通过多光谱技术和计算机模拟，探究人工合成食用色素与消化蛋白酶之间的相互作用机制

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Explore the interaction mechanism between artificial synthetic food colorants and digestive proteases via multi-spectral technology and computer simulation

　　

Ruofei Du|Jian Gao

应用化学，中德科技学院，青岛科技大学，青岛 266042，中国

摘要

本研究利用多种光谱技术和计算机模拟方法系统地探讨了三种合成食用色素（阿洛拉红、酒石黄和亮蓝）与胰蛋白酶和胃蛋白酶之间的相互作用机制。结果表明，这三种食用色素通过中等强度的非共价作用（主要是疏水力和氢键）形成1:1的复合物。酒石黄与胰蛋白酶的结合亲和力更强，而阿洛拉红与胃蛋白酶的结合亲和力更强。酒石黄与胰蛋白酶的结合能力大于其与胃蛋白酶的结合能力，其他两种食用色素的情况则相反。所有色素均导致胰蛋白酶/胃蛋白酶肽链的部分展开，α-螺旋、β-转角和无规卷曲的含量减少，β-折叠的含量增加。计算机模拟结果显示，这三种食用色素均结合在胰蛋白酶的催化活性口袋附近，尤其是阿洛拉红。酒石黄的结合区域覆盖了胃蛋白酶的催化核心和底物结合口袋。在模拟过程中，酒石黄与胰蛋白酶/胃蛋白酶形成的复合物最不稳定。酒石黄降低了胰蛋白酶的溶剂可及表面积（SASA）并降低了胃蛋白酶的结构紧凑性。其他所有系统则导致结构紧凑性增加和SASA增加。这些发现表明，阿洛拉红和酒石黄的潜在健康风险可能需要更多关注，尤其是酒石黄。本研究为食品安全评估和配方优化提供了关键见解，强调了制定更科学的合成色素使用食品安全标准的必要性。

引言

食品添加剂在现代食品工业中发挥着重要作用。它们可以改善产品质量、延长保质期、优化感官特性，并满足消费者对多样化和高质量食品的需求。因此，食品添加剂的应用范围正在逐渐扩大，已成为现代食品工业不可或缺的一部分[1]。然而，随着公众健康意识的不断提高以及食品安全事件的频繁发生，消费者对食品添加剂的安全性越来越持怀疑态度，并担心它们可能对人类健康造成的潜在风险[2]。食品色素是食品工业中最重要的添加剂之一。它们用于弥补食品加工过程中失去的颜色，增强风味感知，或改善食品的外观，使其更具吸引力[3]、[4]。它们广泛应用于糖果、零食、饮料、烘焙食品、乳制品、酱料和肉制品等加工食品领域。食品色素通常分为天然色素和人工色素。与天然色素相比，人工合成的食品色素（AFCs）因其强着色能力、高稳定性、鲜艳的颜色、广泛的色调范围、生产过程中的均匀性和可重复性、较低的微生物污染以及低成本等优点而受到行业的青睐，并在食品工业中得到广泛应用[5]、[6]、[7]、[8]。然而，现有研究表明，AFCs及其降解产物常常会引起一些不良健康效应，如瘙痒、荨麻疹等急性反应、过敏反应、超敏反应和不耐受反应，并且可能与某些慢性疾病（如癌症、基因毒性（染色体损伤）、心血管疾病、代谢紊乱、行为障碍、精神和心理疾病以及中枢神经系统疾病）有关。儿童群体的特殊风险主要体现在AFCs暴露与注意力缺陷多动障碍（ADHD）等行为问题之间的关联[9]、[10]、[11]、[12]。

这些风险的本质源于AFCs与人体生物大分子之间的异常相互作用。因此，解析AFCs与蛋白质之间的相互作用机制已成为评估AFCs安全性的分子基础。关于AFCs与蛋白质之间相互作用机制的数据已经积累了很多。所使用的蛋白质模型主要是循环系统蛋白质，包括人血清白蛋白（HSA）[8]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、牛血清白蛋白（BSA）[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、血红蛋白[32]、[33]和碳酸酐酶II[34]。此外，一些文献中使用的蛋白质模型还包括α-乳白蛋白[35]、β-乳球蛋白[6]、[36]和溶菌酶[37]、[38]、[39]。

需要注意的是，口服摄入的AFCs需要在消化道内被消化蛋白酶水解后才能进入血液循环并与血浆蛋白相互作用。然而，目前关于AFCs与消化蛋白酶之间相互作用机制的研究较少。报道的研究系统包括日落黄/阿洛拉红-胃蛋白酶[40]、[41]、Ponceau 4R/喹啉黄/日落黄-胰蛋白酶[42]、[43]、[44]、酒石黄-α-胰凝乳蛋白酶[45]。

因此，“口服摄入→胃肠道暴露”途径的机制仍不清楚。本研究采用了多种光谱技术（如荧光光谱、紫外-可见吸收光谱和圆二色光谱），结合计算方法（如分子对接和分子动力学模拟），全面系统地探讨了包括阿洛拉红、酒石黄和亮蓝（图S1）在内的广泛使用的合成食用色素与消化酶（胰蛋白酶和胃蛋白酶）之间的相互作用机制。目的是为基于暴露途径制定AFCs的风险干预策略提供分子相互作用层面的关键证据。

章节片段

材料

胰蛋白酶、胃蛋白酶、阿洛拉红、酒石黄和亮蓝均购自上海阿拉丁生化科技有限公司（中国上海）。所有试剂和物质均按原样使用，未进行额外纯化处理。所有实验方案均使用超纯水。

稳态荧光测量

在pH值为7.40的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中制备了10 mL的胰蛋白酶储备溶液（浓度为5.0 × 10^?4 mol·L^?1）。同样，也制备了5 mL的阿洛拉红、酒石黄和

荧光猝灭机制

荧光光谱是研究配体与蛋白质相互作用的重要方法之一。最重要的原因是蛋白质含有芳香氨基酸（色氨酸Trp、酪氨酸Tyr和苯丙氨酸Phe）的内源性荧光团，尤其是Trp，因此无需添加任何外源性荧光标记。图1显示了胰蛋白酶/胃蛋白酶与阿洛拉红/酒石黄/亮蓝相互作用时的荧光发射光谱

结论

本研究利用多光谱技术和计算机模拟系统地研究了阿洛拉红、酒石黄和亮蓝与胃蛋白酶和胰蛋白酶之间的相互作用机制。结果表明，阿洛拉红、酒石黄和亮蓝主要通过疏水作用和氢键形成1:1的复合物，其结合强度适中。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了山东省自然科学基金（编号：ZR2025MS217）的支持。