究使用的关键技术方法包括：野生型C57BL/6小鼠及多种基因敲除小鼠（CD1d敲除、IL-4敲除、STAT-1敲除、TNF-α敲除、IFN-γ敲除）的构建与应用；α-GalCer静脉给药及多种病原体感染模型建立（Ypt灌胃、Lm腹腔注射、Spn滴鼻、IAV滴鼻）；细菌负荷定量（组织匀浆后平板培养计数CFU）和病毒滴度测定（空斑实验）；流式细胞术进行细胞表型分析和胞内细胞因子染色（PMA和离子霉素刺激后检测IFN-γ、TNF-α和颗粒酶B）；CD8+ T细胞耗竭实验（anti-CD8抗体）；细胞分选过继转移技术（从α-GalCer处理供体小鼠分选CD8+ TN和CD8+ TVM细胞过继转移至基因敲除受体小鼠）；以及FTY720处理阻断淋巴细胞迁移等。

研究结果分述：α-GalCer介导的持久保护效应与系统性CD8+ TVM细胞扩增正相关。该部分通过时序分析显示iNKT细胞早期扩增后收缩，而CD8+ TVM细胞持续扩增；第5天和第14天感染模型均显示保护效应，且第14天时保护效应与CD8+ TVM细胞持续存在相关；多组织检测证实CD8+ TVM细胞在脾脏、肠系膜淋巴结、肝脏、支气管肺泡灌洗液、纵隔淋巴结和肺中均有扩增。

α-GalCer扩增的CD8+ TVM细胞对多种感染具有直接保护作用。CD8+ T细胞耗竭消除保护效应；过继转移CD8+ TVM细胞而非CD8+ TN细胞可显著降低Lm血行感染细菌负荷和IAV肺部病毒滴度，直接证明其保护功能。

α-GalCer诱导的CD8+ TVM细胞扩增促进IFN-γ⁺TNF-α⁺ CD8+ T细胞群体增加。多组织IFN-γ⁺TNF-α⁺ CD8+ T细胞比例显著升高；但单个CD8+ TVM细胞产生细胞因子的百分比和平均荧光强度未增加，提示为数量扩增效应而非质量增强。

IL-4缺失限制CD8+ TVM细胞扩增并削弱保护效应。IL-4缺失几乎完全阻断α-GalCer诱导的CD8+ TVM细胞多组织扩增；IFN-γ⁺TNF-α⁺ CD8+ T细胞比例及其中CD8+ TVM细胞占比均显著降低；IL-4缺失消除α-GalCer对Lm感染的保护作用。

肺和肝脏CD8+ TVM细胞原位扩增并贡献效应细胞池。FTY720阻断循环淋巴细胞迁入后，肺和肝脏CD8+ TVM细胞仍扩增；局部扩增的CD8+ TVM细胞构成肺和肝中IFN-γ⁺TNF-α⁺ CD8+ T细胞的主要群体。

α-GalCer扩增的CD8+ TVM细胞以TNF-α依赖性方式在IFN-γ信号缺失条件下控制IAV感染。将野生型CD8+ TVM细胞过继转移至STAT-1敲除受体可显著降低肺部病毒滴度；而TNF-α敲除来源的CD8+ TVM细胞保护效应消失，证实TNF-α的关键作用。

讨论与结论：本研究揭示了α-GalCer处理激活iNKT细胞产生IL-4，进而扩增CD8+ TVM细胞的免疫级联反应，确立了CD8+ TVM细胞作为α-GalCer/iNKT细胞介导免疫效应下游效应者的新角色。CD8+ TVM细胞的独特价值在于其抗原未经验却能提供广谱旁观者保护，且可在黏膜等关键部位原位扩增应答。研究同时指出CD8+ TVM细胞功能具有组织特异性异质性，如肝脏CD8+ TVM细胞特异性表达颗粒酶B，可能与肝星状细胞提供的IL-15信号微环境相关。

机制上，研究明确了IL-4在CD8+ TVM细胞扩增中的核心作用，但也提示存在IL-4非依赖性途径可能涉及IL-15、IFN-α1和IL-2等因子。TNF-α在IFN-γ信号缺失条件下的独立抗病毒作用为理解宿主-病原体互作提供了新视角。研究的技术局限性包括尚无法特异性敲除CD8+ TVM细胞，以及过继转移模型难以完全模拟生理条件等。

研究结论指出，α-GalCer处理扩增的CD8+ TVM细胞作为充分条件可赋予宿主针对广谱病原体的保护，这些"记忆样innate"CD8+ TVM细胞在α-GalCer诱导的iNKT细胞介导免疫治疗效应中不可避免地发挥关键作用，不仅系统性而且在黏膜部位均如此，为开发新型抗感染和抗肿瘤免疫治疗策略提供了重要理论基础。