《Advanced Science》：Protein Disulfide Isomerase Disassembles TDP-43/G3BP1 Condensates and Antagonizes TDP-43 Pathological Aggregates
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跨反应DNA结合蛋白-43（TDP-43）的胞质错误定位与聚集是肌萎缩侧索硬化症（ALS）、额颞叶变性及伴TDP-43病理改变的阿尔茨海默病（AD-TDP）的共同病理特征，而具有分子伴侣活性的蛋白质二硫键异构酶（PDI）在调控TDP-43病理行为中的确切作用尚
跨反应DNA结合蛋白-43（TDP-43）的胞质错误定位与聚集是肌萎缩侧索硬化症（ALS）、额颞叶变性及伴TDP-43病理改变的阿尔茨海默病（AD-TDP）的共同病理特征，而具有分子伴侣活性的蛋白质二硫键异构酶（PDI）在调控TDP-43病理行为中的确切作用尚不明确。研究人员发现，野生型PDI通过其b′结构域与TDP-43特异性相互作用，显著抑制TDP-43的相分离，竞争性置换G3BP1以解组装TDP-43/G3BP1凝聚体，并进一步拮抗TDP-43的病理性错误定位、异常磷酸化及病理性聚集，从而缓解TDP-43聚集引起的线粒体损伤与神经元毒性，并抑制应激细胞中的UNC13A隐秘剪接。然而，在PDI异常形式存在的情况下，PDI丧失活性，含TDP-43的应激颗粒组装为淀粉样纤维，导致ALS与AD-TDP患者的线粒体损伤及神经元死亡。这些发现不仅为ALS、AD-TDP等神经退行性疾病中TDP-43的致病机制提供了新见解，还提出PDI作为潜在治疗靶点。
本研究由武汉大学梁毅团队发表于《Advanced Science》，聚焦TDP-43蛋白稳态失衡在神经退行性疾病中的作用机制。当前已知TDP-43胞质聚集是ALS、FTLD-TDP及部分AD的核心病理标志，但其调控机制尚未完全阐明。PDI作为内质网重要的分子伴侣和氧化还原酶，在神经退行性疾病中可发生S-亚硝基化修饰并易位至胞质，但其是否参与TDP-43的相分离调控仍不清楚。研究人员通过临床样本分析、细胞模型、体外生化重构及成像技术，系统揭示了野生型PDI通过b′结构域与TDP-43直接互作，抑制其液-液相分离，竞争性解离G3BP1以阻断应激颗粒向病理性聚集转化的分子机制，并证实PDI缺失或功能异常会促进TDP-43淀粉样纤维化及线粒体损伤。该研究首次阐明PDI在TDP-43蛋白病中的关键保护作用，为靶向相分离过程的神经退行性疾病干预提供了新思路。
关键技术方法包括：1）临床样本队列分析：收集2例ALS患者、6例AD-TDP患者及5例对照（含健康者、Castleman病及进行性核上性麻痹患者）脑切片进行免疫荧光染色；2）分子互作验证：采用免疫共沉淀（co-IP）、生物素pull-down及双分子荧光互补（BiFC）技术确证PDI与TDP-43的直接结合及结构域定位；3）体外相分离体系：重组表达TDP-43、PDI及G3BP1蛋白，通过浊度分析、荧光漂白恢复（FRAP）及共聚焦显微镜表征相分离动态；4）细胞功能实验：利用siRNA敲低、抑制剂处理及稳定过表达细胞系，结合透射电镜（TEM）、免疫金标记及sarkosyl不溶性蛋白分析评估病理表型。
研究结果如下：
2.1 TDP-43通过PDI的b′结构域直接互作
通过co-IP与BiFC证实氧化应激下TDP-43与PDI在胞质形成复合物，且该互作定位于应激颗粒。临床样本显示ALS与AD-TDP患者脑中胞质TDP-43与PDI共定位显著增加，而对照组无此现象。结构域作图表明b′结构域是互作必需区域。
2.2 野生型PDI延缓TDP-43相分离
体外实验显示TDP-43可形成液滴并发生液-固转变，而野生型PDI能选择性招募至TDP-43凝聚体并减小液滴面积、提高饱和浓度。FRAP实验表明PDI增强凝聚体流动性，抑制其固化。突变体dnPDI与S-亚硝基化PDI（SNO-PDI）无此效应。
2.3 TDP-43与G3BP1在ALS患者脑中共定位
免疫荧光显示ALS患者脑中胞质TDP-43与应激颗粒核心组分G3BP1显著共定位，而对照组无此现象。
2.4 野生型PDI阻断H2O2诱导的TDP-43胞质错误定位
在氧化应激下，野生型PDI过表达促进TDP-43核滞留，减少胞质积累，而dnPDI及b′结构域缺失突变体无此作用。
2.5 野生型PDI通过降低TDP-43与G3BP1互作解组装TDP-43/G3BP1凝聚体
co-IP与体外重构实验表明，野生型PDI竞争性置换G3BP1，减小TDP-43/G3BP1凝聚体面积并增强其流动性。PDI抑制剂或敲低则加剧凝聚体形成。
2.6 野生型PDI拮抗TDP-43病理性磷酸化与聚集
野生型PDI显著降低氧化应激诱导的TDP-43 Ser409/410磷酸化及sarkosyl不溶性聚集，并减少淀粉样纤维形成，而异常PDI无此效应。机制上，PDI通过抑制TTBK1转录上调而非直接去磷酸化发挥作用。
2.7 野生型PDI改善线粒体损伤与UNC13A隐秘剪接
透射电镜显示野生型PDI过表达缓解TDP-43稳定表达细胞中的线粒体空泡化，并抑制UNC13A隐秘外显子异常剪接，维持TDP-43生理功能。
讨论部分指出，本研究首次揭示PDI通过多重机制调控TDP-43蛋白稳态：在氧化应激下，野生型PDI与胞质TDP-43互作，抑制其相分离并解组装应激颗粒，从而阻断磷酸化、聚集及线粒体毒性；而PDI功能丧失则促进病理进程。该模型为理解相分离调控在神经退行性疾病中的作用提供了新视角，并提出激活内源性PDI表达作为潜在治疗策略。研究结论强调，野生型PDI通过b′结构域介导的互作拮抗TDP-43病理转化，为ALS及AD-TDP的干预提供了新靶点。
