《Brain, Behavior, & Immunity - Health》：Central nervous system resilience to cyclophosphamide: preserved behavior, astrocytes and LGALS3 expression in immunosuppressed mice
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背景：环磷酰胺（Cyclophosphamide, Cy）是实验研究中广泛应用的免疫抑制剂，但其对中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）功能及行为学的潜在影响，可能干扰神经免疫互作研究的结果解读与临床转化价值。目的：本研究旨在纵
背景：环磷酰胺（Cyclophosphamide, Cy）是实验研究中广泛应用的免疫抑制剂，但其对中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）功能及行为学的潜在影响，可能干扰神经免疫互作研究的结果解读与临床转化价值。目的：本研究旨在纵向表征小鼠经反复Cy诱导免疫抑制后的行为学结局及CNS相关分子与组织学改变。方法：成年雄性C57BL/6小鼠连续3或4周每周接受一次Cy（100 mg/kg）腹腔注射。外周免疫状态通过体重监测与白细胞分类计数评估；行为学采用SHIRPA量表、旷场实验（Open-Field Test）及悬尾实验（Tail Suspension Test, TST）进行纵向评价；CNS完整性通过组织病理学、胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP）免疫组化及脑组织Lgals3基因实时定量PCR（Quantitative PCR, qPCR）分析。结果：Cy给药导致体重增长持续受限，白细胞谱发生显著改变，证实免疫抑制成功建立。行为学评估仅观察到轻微且短暂的改变，主要涉及肌力下降与轻度病态行为。脑组织未检测到组织病理学异常或星形胶质细胞活化，各组GFAP免疫反应性无显著差异。无论3周或4周给药，免疫抑制小鼠脑内Lgals3基因表达均显著上调。结论：反复低剂量Cy给药可有效诱导外周免疫抑制，且不引起明显神经炎症或严重功能障碍，表明该实验条件下CNS具有较强稳态维持能力。Lgals3表达上调提示适应性神经免疫应答可能被激活，从而在系统性免疫失调期间维持CNS稳态。上述发现支持该免疫抑制方案可用于靶向CNS感染或神经免疫机制的研究，同时最大限度减少神经毒性混杂效应。
研究背景与意义
环磷酰胺（Cyclophosphamide, Cy）作为临床常用的烷化剂类免疫抑制剂，被广泛应用于自身免疫病治疗、器官移植排斥预防及肿瘤化疗中。在基础研究中，Cy诱导的免疫抑制模型常用于模拟宿主免疫功能低下状态，以探究病原体感染进程与宿主防御机制。然而，既往多项研究提示，Cy可能透过血脑屏障或直接作用于神经组织，诱发神经炎症、氧化应激反应及行为学异常，表现为焦虑样行为、抑郁样症状及运动能力下降。这些非特异性神经生物学改变，极易与感染本身引起的神经精神症状混淆，成为神经免疫研究中的重要混杂因素。因此，明确特定Cy给药方案是否对中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）产生实质性损伤，筛选兼具高效免疫抑制效应与低神经毒性的实验方案，对提升神经感染与神经免疫研究的可靠性具有重要科学价值。该研究由巴西圣保罗大学Epigenetic Study Center and Gene Regulation – CEEpiRG团队完成，发表于《Brain, Behavior, 》。
关键技术方法
