《Frontiers in Immunology》：Multi-cohort transcriptomics integration for building and validating a diagnostic model of peripheral blood septic shock
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目的：整合多队列转录组、单细胞及实验数据，筛选脓毒性休克诊断特征基因，建立外周血分子诊断模型，阐明关键基因的m6A调控机制。方法：基于5个GEO外周血队列，经批次效应校正差异表达分析及加权基因共表达网络分析(WGCNA)，结合并行基因本体(GO)/疾病本体(D
目的：整合多队列转录组、单细胞及实验数据，筛选脓毒性休克诊断特征基因，建立外周血分子诊断模型，阐明关键基因的m6A调控机制。方法：基于5个GEO外周血队列，经批次效应校正差异表达分析及加权基因共表达网络分析(WGCNA)，结合并行基因本体(GO)/疾病本体(DO)富集分析筛选候选基因；通过蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络联合最小绝对收缩与选择算子(LASSO)、支持向量机递归特征消除(SVM-RFE)及随机森林算法筛选特征基因；构建5基因人工神经网络(ANN)诊断模型，并在GSE95233、GSE131761及临床队列中通过受试者工作特征(ROC)曲线及logistic回归验证。采用细胞类型识别算法(CIBERSORT)及GSE167363单细胞数据分析免疫细胞组成与特征基因在中性粒细胞中的表达；通过实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)、甲基化RNA免疫沉淀联合qPCR(MeRIP-qPCR)、RNA免疫沉淀联合qPCR(RIP-qPCR)及放线菌素D实验阐明METTL14/YTHDF1–S100A12 m6A轴机制；在盲肠结扎穿孔(CLP)小鼠模型中，通过体内递送siMETTL14评估肺损伤变化。结果：共鉴定76个脓毒性休克相关候选基因，富集于细菌防御通路；整合PPI与三种机器学习算法筛选出5个稳健候选基因（S100A12、MMP8、PGLYRP1、CEACAM8、MMP9）；所构建ANN在多队列中均获较高曲线下面积(AUC)，5基因在临床脓毒症患者外周血中mRNA及蛋白水平均显著升高；CIBERSORT及单细胞结果显示中性粒细胞显著扩增，5基因主要在中性粒细胞中富集且随病情恶化逐步升高；m6A相关实验证实METTL14通过YTHDF1识别介导S100A12 mRNA的m6A修饰并稳定其表达，敲低METTL14或YTHDF1均加速其降解；CLP小鼠体内沉默METTL14可降低肺组织损伤及脂质过氧化/铁死亡水平。结论：本研究建立了由5个中性粒细胞相关基因组成的脓毒性休克诊断特征谱及ANN模型，揭示了METTL14/YTHDF1介导的m6A-S100A12轴在中粒细胞中的作用，提示METTL14/m6A通路可作为潜在诊断与治疗靶点。
研究背景方面，脓毒性休克仍是重症监护病房（ICU）患者死亡的主要原因之一，尽管诊疗指南与支持治疗持续优化，现有临床标志物如乳酸、C反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）在早期诊断、风险分层及反映免疫失调本质上仍存局限，亟需更灵敏、特异的外周血分子生物标志物与诊断模型。近年多组学与单细胞研究揭示脓毒症中外周血免疫细胞谱系发生显著重塑，尤其是中性粒细胞数量与表型异常，与疾病严重程度及不良预后密切相关；其中S100A12、基质金属蛋白酶9（MMP9）等基因已被多项转录组与临床研究报道在脓毒性休克中升高，被视为潜在枢纽基因与诊断/预后标志物。同时，m6A等RNA表观遗传修饰被证实可调控免疫细胞功能与炎症反应，但其如何调控中性粒细胞内关键炎症基因的表达稳定性及对器官损伤的影响尚不明确。在此背景下，研究人员整合多队列外周血转录组数据，结合差异分析、WGCNA、PPI拓扑与多种机器学习方法，系统筛选脓毒性休克稳健特征基因，构建并验证人工神经网络诊断模型，从单细胞层面明确基因的细胞起源，并通过湿实验阐明METTL14/YTHDF1介导的m6A-S100A12轴机制，为脓毒性休克的早期诊断与靶向干预提供新的分子基础与潜在靶点，该研究成果发表于《Frontiers in Immunology》。
关键技术方法上，研究纳入7个GEO外周血微阵列队列，其中5个为训练集、2个为外部验证集，同时采用GSE167363单细胞转录组数据集；通过ComBat算法校正批次效应，采用差异表达分析与WGCNA筛选候选基因，并行GO/DO富集分析；基于STRING数据库构建PPI网络，联合LASSO、SVM-RFE、随机森林三种机器学习算法筛选特征基因；使用neuralnet包构建含5输入节点、单隐层5神经元、2输出节点的ANN诊断模型，在多队列中通过ROC曲线、logistic回归、校准分析、决策曲线分析（DCA）及列线图验证效能；采用CIBERSORT分析免疫细胞浸润，基于Seurat流程完成单细胞转录组质控、聚类与注释，分析5基因在不同免疫细胞及中性粒细胞亚群中的表达差异；通过qRT-PCR、Western blot、MeRIP-qPCR、RIP-qPCR、放线菌素D追踪实验，结合CLP小鼠体内siMETTL14干预，从细胞与动物层面阐明m6A调控机制。
