TDP-43CTD凝聚体成熟过程中β-折叠发展的动力学与空间分布

《ACS Chemical Neuroscience》：Kinetics and Spatial Distribution of β-Sheet Development in TDP-43CTD Condensate Maturation

　　

TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）的胞质聚集物是肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTLD）等神经退行性疾病的标志。一个主流假说认为，TDP-43凝聚体在成熟过程中经历液-固相变，涉及富含β-折叠的淀粉样样聚集物的形成。为验证此假说，研究人员试图通过拉曼光谱（Raman spectroscopy）研究单个凝聚体内蛋白质二级结构的时间和空间演化。研究人员在生理溶液条件下，于单凝聚体水平测量了TDP-43 C端结构域（TDP-43CTD）的体外β-折叠发展情况。所有凝聚体均表现出无序态向β-折叠转化的表观单指数动力学（k = 1.6 × 10–5s–1），这由酰胺-I（amide-I）强度增加和酰胺-III（amide-III）带向低能方向移动指示。有趣的是，水弯曲-转动带（water bend-libration band）表现出较慢的速率（k = 4.0 × 10–6s–1），表明水环境的变化滞后于蛋白质构象重排。此外，拉曼图谱（Raman maps）显示蛋白质密度在凝聚体中心附近最高，而β-折叠含量在凝聚体内部大多均匀分布。β-折叠含量与蛋白质密度的空间分布之间的意外差异，对典型的浓度依赖性蛋白质聚集模型提出了挑战。重要的是，研究人员捕获了罕见事件，即凝聚体表现出空间非对称的β-折叠发展，揭示了整体测量无法检测到的局部结构异质性。总之，这些结果深入揭示了TDP-43CTD凝聚体内蛋白质结构的时间和空间动力学，并证明了拉曼光谱成像（RSI）在追踪凝聚体成熟方面的实用性。

研究背景与意义：

TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）的胞质包含体是肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTLD）的病理标志。尽管传统上被视为无定形，但近期冷冻电镜研究在患者样本中发现了TDP-43淀粉样纤维，且其C端结构域（CTD， residues 274–414）是聚集的核心区域。TDP-43参与生物分子凝聚体（如应激颗粒，Stress Granules, SGs）的形成，其机制为液液相分离（LLPS），创造局部高浓度环境，被认为是淀粉样聚集的起始位点。然而，目前对于凝聚体成熟过程中，从无序到β-折叠的二级结构转变的本质和环境缺乏细致了解，现有生物物理技术多依赖整体平均，无法区分单个凝聚体的行为或直接报告水环境中的二级结构变化。因此，研究人员开展了此项研究，利用拉曼显微光谱（Raman microspectroscopy）在单凝聚体水平、水相环境下直接探测TDP-43_CTD凝聚体老化过程中的二级结构时间与空间动力学。该研究揭示了β-折叠形成并不单纯由局部蛋白质浓度驱动，且水动力学与构象变化不同步，并捕获了罕见的局部结构异质性事件，为相分离与病理聚集之间的联系提供了新见解。该论文发表在《ACS Chemical Neuroscience》。

主要关键技术方法：

研究人员表达了并纯化了TDP-43_CTD（residues 274–414），通过盐跳跃法（加入10×缓冲液至终浓度10 mM NaPi, 200 mM NaCl, pH 7.4）在体外诱导液液相分离（LLPS）形成凝聚体。使用自建的倒置拉曼显微镜（home-built inverted Raman microscope，514 nm激发）进行单凝聚体随时间追踪及拉曼光谱成像（RSI，步长1 μm）以绘制蛋白质密度（C–H变形）、β-折叠含量（酰胺-I强度）、三级结构（酰胺-III加权均值频率）和水环境（水弯曲-转动带光谱方差）的空间分布图。通过荧光漂白恢复（FRAP）实验验证凝聚体流变性变化（液态到固态），并使用硫黄素T（ThT）荧光成像 corroborate淀粉样结构存在。

研究结果：

追踪单个TDP-43_CTD凝聚体 via 拉曼光谱：

研究人员利用倒置拉曼显微镜在1小时至38小时内追踪单个凝聚体。DIC成像显示早期凝聚体为对称液滴，可发生融合，晚期形状不再改变；FRAP实验证实早期液滴高度流体（约1分钟恢复），晚期硬化（minimal recovery）。拉曼光谱显示，早期（1 h）酰胺-I带宽且暗示无序构象，老化至38 h后酰胺-I峰尖锐化（最大~1669 cm^–1）且酰胺-III带红移，指示β-折叠结构发展，ThT荧光时间进程进一步证实了淀粉样样结构。

