从冷冻保存的肌萎缩侧索硬化症（MND）运动皮层中分离的突触体揭示钙（Ca2+）处理能力改变和复合体IV（complex IV）相关呼吸降低

《Frontiers in Synaptic Neuroscience》：Synaptosomes isolated from cryopreserved MND motor cortex reveal altered calcium handling and reduced complex IV–linked respiration

　　

运动神经元病（MND）是一种以进行性神经退行性变为特征的疾病，其中突触前Ca²⁺处理和线粒体代谢被认为是脆弱的病理环节，但由于多数人脑材料长期冷冻保存，直接的功能研究十分稀缺。研究人员表明，从配对的fresh和实验性冷冻小鼠皮层以及冷冻保存的人运动皮层中分离的突触体（synaptosomes）保留了可识别的突触体超微结构特征、突触蛋白质组富集以及去极化诱导的Ca²⁺动员（Ca²⁺-mobilisation）。K⁺和藜芦碱（veratridine）在各制备物中诱发了稳健的、可被药理学抑制的Ca²⁺内流，且人样本中的反应幅度因区域而异，但与供体年龄、死后间隔期（PMI）或储存年限无关。来自经神经病理学确认的MND运动皮层和hSOD1^G93A小鼠皮层的突触体显示出比各自对照组显著更强的去极化诱导Ca²⁺内流，提示突触前Ca²⁺内流增加是该人MND队列和hSOD1^G93A小鼠模型共有的特征。利用MND和对照运动皮层的突触体制备进行Seahorse呼吸测定，研究人员发现MND突触体中复合体IV驱动的氧消耗（由TMPD/抗坏血酸诱发且叠氮化物敏感）降低，而供体匹配的游离线粒体组分未显示组间差异，支持在该队列中可检测到的突触体富集组分中的复合体IV缺陷。通过为两种组分定义蛋白质与氧消耗率（OCR）的关系，研究人员提供了将这些测定应用于存档人队列的实用参数。这些数据共同表明，存档的冷冻保存人脑组织可支持信息丰富的突触体Ca²⁺和生物能量学读出，且突触体富集制备可能揭示MND中在供体匹配的批量线粒体分离物中不明显的疾病相关突触前表型。

本项发表于《Frontiers in Synaptic Neuroscience》的研究针对冷冻保存人脑组织能否用于功能性突触研究这一长期未解决的问题展开了系统性探索。研究人员建立了一套经过验证的工作流程，证明长期冷冻保存的人脑组织仍可产生具有功能的突触体，为利用存档样本研究神经退行性疾病提供了重要技术平台。

研究背景方面，突触末梢是神经系统中能量需求最高的区域之一，神经递质装载与释放、快速囊泡回收、离子梯度维持以及活动依赖性可塑性等过程共同构成了波动的三磷酸腺苷（ATP)负荷，这一负荷由突触前线粒体通过糖酵解和氧化磷酸化联合满足。与此同时，锚定于突触前活性区的线粒体必须缓冲由去极化和电压门控Ca²⁺通道（VGCC）开放所产生的大量快速Ca²⁺负荷。这种紧密的能量-Ca²⁺偶联使突触成为线粒体功能、氧化还原稳态或轴突运输受损时神经退行性疾病的早期敏感失败位点。运动神经元病（MND），最常见的临床表型为肌萎缩侧索硬化症（ALS)，以运动皮层上运动神经元和脑干、脊髓下运动神经元的进行性变性为特征。多项证据表明突触功能障碍和皮层过度兴奋性早期出现并可能驱动或加速下游运动系统损失。然而，关于这些机制的大部分知识来自转基因小鼠模型或诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元，这些模型虽极有价值，但无法完全重现终末期人运动皮层的细胞组成、年龄、区域特化和临终变量。直接对经神经病理学确认的MND人脑突触进行功能 interrogation 仍是未解决的问题。

