基于天然低共熔溶剂（Natural Deep Eutectic Solvent, NADES）超声辅助微萃取结合高效液相色谱-二极管阵列检测测定煮制咖啡中氟虫腈及其降解产物的可持续实用方法开发

《Journal of Separation Science》：Development of a Sustainable and Practical Natural Deep Eutectic Solvent-based Ultrasound-assisted Microextraction Method for Determining Fipronil and Its Degradation Products in Brewed Coffee

　　

摘要：氟虫腈（fipronil）及其降解产物如氟虫腈硫化物（fipronil sulfide）和氟虫腈脱磺酰基物（fipronil desulfinyl）存在毒理学风险，需在煮制咖啡等复杂基质中进行可靠监测。研究人员旨在开发一种基于天然低共熔溶剂（Natural Deep Eutectic Solvent, NADES）的超声辅助液-液微萃取（Ultrasound-Assisted Liquid–Liquid Microextraction, UA-LLME）新方法，并结合高效液相色谱-二极管阵列检测（High-Performance Liquid Chromatography-Diode Array Detection, HPLC-DAD）测定煮制咖啡中上述化合物。经中心复合设计（Central Composite Design, CCD）优化的萃取参数为：样品体积4.2 mL、NADES萃取剂体积130 μL、萃取时间9.2 min。方法经验证，各分析物决定系数（R2）均大于0.9973，检出限（Limit of Detection, LOD）为4.5 μg L?1，定量限（Limit of Quantification, LOQ）为15.0 μg L?1。日内精密度（Intraday Precision）为6.1%–13.7%，日间精密度（Interday Precision）为12.1%–17.6%，准确度（相对回收率）为95.8%–109.3%。该方法溶剂消耗低、废物产生少且分析性能优异，为监测此类化合物提供了可持续替代方案。样品前处理可持续性指标（Sample Preparation Metric of Sustainability, SPMS）得分为8.11，蓝色适用性等级指数（Blue Applicability Grade Index, BAGI）得分为67.5，表明具有高可持续性与良好实用性。最终研究人员将该方法成功应用于巴西阿雷格里港市售7份煮制咖啡样品，证实其作为食品质量监测绿色工作流程的适用性。

论文解读：基于NADES-UA-LLME-HPLC-DAD测定煮制咖啡中氟虫腈及其降解产物的绿色分析方法

本研究由Natália Stram Bierhals、Emilly Santos de Castro、Sofia Aquino Monteiro、Vanusa Regina Lando及Josias Merib等研究人员完成，发表于《Journal of Separation Science》。咖啡是全球广泛消费的饮品，巴西为世界最大咖啡生产国。咖啡果蛀虫（Hypothenemus hampei）是咖啡种植主要害虫，氟虫腈（fipronil）常被用于防治。氟虫腈属C类致癌物，且在环境中可经还原、光解等生成氟虫腈硫化物（fipronil sulfide）和氟虫腈脱磺酰基物（fipronil desulfinyl），这些降解产物同样具有毒性甚至更强毒性。煮制咖啡含咖啡因、糖类、有机酸、酚类、色素及脂肪酸等复杂成分，传统前处理方法如QuEChERS或液固相萃取多用有毒有机溶剂、产生大量废液。现有微萃取技术结合低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvent, DES）——尤指由天然成分配制的天然低共熔溶剂（Natural Deep Eutic Solvent, NADES）——可提供低蒸气压、可调物性及潜在生物降解性的绿色替代方案。本研究首次将NADES与超声辅助液-液微萃取（Ultrasound-Assisted Liquid–Liquid Microextraction, UA-LLME）联用，建立HPLC-DAD测定煮制咖啡中氟虫腈及其两种降解产物的方法，并通过中心复合设计（Central Composite Design, CCD）优化，进行方法学验证及绿色度与实用性评价。