β-折叠发展的动力学：

研究人员通过酰胺-I带强度（1669 cm^–1）和酰胺-III带加权均值频率（first moment, m₁，1220–1291 cm^–1）量化动力学。对43个凝聚体（两组独立实验）的分析表明，两者均符合单指数函数，速率常数相似（k = 1.6 × 10^–5s^–1），暗示存在限速构象转变步骤，不同于经典的成核-聚合模型的S型曲线。

凝聚体中蛋白质密度与β-折叠含量的拉曼图谱：

研究人员在不同时间点（1, 6, 13, 22, 38 h）采集拉曼图谱。蛋白质密度图（C–H变形积分面积）呈径向对称，中心最高向外递减；而归一化的β-折叠含量（酰胺-I强度）和三级结构（酰胺-III m₁）图在液滴内部大多均匀分布，仅在6 h起边缘可见热点/变化。这表明凝聚体内β-折叠形成并非仅由局部蛋白质浓度驱动，而是凝聚体整体环境影响构象重排。

凝聚体内水的演化：

研究人员利用水弯曲-转动带（1900–2450 cm^–1）的光谱方差（second moment, m₂，反映水群体异质性和局部环境差异）生成水图。水图显示中心光谱方差较大，随老化向外扩散，动力学速率（k = 4.0 × 10^–6s^–1）慢于二级结构变化，表明水环境变化滞后于蛋白质构象重排，溶剂动力学并非严格同步，水贡献单独不足以解释结构变化。

蛋白质聚集物的横截面视图：

研究人员对具有纤维样形态的转化中凝聚体进行了x-z平面切片拉曼成像。结果显示蛋白质密度位于盖玻片一侧的中心，而β-折叠含量在顶端（外周）更强烈，表明聚集物可能从非盖玻片接触区域延伸，且β-折叠分布不同于中心高密的蛋白质分布。

TDP-43_CTD凝聚体内的构象异质性：

研究人员观察到少数凝聚体存在不对称β-折叠分布（如23 h时左上象限边缘高，其余均匀）。至39 h，高β-折叠 content沿上边缘向中部扩散。选取不同区域（ROI 1和ROI 2）的平均光谱证实，ROI 1的酰胺-I带（1669 cm^–1）强度更高，且16小时内持续增加，而ROI 2无变化。这揭示了整体测量无法检测的局部β-折叠形成及随后的淀粉样传播事件，可能始于外周。

讨论与结论总结：

研究人员指出，单个蛋白质凝聚体的演化对于理解均相混合物中蛋白质命运决定因素至关重要，拉曼显微光谱能在空间上解析经历结构转化的凝聚体。DIC和RSI显示，老化过程中酰胺-I尖锐化和酰胺-III红移与β-折叠含量增加一致，归一化至C–H变形带可解耦浓度与构象变化。β-折叠发展的单指数动力学暗示液滴成熟中存在限速构象转变，而非典型淀粉样形成的成核-聚合长滞后期。空间图谱表明蛋白质密度中心高、边缘低，但β-折叠含量均匀分布，挑战了单纯浓度依赖聚集模型，支持凝聚体环境整体影响构象重排的观点，这与细胞应激颗粒研究观察一致。水弯曲-转动带方差的空间与时间异质性显示水环境变化滞后于二级结构，水与β-折叠含量无直接空间关联，暗示凝聚体环境是复杂景观，蛋白质动力学可能调制水环境。少数凝聚体转为淀粉样样纤维，其β-折叠分布异质且常始于外周，不支持纯粹由内部或表面引发的TDP-43_CTD聚集观念。与FUS的“核-壳”模型不同，此处所有老化凝聚体具有均匀β-折叠分布，纤维转化罕见且伴随外周局部富集。这些发现表明需要更多工作（如全长TDP-43、含RNA等）以阐明相分离成熟与淀粉样形成的关系。总之，拉曼显微光谱监测了TDP-43_CTD凝聚体分子变化，个体追踪显示凝聚体间动力学异质性小，地图显示β-折叠含量大多随机分布但与蛋白质密度图边缘差异，罕见的不对称β-折叠区域随时间传播类似淀粉样传播；单凝聚体空间分辨率研究能捕捉整体测量遗漏的聚集路径空间细微差别，证明拉曼显微光谱是表征生物分子凝聚体及其老化构象变化的宝贵工具。