为开展此项研究，研究人员使用了来自昆士兰脑库（Queensland Brain Bank, QBB）的冷冻保存人脑组织样本（储存约9-26年），包括11例经神经病理学确认的对照样本（7例女性，4例男性）和7例MND供体（6例男性，1例女性）的运动皮层及枕叶皮层样本。同时使用了C57BL/6野生型小鼠和hSOD1^G93A转基因小鼠的皮层组织作为模型验证。主要关键技术方法包括：基于等渗蔗糖密度梯度离心的突触体和游离线粒体亚细胞分离技术；透射电子显微镜（TEM）超微结构观察；液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组学分析；基于Fluorometric Imaging Plate Reader（FLIPR）的突触体Ca²⁺荧光测定技术，使用Calcium-4 No-wash染料监测去极化诱导的Ca²⁺内流；以及Seahorse XFe96分析仪的线粒体呼吸测定技术，采用顺序电子传递链（ETC）挑战方案（NADH→鱼藤酮/抗霉素A→TMPD/抗坏血酸→叠氮化钠）以解析复合体特异性氧消耗率（OCR），并利用Western blot进行组分纯度验证。

研究结果部分，"突触体从冷冻保存的人组织中分离后显示出与fresh和冷冻小鼠脑制备物相当的突触体超微结构特征"：通过TEM观察，fresh小鼠、冷冻小鼠和冷冻保存人脑来源的突触体均显示典型的突触体形态，包含突触囊泡（20-40 nm直径）和突触后致密结构，突触体直径和突触内线粒体直径无显著差异。蛋白质组学分析显示，fresh小鼠和冷冻保存人突触体均富集突触和细胞器相关基因本体论（GO）术语，核成分极少，共享蛋白富集于囊泡介导的突触运输、突触囊泡循环等生物学过程。

"冷冻保存人皮层突触体保留去极化诱导的Ca²⁺信号"：25 mM KCl可增加人突触体的相对荧光单位（RFU），该反应被CdCl₂（广谱高电压激活Ca²⁺通道阻断剂）减弱；无细胞外Ca²⁺或突触体变性后信号消失。KCl（5-100 mM）浓度依赖性增加Ca²⁺内流。藜芦碱（50 μM）通过电压门控Na⁺通道（Na⁺_V）产生显著升高的Ca²⁺反应，该反应被河豚毒素（TTX, 1 μM）显著抑制。选择性VGCC阻断剂（ω-Agatoxin IVA、ω-Conotoxin CVID、硝苯地平）均产生适度衰减效应。跨物种比较显示，冷冻小鼠突触体与fresh相当，而人组织来源者反应幅度较低。veratridine刺激后OCR有适度增加但未达显著性。

"来自MND受累运动皮层和hSOD1^G93A小鼠的突触体显示去极化诱导的Ca²⁺内流增加"：MND运动皮层突触体在30 mM KCl去极化后显示比对照组更大的Ca²⁺内流（AUC定量分析，p=0.0058），且该增强与PMI或储存年限无关。hSOD1^G93A小鼠皮层突触体同样表现出显著增强的去极化诱导Ca²⁺内流（30 mM KCl，p=0.0015），与人MND数据一致。

"MND运动皮层突触体富集组分中复合体IV相关呼吸选择性降低"：使用顺序ETC挑战方案，MND和对照突触体的NADH驱动OCR无差异，鱼藤酮/抗霉素A抑制活性相似，但TMPD/抗坏血酸驱动的复合体IV呼吸在MND中峰值反应更低，且叠氮化物敏感部分减少。来自同一供体的游离线粒体组分未显示MND与对照之间的复合体IV OCR差异，TOMM20蛋白水平证实线粒体含量相当，提示该缺陷为突触体特异性。