研究人员选用40只3至4周龄无特定病原体（Specific Pathogen-Free, SPF）级雄性C57BL/6小鼠，随机分为对照组、假手术组（Sham）、Cy给药3周组（Cy_3）及Cy给药4周组（Cy_4）。为排除雌性激素周期波动对免疫与行为的干扰，研究仅纳入雄性动物。Cy给药方案参照已验证协议调整为每周单次腹腔注射100 mg/kg，以平衡免疫抑制强度与累积毒性。行为学评价采用标准化SHIRPA量表进行纵向运动、感觉与神经精神功能评分，结合旷场实验评估探索活动与病态行为，悬尾实验检测抑郁样行为。外周免疫状态通过外周血涂片白细胞分类计数与体重动态监测确认。脑组织完整性评估包括苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin, HE）染色病理学检查、胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP）免疫组化分析星形胶质细胞活化状态，以及实时荧光定量PCR（Quantitative PCR, qPCR）检测半乳糖凝集素3编码基因Lgals3的表达水平，内参基因为β-肌动蛋白（β-actin, Actb）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Gapdh）及18S核糖体RNA（18S）。
研究结果
3.1 免疫抑制表征及其对动物整体行为状态的影响
研究人员通过连续4周的体重监测发现，Cy给药组自第一周起体重增长即显著低于对照组与Sham组（p<0.0001），且差异持续至实验结束。外周血涂片分析显示，Cy处理3周后，淋巴细胞比例显著降低，中性粒细胞比例显著升高，镜下可见粒细胞占主导，偶见未成熟细胞与单核细胞，淋巴细胞数量明显减少，证实外周免疫抑制模型构建成功。
3.2 环磷酰胺诱导免疫抑制后的行为与分子参数表征
3.2.1 SHIRPA量表评估
纵向行为学监测显示，Cy组仅在第二周与第四周出现尾部抬起评分下降，反映轻微运动功能减退；钢丝悬挂实验评分在全周期内显著降低，提示肌力持续性下降；第四周角膜反射评分轻度降低。其余感觉、神经精神及自主神经功能参数在各组间均无统计学差异，表明Cy未引起广泛性神经行为障碍。
3.2.2 旷场实验
在给药3周与4周的时间点，Cy组仅表现出理毛时间显著缩短，其余指标（运动时间、直立次数、不动时间与频率）与对照组相比无显著差异。Cy_4组不动频率略高于对照组，但不动时间反而短于Cy_3组，提示随给药时间延长未出现进行性活动抑制。
3.2.3 悬尾实验
Cy_4组不动时间较对照组显著缩短，未观察到抑郁样行为的典型表现。组内比较显示，Cy_4组首次不动潜伏期长于Cy_3组，不动时间短于Cy_3组，但不动频率更高，整体模式不支持明确抑郁样表型，更符合轻度短暂病态行为反应。
3.2.4 CNS炎症反应的组化与分子表征
HE染色显示各组脑组织结构完整，无炎性细胞浸润或神经元损伤。GFAP免疫组化定量分析表明，Cy组与对照组、Sham组之间星形胶质细胞免疫反应性无显著差异，提示无显著星形胶质细胞活化。与之相反，qPCR结果显示，Cy_3组与Cy_4组脑内Lgals3基因表达均显著上调，提示该免疫调节分子可能参与了Cy暴露下的神经适应性反应。
讨论与结论
研究人员在讨论中指出，本研究采用的每周单次100 mg/kg Cy给药方案，成功诱导了以淋巴细胞减少为核心的外周免疫抑制，且未伴随中性粒细胞下降，反而出现中性粒细胞相对增多，这一模式可能与较低累积剂量及给药频率调整有关，反映了一种温和而持续的免疫抑制状态。行为学改变局限于肌力下降与轻微病态行为，未达到广泛神经功能障碍程度。尤为重要的是，尽管既往研究报道Cy可诱发神经炎症，本研究在组织学与分子水平上均未检测到GFAP表达升高，表明星形胶质细胞活化并非Cy暴露的必然结果，支持该方案下CNS具有较强稳态维持能力。Lgals3的上调可能是适应性神经免疫应答的一部分，通过调节小胶质细胞活性、细胞因子产生及组织修复过程，在系统性免疫压力下维持神经环境稳定。
结论部分明确：反复低剂量Cy给药可在成年C57BL/6小鼠中诱导明确且持续的外周免疫抑制，表现为体重增长受限与白细胞谱改变，但不引起神经炎症或严重功能障碍。行为学仅出现短暂肌力下降与轻度病态行为。脑组织无病理损伤，GFAP免疫反应性保持稳定。Lgals3基因表达上调可能代表了一种适应性神经免疫机制，有助于在系统性免疫失调期间维持CNS稳态。该免疫抑制方案可作为研究CNS感染与神经免疫互作的可靠模型，有效减少神经毒性混杂效应的干扰。