主要关键技术方法

研究人员筛选由薄荷醇（menthol）、百里酚（thymol）、樟脑（camphor）为氢键受体（Hydrogen Bond Acceptor, HBA）与辛酸（Octanoic Acid, OctA）为氢键供体（Hydrogen Bond Donor, HBD）按2:1摩尔比加热制备的NADES，选取萃取效率最优体系。以巴西阿雷格里港超市购得的烘焙研磨咖啡按10% (w/v) 制备煮制咖啡，经1% (w/v) 伯胺/仲胺吸附剂（Primary-Secondary Amine, PSA）净化后取4.2 mL加入130 μL NADES，涡旋2 min后超声9.2 min，上层经少量PSA和乙腈净化后取20 μL进样HPLC-DAD（C₁₈柱，梯度洗脱水-乙腈，柱温30°C）。采用CCD优化样品体积、NADES体积及超声时间；按AOAC国际指南验证线性、LOD、LOQ、精密度与回收率；以样品前处理可持续性指标（Sample Preparation Metric of Sustainability, SPMS）和蓝色适用性等级指数（Blue Applicability Grade Index, BAGI）评估绿色度与实用性；最终分析7份市售煮制咖啡样品。

3 结果与讨论（Results and Discussion）

3.1 溶剂选择与实验条件优化（Solvent Selection and Optimization of the Experimental Approach）

研究人员通过预实验比较不同NADES的色谱本底、稳定性及萃取效率，确定薄荷醇-辛酸（menthol:OctA = 2:1 mol/mol）NADES萃取效果最佳且色谱干扰最小。经傅里叶变换红外光谱（Fourier-Transform Infrared Spectroscopy, FTIR）观察到O—H伸缩振动从~3350 cm^?1移至~3200 cm^?1、C=O伸缩振动从~1710–1720 cm^?1移至~1700 cm^?1，差示扫描量热法（Differential Scanning Calorimetry, DSC）显示熔点低于单一组分，证实氢键网络形成及低共熔体系生成。采用CCD对NADES体积、样品体积、超声时间三因素优化，以三分析物色谱峰面积几何均值为响应，获得最优条件为样品体积4.2 mL、NADES体积130 μL、超声时间9.2 min；二次模型显著（R²= 0.8234）且无失拟。

3.2 分析参数与实样分析（Analytical Parameters of Merit and Analysis of Real Samples）

在优化条件下建立校准曲线（15–500 μg L^?1，n=5，三平行），因异方差性分别采用1/x²或1/y加权。三分析物R²> 0.9973，LOD = 4.5 μg L^?1，LOQ = 15.0 μg L^?1。在LOQ、100 μg L^?1、500 μg L^?1三个加标水平下，氟虫腈、氟虫腈脱磺酰基物、氟虫腈硫化物的相对回收率为95.9%–109.3%；日内相对标准偏差（Relative Standard Deviation, RSD）为6.1%–13.7%，日间RSD为12.1%–17.6%。7份市售煮制咖啡样品均未检出目标物，方法适用性通过加标实验确认。与文献报道的水、蛋、乳等基质中氟虫腈检测方法相比，本法仅需130 μL NADES及<5.0 mL样品，LOQ（15 μg L^?1）与欧盟氟虫腈最大残留限量（Maximum Residue Limit, MRL = 5 μg kg^?1）同数量级，适用于筛查监测。

3.3 绿色度与实用性评价（Greenness and Practicality Evaluation）

采用SPMS评估可持续性，满分10分，本研究得分为8.11——样品体积小、使用"可替代生物降解"NADES溶剂获绿色评级。采用BAGI评估实用性，满分100分、≥60分视为具实用性，本研究得分为67.5——优势为样品量少、废液少，局限为手动操作限制通量。综合评价方法在可持续性与实用性间取得良好平衡。

讨论与结论总结

研究人员首次建立了NADES-UA-LLME-HPLC-DAD测定煮制咖啡中氟虫腈、氟虫腈硫化物及氟虫腈脱磺酰基物的方法。NADES按menthol:OctA = 2:1摩尔比55°C水浴简易制备，稳定保存≥3个月。优化后参数为样品4.2 mL、NADES 130 μL、超声9.2 min（含涡旋2 min）。方法线性范围15–500 μg L^?1，R²> 0.9973，LOD 4.5 μg L^?1，LOQ 15.0 μg L^?1，加标回收率95.9%–109.3%，日内RSD 6.1%–13.7%，日间RSD 12.1%–17.6%。SPMS = 8.11，BAGI = 67.5，证实高可持续性与良好实用性。7份巴西市售煮制咖啡未检出目标物。该法简便、低成本、分析性能满意，符合绿色分析化学原则，为复杂食品基质中农药及其代谢物监测提供绿色替代方案。局限性为手动步骤限制通量及NADES未实现回用；未来可通过多位点并行搅拌、膜固定化NADES及质谱检测提升灵敏度与通量，并可拓展至咖啡豆及咖啡粉基质，探讨NADES回用性。