研究结果部分，首先为脓毒性休克相关候选基因的鉴定：整合5个外周血微阵列队列，经批次校正后技术偏差得到有效控制，通过差异表达分析与WGCNA筛选，获得76个重叠候选基因，GO与DO富集显示其主要参与细菌防御通路，从功能与疾病层面支持其在脓毒性休克发生中的关键作用。其次为基于PPI网络拓扑与多种机器学习算法的关键诊断基因筛选：构建76个候选基因的PPI网络，通过cytoHubba插件的度（Degree）、边渗透分量（EPC）、最大团中心性（MCC）、最大邻域分量（MNC）四种拓扑算法获得8个枢纽基因；进一步联合LASSO、SVM-RFE、随机森林筛选，最终确定S100A12、MMP8、PGLYRP1、CEACAM8、MMP9五个稳健特征基因。第三为基于5个特征基因的ANN诊断模型构建与多队列验证：构建的ANN模型在合并GEO训练队列中表现出高AUC，5基因在训练队列、两个独立外部验证队列及65例健康对照与65例脓毒性休克患者的临床外周血队列中，mRNA与蛋白水平均显著升高，且多数基因在校正混杂因素后仍保持显著优势比（OR），校准曲线与DCA显示模型预测与实际观测一致性良好，具备临床应用潜力。第四为关键诊断特征基因相关信号通路的富集特征：按基因表达中位数分组行基因集富集分析（GSEA），结果显示CEACAM8高表达组富集于细胞周期、卵母细胞减数分裂等通路，MMP8与MMP9高表达组富集于黏着斑、白细胞跨内皮迁移等通路，PGLYRP1高表达组同时富集于先天免疫与代谢调控通路，S100A12高表达组富集于造血细胞谱系、氧化磷酸化等通路，共同提示5基因参与炎症放大、免疫细胞招募与代谢重塑等核心病理过程。第五为关键特征基因在单细胞水平的表达模式：CIBERSORT分析显示脓毒性休克患者中性粒细胞比例显著升高；单细胞转录组UMAP可视化显示健康对照、脓毒症存活者、脓毒症非存活者的免疫细胞组成存在差异，5基因主要在中性粒细胞中富集，且在存活与非存活组中表达均高于健康对照，随病情恶化呈升高趋势，明确了“中性粒细胞-特征基因轴”的核心地位。第六为METTL14/YTHDF1通过m6A修饰稳定中性粒细胞中S100A12 mRNA：m6A测序显示非存活组S100A12转录本上m6A富集峰更显著，临床样本中S100A12与METTL14、YTHDF1在中性粒细胞中表达正相关；体外敲低METTL14可降低S100A12蛋白水平、减少其mRNA的m6A富集并加速降解，敲低YTHDF1同样降低S100A12蛋白水平、减弱其与S100A12 mRNA的结合并加速降解，证实METTL14通过YTHDF1识别介导S100A12 mRNA的m6A修饰以维持其稳定性。第七为体内沉默METTL14减轻脓毒症相关肺损伤：CLP小鼠模型中注射siMETTL14可显著降低肺组织METTL14表达，DAPI/TUNEL免疫荧光显示肺组织细胞凋亡减少，4-羟基壬烯醛（4-HNE）与谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）免疫荧光显示脂质过氧化水平降低、铁死亡相关改变减轻，提示抑制METTL14可缓解脓毒症小鼠肺损伤。
讨论部分总结，研究首先指出当前脓毒性休克早期诊断面临生物异质性挑战，所构建的5基因ANN模型在多队列中表现稳定，具备作为外周血分子诊断工具的潜力。进一步阐释5基因并非冗余的中性粒细胞标志物，而是分别覆盖炎症放大、抗菌防御、中性粒细胞活化、组织损伤重塑等不同病理维度，形成互补的病理网络。免疫细胞分析明确中性粒细胞为核心效应细胞，机制研究揭示METTL14/YTHDF1–S100A12轴是维持中性粒细胞高炎状态的关键表观遗传调控通路。体内实验虽显示沉默METTL14可减轻肺损伤，但因S100A12无小鼠同源物且干预为全身性而非中性粒细胞特异性，需谨慎解读，未来需通过中性粒细胞条件性敲除模型明确直接因果关系。同时研究存在局限性：训练队列多为儿童人群、成人及真实世界队列不足，批次校正无法完全消除平台异质性，单细胞样本量较小，未系统解析其他m6A调控因子，且模型未纳入非感染性全身炎症反应综合征（SIRS）对照、未与传统标志物头对头比较，临床转化仍需更大规模、更多样化队列的前瞻性验证。
研究结论部分翻译为：本研究建立了以中性粒细胞为主导的脓毒性休克分子诊断特征谱，包含S100A12、MMP8、PGLYRP1、CEACAM8和MMP9五个基因，并开发了经多队列验证的人工神经网络诊断模型。在中性粒细胞内，METTL14介导的m6A修饰通过YTHDF1识别并稳定S100A12 mRNA，形成驱动S100A12过表达与肺损伤的关键表观遗传调控轴。这表明METTL14/m6A通路可作为脓毒症诊断与干预的潜在靶点。