关于蛋白质负荷需求和OCR标度关系，突触体基线OCR和TMPD/抗坏血酸驱动OCR随蛋白质负荷轻度增加；游离线粒体约65 μg/孔即可达到近最大复合体IV驱动OCR。突触体蛋白含量与MitoTracker信号正相关，而线粒体组分无此相关性。PMI与游离线粒体基线OCR呈显著负相关（r=-0.86, p=0.026），但与复合体IV驱动OCR无显著关联。

讨论部分，研究人员指出冷冻保存和库藏的人中枢神经系统组织历来被认为兼容组织学和多种组学，但不依赖于膜完整性、Ca²⁺内流或呼吸链募集的测定。本研究挑战了这一观点，证明库藏人组织可产生具有预期超微结构和突触蛋白质组、显示稳健的药理学可处理去极化诱导Ca²⁺内流、并支持足以检测MND运动皮层疾病相关缺陷的复合体特异性OCR测量的突触体。该可行性在配对fresh和实验性冷冻小鼠皮层中进行了基准测试，随后应用于长达26年存档的人皮层组织。

关于存档人突触体的可行性和质量，研究人员指出早期研究虽证明冷冻人脑可产生突触体，但均一性、产量和活力尚未针对fresh、低PMI组织使用明确或匹配的冷冻保存方案进行严格基准测试。本研究通过使用相同等渗蔗糖方案冷冻保存小鼠皮层，并与最长26年存档的人组织进行比较，证实突触体超微结构、大小、线粒体含量和蛋白质组学显示冷冻保存人皮层突触体富集突触前后元件且核污染最小。去极化诱发稳健Ca²⁺内流，且与储存年限、供体年龄或PMI无显著关联。

关于MND中Ca²⁺内流的疾病相关夸大，对照皮层中枕叶与运动区域的去极化诱导Ca²⁺内流幅度或速率无差异。MND供体运动皮层突触体和fresh hSOD1^G93A小鼠皮层突触体均显示夸大的去极化诱导胞质Ca²⁺内流，这与皮层过度兴奋性、受损Ca²⁺缓冲、ALS/MND中突触前信号改变的证据趋同。先前工作进一步提示突变hSOD1驱动的突触前Ca²⁺失调并非仅由于活性区VGCC开放增强，而可能反映胞内储存（包括线粒体）Ca²⁺释放和缓冲异常。

关于突触体限制性复合体IV缺陷伴保留的游离线粒体呼吸，MND突触体显示复合体IV选择性减弱，而同一供体游离线粒体组分未检测到差异。这与远端ETC脆弱性和ALS受累区域复合体IV功能障碍的描述一致，包括散发性ALS中约46%复合体IV阴性肌纤维和约50%病例血液中低水平截断复合体IV线粒体DNA变异。大鼠中神经元复合体IV缺乏足以驱动ALS样病理，包括选择性α-运动神经元丢失、神经肌肉接头去神经支配、TDP-43错误定位和进行性瘫痪。

关于蛋白质-OCR标度和方法学考量，研究为两种组分定义了蛋白质-OCR关系，为未来筛选和多组学整合提供了实用参数。突触体中基线OCR和TMPD/抗坏血酸驱动OCR对蛋白质负荷呈浅正依赖，而游离线粒体OCR在高蛋白负荷时增加有限；约65 μg/孔足以达到近最大复合体IV驱动OCR。PMI与游离线粒体基线OCR显著负相关，但与复合体IV驱动OCR无显著关联，提示最大复合体IV驱动呼吸能力基本保留。

研究结论部分翻译如下：这些数据共同支持使用存档的人中枢神经系统组织生成适合功能性表型分析的突触体富集组分，保留去极化诱导的Ca²⁺内流并实现复合体解析的呼吸测量，从而揭示疾病相关变化。与多组学数据集整合后，该方法可能实现对存档人脑组织中突触前功能更具可扩展性和机制性的分析。总之，本研究证明冷冻保存的人脑组织可支持突触功能测定，为检测MND及其他线粒体功能改变疾病中的突触前表型提供了实用平台。